Молекулярдык аныктоо ыкмалары үлгүлөрдө табылган издик сандагы заттарды күчөтүү аркылуу көп көлөмдөгү нуклеин кислотасын өндүрүү мүмкүнчүлүгүнө ээ. Бул сезгич аныктоону камсыз кылуу үчүн пайдалуу болгону менен, лабораториялык чөйрөдө күчөтүү аэрозолдорунун жайылышы аркылуу булгануу мүмкүнчүлүгүн да жаратат. Эксперименттерди жүргүзүүдө реагенттердин, лабораториялык жабдуулардын жана стенддик мейкиндиктин булганышына жол бербөө үчүн чараларды көрүүгө болот, анткени мындай булгануу жалган оң (же жалган терс) натыйжаларды бериши мүмкүн.
Булгануу ыктымалдыгын азайтууга жардам берүү үчүн, ар дайым жакшы лабораториялык практика колдонулушу керек. Тактап айтканда, төмөнкү пункттарга байланыштуу сактык чаралары көрүлүшү керек:
1. Реагенттерди иштетүү
2. Жумуш ордун жана жабдууларды уюштуруу
3. Белгиленген молекулярдык мейкиндикти колдонуу жана тазалоо боюнча кеңештер
4. Молекулярдык биология боюнча жалпы кеңештер
5. Ички көзөмөл
6. Библиография
1. Реагенттерди иштетүү
Аэрозольдордун пайда болушуна жол бербөө үчүн реагент түтүкчөлөрүн ачуудан мурун кыска убакытка центрифугалаңыз. Бир нече жолу тоңуп эритүүдөн жана негизги запастардын булганышынан качуу үчүн реагенттерди бирдей өлчөмдө колдонуңуз. Бардык реагенттерди жана реакция түтүкчөлөрүн так белгилеп, датасын коюңуз, ошондой эле бардык эксперименттерде колдонулган реагент партиясынын жана партия номерлеринин журналдарын жүргүзүңүз. Бардык реагенттерди жана үлгүлөрдү чыпка учтарын колдонуп пипетка менен сайыңыз. Сатып алардан мурун, чыпка учтары колдонула турган пипетканын брендине туура келерин өндүрүүчүдөн тактап алуу сунушталат.
2. Жумуш ордун жана жабдууларды уюштуруу
Жумуш орду жумуштун агымы бир багытта, таза жерлерден (ПЦРге чейинки) кир жерлерге (ПЦРден кийинки) чейин жүргүзүлүшүн камсыз кылуу үчүн уюштурулушу керек. Төмөнкү жалпы сактык чаралары булгануу мүмкүнчүлүгүн азайтууга жардам берет. Төмөнкүлөр үчүн өзүнчө бөлүнгөн бөлмөлөр же жок дегенде физикалык жактан бөлүнгөн жерлер болушу керек: мастер-микс даярдоо, нуклеин кислотасын экстракциялоо жана ДНК шаблонун кошуу, күчөтүлгөн продуктуну күчөтүү жана иштетүү, ошондой эле продуктуну талдоо, мисалы, гель электрофорези.
Айрым шарттарда 4 өзүнчө бөлмөнүн болушу кыйын. Мүмкүн болгон, бирок анчалык деле каалабаган вариант - мастер-миксти даярдоону кампалоочу аймакта, мисалы, ламинардык агым шкафында жүргүзүү. Ички ПЦР күчөтүү учурунда, экинчи раунд реакциясы үчүн мастер-миксти даярдоо мастер-миксти даярдоо үчүн "таза" аймакта даярдалышы керек, бирок негизги ПЦР продуктусу менен эмдөө күчөтүү бөлмөсүндө жана мүмкүн болсо, атайын кампалоочу аймакта (мисалы, ламинардык агым шкафында) жүргүзүлүшү керек.
Ар бир бөлмөгө/аймакка так белгиленген пипеткалардын, чыпка учтарынын, түтүк текчелеринин, вихрьдордун, центрифугалардын (эгер тиешелүү болсо), калемдердин, жалпы лабораториялык реагенттердин, лабораториялык халаттардын жана тиешелүү жумуш орундарында кала турган кол каптардын өзүнчө топтому керек. Белгиленген жерлердин ортосунда жылганда колдорду жууп, кол каптарды жана лабораториялык халаттарды алмаштыруу керек. Реагенттер менен жабдууларды кир жерден таза жерге жылдырууга болбойт. Эгерде реагентти же жабдууларды артка жылдыруу керек болгон өзгөчө кырдаал жаралса, аны алгач 10% натрий гипохлорити менен дезинфекциялап, андан кийин стерилдүү суу менен сүртүү керек.
Эскертүү
10% натрий гипохлоритинин эритмеси күн сайын жаңы даярдалышы керек. Дезинфекциялоо үчүн колдонулганда, байланыш убактысы кеминде 10 мүнөт болушу керек.
Же болбосо, эгерде жергиликтүү коопсуздук сунуштары натрий гипохлоритин колдонууга жол бербесе же натрий гипохлорити жабдуулардын металл бөлүктөрүн зыянсыздандыруу үчүн ылайыктуу болбосо, ДНКны жок кылуучу беттик деконтаминанттар катары тастыкталган коммерциялык жактан жеткиликтүү каражаттарды колдонсо болот.
Идеалында, кызматкерлер бир багыттуу жумуш агымынын этикасын сакташы керек жана ошол эле күнү кир жерлерден (ПТРден кийин) таза жерлерге (ПТРге чейинки) кайтпаш керек. Бирок, мындай учурлар сөзсүз болушу мүмкүн. Мындай учурлар болгондо, кызматкерлер колдорун жакшылап жууп, кол каптарын алмаштырып, атайын лабораториялык халатты кийип, бөлмөдөн алып чыккысы келген жабдууларды, мисалы, лабораториялык китептерди алып чыкпаш керек. Мындай көзөмөл чараларына кызматкерлерди молекулярдык методдор боюнча окутууда басым жасалышы керек.
Колдонулгандан кийин, столдун мейкиндиктерин 10% натрий гипохлорити (калдык агартуучу затты кетирүү үчүн стерилдүү суу менен), 70% этанол же коммерциялык жактан жеткиликтүү болгон ДНКны жок кылуучу дезактивациялоочу каражат менен тазалоо керек. Идеалында, нурлануу менен дезактивациялоо үчүн ультрафиолет (УК) лампаларын орнотуу керек. Бирок, лаборатория кызматкерлеринин УК нурлануусуна кабылуусун чектөө үчүн УК лампаларын колдонуу жабык жумушчу жайларда, мисалы, коопсуздук шкафтарында гана чектелиши керек. Лампалар натыйжалуу бойдон калышын камсыз кылуу үчүн, УК лампаларын күтүү, желдетүү жана тазалоо боюнча өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүн аткарыңыз.
Эгерде натрий гипохлоритинин ордуна 70% этанол колдонулса, дезактивацияны аягына чыгаруу үчүн ультрафиолет нуру менен нурландыруу керек болот.
Вортексти жана центрифуганы натрий гипохлорити менен тазалабаңыз; анын ордуна 70% этанол менен сүртүп, ультрафиолет нуруна тийгизиңиз же коммерциялык ДНКны жок кылуучу дезактивациялоочу каражатты колдонуңуз. Төгүлгөн заттар үчүн тазалоо боюнча кошумча кеңеш алуу үчүн өндүрүүчүгө кайрылыңыз. Эгерде өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрү уруксат берсе, пипеткаларды автоклав менен үзгүлтүксүз стерилдөө керек. Эгерде пипеткаларды автоклав менен тазалоого мүмкүн болбосо, аларды 10% натрий гипохлорити менен (андан кийин стерилдүү суу менен кылдат сүртүп) же коммерциялык ДНКны жок кылуучу дезактивациялоочу каражат менен, андан кийин ультрафиолет нуруна дуушар кылуу жетиштүү болушу керек.
Эгерде жогорку пайыздуу натрий гипохлорити менен тазалоо үзгүлтүксүз жүргүзүлсө, акыры пипеткалардын пластиктерине жана металлдарына зыян келтириши мүмкүн; алгач өндүрүүчүнүн сунуштарын текшериңиз. Бардык жабдуулар өндүрүүчү сунуштаган графикке ылайык үзгүлтүксүз калибрлениши керек. Калибрлөө графигинин сакталышын, деталдуу журналдардын жүргүзүлүшүн жана жабдууларда тейлөө этикеткаларынын так көрсөтүлүшүн камсыз кылуу үчүн дайындалган адам жооптуу болушу керек.
3. Белгиленген молекулярдык мейкиндикти колдонуу жана тазалоо боюнча кеңештер
ПТРге чейинки: Реагенттерди аликвотациялоо / мастер-микс даярдоо: Бул молекулярдык эксперименттерди даярдоо үчүн колдонулган бардык мейкиндиктердин ичинен эң тазасы болушу керек жана идеалдуу түрдө ультрафиолет нуру менен жабдылган атайын ламинардык агым шкафы болушу керек. Үлгүлөр, экстракцияланган нуклеин кислотасы жана күчөтүлгөн ПТР продуктулары бул аймакта колдонулбашы керек. Күчөтүүчү реагенттерди тоңдургучта (же өндүрүүчүнүн сунуштарына ылайык муздаткычта) ошол эле атайын мейкиндикте, идеалдуу түрдө ламинардык агым шкафынын же ПТРге чейинки аймактын жанында сактоо керек. ПТРге чейинки аймакка же ламинардык агым шкафына киргенде кол каптарды ар бир жолу алмаштыруу керек.
ПТРге чейинки аймакты же ламинардык агым шкафын колдонуудан мурун жана кийин төмөнкүдөй тазалоо керек: Шкафтагы бардык буюмдарды, мисалы, пипеткаларды, учтук кутучаларды, вортексти, центрифуганы, түтүк текчелерин, калемдерди ж.б. 70% этанол же коммерциялык ДНКны жок кылуучу деконтаминант менен сүртүп, кургатыңыз. Жабык жумушчу аймакта, мисалы, ламинардык агым шкафында, капотту 30 мүнөткө ультрафиолет нуруна коюңуз.
Эскертүү
Реагенттерди ультрафиолет нуруна дуушар кылбаңыз; аларды тазалангандан кийин гана шкафка салыңыз. Эгерде тескери транскрипциялык ПТР жүргүзүлүп жатса, беттерди жана жабдууларды тийгенде РНКларды ажыратуучу эритме менен сүртүү да пайдалуу болушу мүмкүн. Бул РНКнын ферменттик деградациясынан жалган терс натыйжаларды болтурбоого жардам берет. Дезинфекциялоодон кийин жана мастер-миксти даярдоодон мурун, кол каптарды дагы бир жолу алмаштыруу керек, андан кийин шкаф колдонууга даяр болот.
ПТРге чейинки ыкма: Нуклеин кислотасын экстракциялоо/шаблонду кошуу:
Нуклеин кислотасы экинчи белгиленген аймакта өзүнчө пипеткалардын, чыпка учтарынын, түтүк текчелеринин, жаңы кол каптардын, лабораториялык халаттардын жана башка жабдуулардын топтомун колдонуу менен бөлүнүп алынып, иштетилиши керек. Бул аймак ошондой эле мастер-микс түтүкчөлөрүнө же пластиналарына шаблондорду, башкаруу элементтерин жана тренд сызыктарын кошуу үчүн да арналган. Анализденип жаткан бөлүнүп алынган нуклеин кислотасынын үлгүлөрүнүн булганышына жол бербөө үчүн, оң контролдорду же стандарттарды иштетүүдөн мурун кол каптарды алмаштыруу жана өзүнчө пипеткаларды колдонуу сунушталат. ПЦР реагенттерин жана күчөтүлгөн продуктыларды бул аймакта пипетка менен сайууга болбойт. Үлгүлөр ошол эле аймактагы атайын муздаткычтарда же тоңдургучтарда сакталышы керек. Үлгү жумуш орду мастер-микс мейкиндиги сыяктуу эле тазаланышы керек.
ПТРден кийинки: күчөтүлгөн продуктуну күчөтүү жана иштетүү
Бул белгиленген мейкиндик күчөтүүдөн кийинки процесстер үчүн арналган жана ПТРге чейинки аймактардан физикалык жактан бөлүнүшү керек. Ал адатта термоциклерлер жана реалдуу убакыттагы платформаларды камтыйт жана идеалдуу түрдө, эгерде ички ПТР жүргүзүлүп жатса, 1-турдагы ПТР продуктуну 2-турдагы реакцияга кошуу үчүн ламинардык агым шкафы болушу керек. ПТР реагенттери жана экстракцияланган нуклеин кислотасы бул аймакта колдонулбашы керек, анткени булгануу коркунучу жогору. Бул аймакта өзүнчө кол каптар, лабораториялык халаттар, тарелка жана түтүк текчелери, пипеткалар, чыпка учтары, урналар жана башка жабдуулар болушу керек. Түтүктөрдү ачуудан мурун центрифугалоо керек. Үлгү жумуш орду мастер-микс мейкиндиги сыяктуу эле тазаланышы керек.
ПТРден кийинки: Продукцияны талдоо
Бул бөлмө продукцияны аныктоочу жабдуулар, мисалы, гель электрофорез бактары, кубат берүүчү блоктор, ультрафиолет трансиллюминатору жана гель документтештирүү системасы үчүн арналган. Бул аймакта кол каптардын, лабораториялык халаттардын, пластиналардын жана түтүктөрдүн текчелеринин, пипеткалардын, чыпка учтарынын, урналардын жана башка жабдуулардын өзүнчө топтомдору болушу керек. Бул аймакка жүктөөчү боёкту, молекулярдык маркерди жана агароз гелин, ошондой эле буфердик компоненттерди кошпогондо, башка реагенттерди алып кирүүгө болбойт. Үлгү алуу үчүн жумушчу мейкиндик мастер-микс мейкиндиги сыяктуу эле тазаланышы керек.
Маанилүү эскертүү
Идеалында, эгерде ПЦРден кийинки бөлмөлөрдө жумуш аткарылган болсо, ПЦРге чейинки бөлмөлөргө ошол эле күнү кирбеш керек. Эгерде мунун таптакыр кажети жок болсо, анда алгач колдорду жакшылап жууп, бөлмөлөргө атайын лабораториялык халаттар кийилгенин текшериңиз. Эгерде лабораториялык китептер жана кагаздар ПЦРден кийинки бөлмөлөрдө колдонулган болсо, аларды ПЦРге чейинки бөлмөлөргө алып кирбеш керек; зарыл болсо, протоколдордун/үлгүлөрдүн IDлеринин ж.б. көчүрмөлөрүн алып чыгыңыз.
4. Молекулярдык биология боюнча жалпы кеңештер
Анализдин ингибирлөөсүнө жол бербөө үчүн порошоксуз кол каптарды колдонуңуз. Туура пипеткалоо ыкмасы булганууну азайтуу үчүн абдан маанилүү. Туура эмес пипеткалоо суюктуктарды бергенде чачырап, аэрозолдордун пайда болушуна алып келиши мүмкүн. Туура пипеткалоо боюнча жакшы тажрыйбаларды төмөнкү шилтемелерден тапса болот: Гилсон пипеткалоо боюнча колдонмо, Анахем пипеткалоо ыкмасы боюнча видеолор, түтүктөрдү ачуудан мурун центрифугалаңыз жана чачырап кетпеши үчүн аларды этияттык менен ачыңыз. Булгоочу заттардын киришине жол бербөө үчүн түтүктөрдү колдонгондон кийин дароо жабыңыз.
Бир нече реакцияларды жүргүзүүдө, реагенттердин өтүшүнүн санын азайтуу жана булгануу коркунучун азайтуу үчүн жалпы реагенттерди (мисалы, суу, dNTP, буфер, праймерлер жана фермент) камтыган бир мастер-миксти даярдаңыз. Мастер-миксти музга же муздак блокко коюу сунушталат. Ысык старт ферментин колдонуу спецификалык эмес продуктулардын өндүрүшүн азайтууга жардам берет. Флуоресценттик зонддорду камтыган реагенттерди бузулуудан сактоо үчүн жарыктан коргоңуз.
5. Ички көзөмөл
Бардык реакцияларда шаблонсуз башкаруу жана сандык реакциялар үчүн көп чекиттүү титрленген тренд сызыгы менен бирге жакшы мүнөздөлгөн, тастыкталган оң жана терс контролдорду кошуңуз. Оң контрол булгануу коркунучун туудургандай күчтүү болбошу керек. Нуклеин кислотасын экстракциялоодо оң жана терс экстракция контролдорун кошуңуз.
Колдонуучулар жүрүм-турум эрежелерин билиши үчүн, ар бир аймакка так көрсөтмөлөрдү чаптоо сунушталат. Клиникалык үлгүлөрдө ДНКнын же РНКнын өтө төмөн деңгээлин аныктаган диагностикалык лабораториялар ПТРге чейинки бөлмөлөрдө аба басымы бир аз оң жана ПТРден кийинки бөлмөлөрдө аба басымы бир аз терс болгон өзүнчө аба иштетүү системаларын орнотуу сыяктуу кошумча коопсуздук чарасын кабыл алууну каалашы мүмкүн.
Акырында, сапатты камсыздоо (СК) планын иштеп чыгуу пайдалуу. Мындай планга реагенттердин негизги жана жумушчу запастарынын тизмеси, комплекттерди жана реагенттерди сактоо эрежелери, контролдоо жыйынтыктары жөнүндө отчет берүү, кызматкерлерди окутуу программалары, көйгөйлөрдү чечүү алгоритмдери жана зарыл болгон учурда оңдоочу аракеттер кириши керек.
6. Библиография
Аслан А, Кинзелман Ж, Дреелин Э, Ананьева Т, Лавандер Ж. 3-бөлүм: qPCR лабораториясын түзүү. USEPA qPCR ыкмасын колдонуп, эс алуу сууларын текшерүү боюнча көрсөтмө документ 1611. Лансинг - Мичиган мамлекеттик университети.
Англиянын Коомдук Саламаттыкты Сактоо кызматы, NHS. Микробиологиялык изилдөөлөр үчүн Улуу Британиянын стандарттары: Молекулярдык күчөтүү анализдерин жүргүзүүдө жакшы лабораториялык практика). Сапат боюнча көрсөтмө. 2013;4(4):1–15.
Миффлин Т. ПЦР лабораториясын түзүү. Колд-Спринг Харб протоколу. 2007;7.
Шредер С 2013. Центрифугаларды үзгүлтүксүз тейлөө: центрифугаларды, роторлорду жана адаптерлерди тазалоо, тейлөө жана дезинфекциялоо (Ак кагаз № 14). Гамбург: Эппендорф; 2013.
Виана Р.В., Уоллис К.Л. Диагностикалык лабораторияларда колдонулган молекулярдык негиздеги тесттер үчүн жакшы клиникалык лабораториялык практика (GCLP), Акяр И., редактор. Сапатты көзөмөлдөөнүн кеңири спектрлери. Риека, Хорватия: Intech; 2011: 29–52.
Жарыяланган убактысы: 2020-жылдын 16-июлу
