Métode deteksi molekuler mibanda kamampuh pikeun ngahasilkeun asam nukléat dina jumlah anu ageung ngaliwatan amplifikasi jumlah renik anu kapanggih dina sampel. Sanaos ieu mangpaat pikeun ngamungkinkeun deteksi sénsitip, éta ogé ngenalkeun kamungkinan kontaminasi ngaliwatan panyebaran aerosol amplifikasi di lingkungan laboratorium. Nalika ngalaksanakeun ékspérimén, tindakan tiasa dilaksanakeun pikeun nyingkahan kontaminasi réagen, alat laboratorium sareng rohangan bangku, sabab kontaminasi sapertos kitu tiasa ngahasilkeun hasil positif palsu (atanapi négatif palsu).
Pikeun ngirangan kamungkinan kontaminasi, Praktik Laboratorium anu Saé kedah dilaksanakeun sepanjang waktos. Sacara khusus, tindakan pencegahan kedah dilaksanakeun ngeunaan hal-hal ieu:
1. Nanganan réagen
2. Organisasi rohangan kerja sareng peralatan
3. Saran panggunaan sareng beberesih pikeun rohangan molekul anu ditunjuk
4. Saran biologi molekuler umum
5. Kontrol internal
6. Bibliografi
1. Nanganan réagen
Sentrifugasi sakeudeung tabung réagen sateuacan dibuka pikeun nyingkahan generasi aerosol. Aliquot réagen pikeun nyingkahan sababaraha kali beku-cair sareng kontaminasi stok master. Label sareng tanggalkeun sadaya tabung réagen sareng réaksi kalayan jelas sareng simpen log nomer lot sareng bets réagen anu dianggo dina sadaya ékspérimén. Pipet sadaya réagen sareng sampel nganggo ujung filter. Sateuacan mésér, disarankeun pikeun mastikeun ka produsén yén ujung filter cocog sareng mérek pipet anu badé dianggo.
2. Organisasi rohangan kerja sareng peralatan
Rohangan gawé kudu diatur pikeun mastikeun yén aliran gawé lumangsung dina hiji arah, ti daérah anu bersih (pra-PCR) ka daérah anu kotor (pasca-PCR). Pancegahan umum ieu bakal ngabantosan ngirangan kamungkinan kontaminasi. Gaduh rohangan anu ditunjuk anu misah, atanapi sahenteuna daérah anu misah sacara fisik, pikeun: persiapan mastermix, ékstraksi asam nukléat sareng panambahan citakan DNA, amplifikasi sareng penanganan produk anu diamplifikasi, sareng analisis produk, contona éléktroforésis gél.
Dina sababaraha setélan, gaduh 4 rohangan anu misah téh hésé. Pilihan anu mungkin tapi kirang dipikahoyong nyaéta ngalakukeun persiapan mastermix di daérah panyimpenan, contona kabinet aliran laminar. Dina kasus amplifikasi PCR anu dihijikeun, persiapan mastermix pikeun réaksi babak kadua kedah disiapkeun di daérah 'bersih' pikeun persiapan mastermix, tapi inokulasi ku produk PCR primér kedah dilakukeun di rohangan amplifikasi, sareng upami tiasa di daérah panyimpenan khusus (contona kabinet aliran laminar).
Unggal rohangan/daérah peryogi sét pipet anu dilabélan kalawan jelas, ujung filter, rak tabung, vortex, centrifuge (upami aya), pulpen, réagen laboratorium generik, jas lab, sareng kotak sarung tangan anu bakal disimpen di tempat damel masing-masing. Leungeun kedah dikumbah sareng sarung tangan sareng jas lab diganti nalika ngalih antara daérah anu ditunjuk. Réagen sareng alat-alat henteu kedah dipindahkeun ti daérah anu kotor ka daérah anu bersih. Upami aya kasus anu ekstrim dimana réagen atanapi alat-alat kedah dipindahkeun ka tukang, éta kedah didekontaminasi heula ku 10% natrium hipoklorit, dituturkeun ku ngusap ku cai steril.
Catetan
Larutan natrium hipoklorit 10% kedah didamel seger unggal dinten. Nalika dianggo pikeun dekontaminasi, waktos kontak minimal 10 menit kedah diturutan.
Alternatipna, produk anu sayogi sacara komersil anu divalidasi salaku dekontaminasi permukaan anu ngancurkeun DNA tiasa dianggo upami rekomendasi kaamanan lokal henteu ngijinkeun panggunaan natrium hipoklorit atanapi upami natrium hipoklorit henteu cocog pikeun ngadékontaminasi bagian logam tina alat-alat.
Sacara idéal, staf kedah nurut kana étos alur kerja anu unidirectional sareng henteu angkat ti daérah kotor (pasca-PCR) deui ka daérah anu bersih (pra-PCR) dina dinten anu sami. Nanging, tiasa aya kaayaan dimana ieu teu tiasa dihindari. Nalika aya kaayaan sapertos kitu, staf kedah ati-ati ngumbah leungeun sacara saksama, ngagentos sarung tangan, nganggo jas lab anu ditunjuk sareng henteu ngenalkeun alat naon waé anu aranjeunna hoyong bawa ka luar ruangan deui, sapertos buku lab. Ukuran kontrol sapertos kitu kedah ditekenkeun dina pelatihan staf ngeunaan metode molekuler.
Saatos dianggo, rohangan bangku kedah dibersihkeun nganggo 10% natrium hipoklorit (dituturkeun ku cai steril pikeun miceun sésa pemutih), 70% étanol, atanapi dekontaminasi anu ngarusak DNA anu tos divalidasi sacara komersil. Sacara idéal, lampu ultra-violet (UV) kedah dipasang pikeun ngamungkinkeun dekontaminasi ku iradiasi. Nanging, panggunaan lampu UV kedah diwatesan ngan ukur di daérah damel anu katutup, sapertos kabinet kaamanan, pikeun ngawatesan paparan UV staf laboratorium. Mangga turutan pitunjuk produsén pikeun perawatan lampu UV, ventilasi sareng beberesih pikeun mastikeun yén lampu tetep efektif.
Upami nganggo étanol 70% tinimbang natrium hipoklorit, iradiasi nganggo sinar UV bakal diperyogikeun pikeun ngalengkepan dekontaminasi.
Ulah ngabersihkeun vortex sareng centrifuge nganggo natrium hipoklorit; sabalikna, usap ku 70% étanol teras kakeunaan sinar UV, atanapi anggo dekontaminasi anu ngancurkeun DNA komérsial. Pikeun tumpahan, parios ka produsén pikeun naséhat beberesih salajengna. Upami pitunjuk produsén ngijinkeun, pipet kedah disterilisasi sacara rutin nganggo autoklaf. Upami pipet henteu tiasa diautoklaf, cekap ngabersihkeunana nganggo 10% natrium hipoklorit (dituturkeun ku usap tuntas nganggo cai steril) atanapi nganggo dekontaminasi anu ngancurkeun DNA komérsial dituturkeun ku paparan UV.
Ngabersihkeun nganggo natrium hipoklorit anu persentasena luhur pamustunganana tiasa ngaruksak plastik sareng logam pipet upami dilakukeun sacara rutin; pariksa heula rekomendasi ti produsén. Sadaya alat kedah dikalibrasi sacara rutin numutkeun jadwal anu disarankeun ku produsén. Jalma anu ditunjuk kedah tanggung jawab pikeun mastikeun yén jadwal kalibrasi diturutan, log anu lengkep dijaga, sareng labél layanan ditampilkeun kalayan jelas dina alat.
3. Saran panggunaan sareng beberesih pikeun rohangan molekul anu ditunjuk
Pra-PCR: Persiapan aliquoting réagen / mastermix: Ieu kedah janten rohangan anu paling bersih anu dianggo pikeun persiapan ékspérimén molekuler sareng idéalna kedah janten kabinet aliran laminar anu ditunjuk anu dilengkepan ku lampu UV. Sampel, asam nukléat anu diekstrak, sareng produk PCR anu diamplifikasi henteu kedah diurus di daérah ieu. Réagen amplifikasi kedah disimpen dina freezer (atanapi kulkas, numutkeun rekomendasi produsén) dina rohangan anu sami anu ditunjuk, idéalna di gigireun kabinet aliran laminar atanapi daérah pra-PCR. Sarung tangan kedah diganti unggal waktos nalika lebet kana daérah pra-PCR atanapi kabinet aliran laminar.
Area pra-PCR atanapi kabinet aliran laminar kedah dibersihkeun sateuacan sareng saatos dianggo sapertos kieu: Lap sadaya barang dina kabinet, sapertos pipet, kotak tip, vortex, centrifuge, rak tabung, pulpen, jsb. ku 70% étanol atanapi dekontaminasi anu ngancurkeun DNA komérsial, teras antepkeun dugi ka garing. Dina kasus area kerja anu katutup, sapertos kabinet aliran laminar, paparkeun sungkup kana sinar UV salami 30 menit.
Catetan
Ulah nepikeun réagen ka sinar UV; pindahkeun kana lomari ngan sanggeus bersih. Upami ngalakukeun PCR transkripsi tibalik, éta ogé tiasa ngabantosan pikeun ngusap permukaan sareng alat-alat nganggo larutan anu ngarecah RNase nalika kontak. Ieu tiasa ngabantosan nyingkahan hasil négatif palsu tina degradasi énzim RNA. Saatos dekontaminasi sareng sateuacan nyiapkeun mastermix, sarung tangan kedah diganti sakali deui, teras lomari siap dianggo.
Pra-PCR: Ékstraksi asam nukléat/panambahan citakan:
Asam nukléat kedah diekstrak sareng diurus di daérah anu ditunjuk kadua, nganggo sét pipet, ujung filter, rak tabung, sarung tangan anyar, jas lab sareng peralatan sanésna anu misah. Daérah ieu ogé kanggo panambahan citakan, kontrol sareng garis tren kana tabung atanapi pelat mastermix. Pikeun nyingkahan kontaminasi sampel asam nukléat anu diekstrak anu nuju dianalisis, disarankeun pikeun ngagentos sarung tangan sateuacan ngokolakeun kontrol atanapi standar positif sareng nganggo sét pipet anu misah. Réagen PCR sareng produk anu diamplifikasi henteu kedah dipipet di daérah ieu. Sampel kedah disimpen dina kulkas atanapi freezer anu ditunjuk di daérah anu sami. Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun sapertos rohangan mastermix.
Pasca-PCR: Amplifikasi sareng penanganan produk anu diamplifikasi
Rohangan anu ditunjuk ieu kanggo prosés pasca-amplifikasi sareng kedah misah sacara fisik ti daérah pra-PCR. Biasana ngandung termosikler sareng platform waktos nyata, sareng idéalna kedah gaduh kabinet aliran laminar pikeun nambihan produk PCR babak 1 kana réaksi babak 2, upami PCR anu dihijikeun dilakukeun. Réagen PCR sareng asam nukléat anu diekstrak henteu kedah diurus di daérah ieu sabab résiko kontaminasi luhur. Daérah ieu kedah gaduh sarung tangan, jas lab, rak piring sareng tabung, pipet, ujung filter, tempat sampah sareng peralatan sanésna anu misah. Tabung kedah disentrifugasi sateuacan dibuka. Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun sapertos rohangan mastermix.
Pasca-PCR: Analisis produk
Rohangan ieu kanggo alat deteksi produk, sapertos tangki éléktroforésis gél, power pack, transilluminator UV sareng sistem dokumentasi gél. Daérah ieu kedah ngagaduhan sét sarung tangan, jas lab, rak piring sareng tabung, pipet, ujung filter, wadah sareng alat-alat sanésna anu misah. Teu aya réagen sanés anu tiasa dibawa ka daérah ieu, kecuali pewarna loading, spidol molekuler sareng gél agarose, sareng komponén buffer. Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun sapertos rohangan mastermix.
Catetan penting
Sacara idéal, rohangan pra-PCR teu kedah diasupan dina dinten anu sami upami padamelan parantos dilaksanakeun di rohangan pasca-PCR. Upami ieu teu tiasa dihindari pisan, pastikeun yén leungeun dikumbah heula sacara saksama sareng jas lab khusus dianggo di rohangan éta. Buku lab sareng dokumen teu kedah dibawa ka rohangan pra-PCR upami parantos dianggo di rohangan pasca-PCR; upami diperyogikeun, candak duplikat cetakan protokol/ID sampel, jsb.
4. Saran biologi molekuler umum
Anggo sarung tangan anu bébas bubuk pikeun nyingkahan halangan dina uji. Téhnik pipetting anu leres penting pisan pikeun ngirangan kontaminasi. Pipetting anu salah tiasa nyababkeun cipratan nalika ngaluarkeun cairan sareng nyiptakeun aerosol. Praktik anu saé pikeun pipetting anu leres tiasa dipendakan dina tautan ieu: Panduan Gilson pikeun pipetting, pidéo téknik pipetting Anachem, Tabung centrifuge sateuacan dibuka, sareng buka kalayan ati-ati pikeun nyingkahan cipratan. Tutup tabung langsung saatos dianggo pikeun nyingkahan asupna kontaminan.
Nalika ngalakukeun sababaraha réaksi, siapkeun hiji mastermix anu ngandung réagen umum (contona cai, dNTP, buffer, primer sareng énzim) pikeun ngaminimalkeun jumlah transfer réagen sareng ngirangan ancaman kontaminasi. Disarankeun pikeun nyetél mastermix dina és atanapi blok tiis. Panggunaan énzim Hot Start tiasa ngabantosan ngirangan produksi produk anu henteu spésifik. Lindungi réagen anu ngandung probe fluoresensi tina cahaya pikeun nyingkahan degradasi.
5. Kontrol internal
Kalebet kontrol positif sareng négatif anu dicirikeun kalayan saé sareng dikonfirmasi, sareng kontrol tanpa citakan dina sadaya réaksi, sareng garis tren titrasi multi-titik pikeun réaksi kuantitatif. Kontrol positif henteu kedah kuat teuing anu nyababkeun résiko kontaminasi. Kalebet kontrol ékstraksi positif sareng négatif nalika ngalaksanakeun ékstraksi asam nukléat.
Disarankeun pikeun masang parentah anu jelas di unggal daérah supados pangguna terang kana aturan paripolah. Laboratorium diagnostik anu ngadeteksi tingkat DNA atanapi RNA anu handap pisan dina sampel klinis panginten hoyong ngadopsi ukuran kaamanan tambahan ku cara ngagaduhan sistem penanganan hawa anu misah kalayan tekanan hawa anu rada positif di rohangan pra-PCR sareng tekanan hawa anu rada négatip di rohangan pasca-PCR.
Pamungkas, ngembangkeun rencana jaminan kualitas (QA) mangpaat pisan. Rencana sapertos kitu kedah ngawengku daptar stok master réagen sareng stok kerja, aturan pikeun nyimpen kit sareng réagen, pelaporan hasil kontrol, program pelatihan staf, algoritma ngungkulan masalah, sareng tindakan remedial nalika diperyogikeun.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Nyetél laboratorium qPCR. Dokumén pituduh pikeun nguji cai rékréasi nganggo metode qPCR USEPA 1611. Lansing- Michigan State University.
Kaséhatan Umum Inggris, NHS. Standar Inggris pikeun panalungtikan mikrobiologi: Praktik Laboratorium Anu Saé nalika ngalaksanakeun uji amplifikasi molekuler). Panduan Kualitas. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Nyetél laboratorium PCR. Protokol Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Pangropéa rutin centrifuge: beberesih, pangropéa sareng disinfeksi centrifuge, rotor sareng adaptor (Kertas bodas No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Praktik Laboratorium Klinis Anu Saé (GCLP) pikeun tés dumasar molekuler anu dianggo di laboratorium diagnostik, Dina: Akyar I, éditor. Spéktrum kontrol kualitas anu lega. Rijeka, Kroasia: Intech; 2011: 29–52.
Waktos posting: 16-Jul-2020
