Los métodos de detección molecular permiten obtener grandes volúmenes de ácido nucleico mediante la amplificación de cantidades mínimas presentes en las muestras. Si bien esto facilita una detección sensible, también introduce la posibilidad de contaminación por la dispersión de aerosoles de amplificación en el laboratorio. Al realizar experimentos, se deben tomar medidas para evitar la contaminación de reactivos, equipos de laboratorio y el espacio de trabajo, ya que dicha contaminación puede generar resultados falsos positivos (o falsos negativos).
Para ayudar a reducir la probabilidad de contaminación, se deben aplicar las Buenas Prácticas de Laboratorio en todo momento. En concreto, se deben tomar precauciones con respecto a los siguientes puntos:
1. Manipulación de reactivos
2. Organización del espacio de trabajo y del equipo
3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado
4. Consejos generales sobre biología molecular
5. Controles internos
6. Bibliografía
1. Manipulación de reactivos
Centrifugue brevemente los tubos de reactivos antes de abrirlos para evitar la generación de aerosoles. Divida los reactivos en alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, así como la contaminación de las soluciones madre. Etiquete y feche claramente todos los tubos de reactivos y de reacción, y mantenga un registro de los números de lote y de partida de los reactivos utilizados en todos los experimentos. Pipetee todos los reactivos y muestras con puntas de filtro. Antes de la compra, es recomendable confirmar con el fabricante que las puntas de filtro sean compatibles con la marca de la pipeta que se va a utilizar.
2. Organización del espacio de trabajo y del equipo
El espacio de trabajo debe organizarse para asegurar que el flujo de trabajo se produzca en una sola dirección, desde las áreas limpias (pre-PCR) hasta las áreas sucias (post-PCR). Las siguientes precauciones generales ayudarán a reducir la posibilidad de contaminación. Disponer de salas designadas separadas, o al menos áreas físicamente separadas, para: la preparación de la mezcla maestra, la extracción de ácidos nucleicos y la adición de la plantilla de ADN, la amplificación y manipulación del producto amplificado, y el análisis del producto, por ejemplo, mediante electroforesis en gel.
En algunos casos, disponer de cuatro salas separadas resulta complicado. Una opción viable, aunque menos recomendable, es preparar la mezcla maestra en un área de contención, como una cabina de flujo laminar. En el caso de la amplificación por PCR anidada, la preparación de la mezcla maestra para la segunda ronda de reacción debe realizarse en el área "limpia" destinada a la preparación de la mezcla maestra, pero la inoculación con el producto de PCR primario debe llevarse a cabo en la sala de amplificación y, de ser posible, en un área de contención específica (como una cabina de flujo laminar).
Cada sala/área necesita un juego separado de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, agitadores, centrífugas (si corresponde), bolígrafos, reactivos de laboratorio genéricos, batas de laboratorio y cajas de guantes claramente etiquetados, que permanecerán en sus respectivas estaciones de trabajo. Es obligatorio lavarse las manos y cambiarse los guantes y las batas de laboratorio al pasar de una zona a otra. Los reactivos y el equipo no deben trasladarse de una zona sucia a una limpia. En caso extremo de que sea necesario trasladar un reactivo o equipo de vuelta a una zona limpia, primero debe descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10%, seguido de una limpieza con agua estéril.
Nota
La solución de hipoclorito de sodio al 10% debe prepararse diariamente. Cuando se utilice para la descontaminación, se debe respetar un tiempo de contacto mínimo de 10 minutos.
Como alternativa, se pueden utilizar productos disponibles comercialmente que estén validados como descontaminantes de superficies que destruyen el ADN, si las recomendaciones de seguridad locales no permiten el uso de hipoclorito de sodio o si este no es adecuado para descontaminar las partes metálicas del equipo.
Idealmente, el personal debería respetar el flujo de trabajo unidireccional y no pasar de áreas sucias (después de la PCR) a áreas limpias (antes de la PCR) el mismo día. Sin embargo, puede haber ocasiones en que esto sea inevitable. En tales casos, el personal debe lavarse bien las manos, cambiarse los guantes, usar la bata de laboratorio designada y no introducir ningún equipo que desee sacar de la sala, como los cuadernos de laboratorio. Estas medidas de control deben enfatizarse en la capacitación del personal sobre métodos moleculares.
Tras su uso, las superficies de trabajo deben limpiarse con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de agua estéril para eliminar los residuos de lejía), etanol al 70 % o un descontaminante comercial validado que destruya el ADN. Idealmente, se deberían instalar lámparas ultravioleta (UV) para permitir la descontaminación por irradiación. Sin embargo, el uso de lámparas UV debe limitarse a áreas de trabajo cerradas, como cabinas de seguridad, para restringir la exposición del personal del laboratorio a la radiación UV. Siga las instrucciones del fabricante para el cuidado, la ventilación y la limpieza de las lámparas UV a fin de garantizar su eficacia.
Si se utiliza etanol al 70% en lugar de hipoclorito de sodio, será necesaria la irradiación con luz ultravioleta para completar la descontaminación.
No limpie el vórtice ni la centrífuga con hipoclorito de sodio; en su lugar, límpielos con etanol al 70 % y expóngalos a luz ultravioleta, o utilice un descontaminante comercial que destruya el ADN. En caso de derrames, consulte al fabricante para obtener más información sobre la limpieza. Si las instrucciones del fabricante lo permiten, las pipetas deben esterilizarse periódicamente en autoclave. Si no es posible esterilizarlas en autoclave, bastará con limpiarlas con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de una limpieza a fondo con agua estéril) o con un descontaminante comercial que destruya el ADN, seguido de exposición a luz ultravioleta.
La limpieza con hipoclorito de sodio de alta concentración puede dañar las pipetas de plástico y metal si se realiza con regularidad; consulte primero las recomendaciones del fabricante. Todos los equipos deben calibrarse periódicamente según el programa recomendado por el fabricante. Una persona designada debe encargarse de garantizar que se cumpla el programa de calibración, se mantengan registros detallados y las etiquetas de servicio estén claramente visibles en los equipos.
3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado
Pre-PCR: Preparación de reactivos y mezcla maestra: Este debe ser el espacio más limpio de todos los utilizados para la preparación de experimentos moleculares e idealmente debería ser una cabina de flujo laminar equipada con luz UV. No se deben manipular muestras, ácidos nucleicos extraídos ni productos de PCR amplificados en esta área. Los reactivos de amplificación deben conservarse en un congelador (o refrigerador, según las recomendaciones del fabricante) en el mismo espacio designado, idealmente junto a la cabina de flujo laminar o el área de pre-PCR. Los guantes deben cambiarse cada vez que se entre en el área de pre-PCR o en la cabina de flujo laminar.
El área de pre-PCR o la cabina de flujo laminar deben limpiarse antes y después de su uso de la siguiente manera: Limpie todos los elementos de la cabina, como pipetas, cajas de puntas, vórtice, centrífuga, gradillas para tubos, bolígrafos, etc., con etanol al 70 % o un descontaminante comercial que destruya el ADN, y deje secar. En el caso de un área de trabajo cerrada, como una cabina de flujo laminar, exponga la campana a luz ultravioleta durante 30 minutos.
Nota
No exponga los reactivos a la luz ultravioleta; introdúzcalos en la cabina solo cuando esté limpia. Si realiza una PCR de transcripción inversa, también puede ser útil limpiar las superficies y el equipo con una solución que descomponga las ARNasas al contacto. Esto puede ayudar a evitar resultados falsos negativos debido a la degradación enzimática del ARN. Después de la descontaminación y antes de preparar la mezcla maestra, cámbiese los guantes una vez más y, entonces, la cabina estará lista para usar.
Pre-PCR: Extracción de ácido nucleico/adición de plantilla:
El ácido nucleico debe extraerse y manipularse en una segunda área designada, utilizando un juego independiente de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, guantes nuevos, batas de laboratorio y demás equipo. Esta área también se utiliza para añadir plantillas, controles y líneas de tendencia a los tubos o placas de la mezcla maestra. Para evitar la contaminación de las muestras de ácido nucleico extraídas que se están analizando, se recomienda cambiarse los guantes antes de manipular los controles positivos o los estándares y utilizar un juego independiente de pipetas. Los reactivos de PCR y los productos amplificados no deben pipetearse en esta área. Las muestras deben almacenarse en refrigeradores o congeladores designados en la misma área. El espacio de trabajo de las muestras debe limpiarse de la misma manera que el espacio de la mezcla maestra.
Post-PCR: Amplificación y manipulación del producto amplificado.
Este espacio designado está destinado a los procesos posteriores a la amplificación y debe estar físicamente separado de las áreas previas a la PCR. Generalmente contiene termocicladores y plataformas en tiempo real, e idealmente debería contar con una cabina de flujo laminar para agregar el producto de la PCR de la ronda 1 a la reacción de la ronda 2, si se realiza una PCR anidada. Los reactivos de PCR y el ácido nucleico extraído no deben manipularse en esta área, ya que el riesgo de contaminación es alto. Esta área debe contar con un juego separado de guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas de filtro, contenedores y demás equipo. Los tubos deben centrifugarse antes de abrirlos. El espacio de trabajo de muestras debe limpiarse de la misma manera que el espacio de la mezcla maestra.
Análisis del producto tras la PCR
Esta sala está destinada a equipos de detección de productos, como tanques de electroforesis en gel, fuentes de alimentación, transiluminador UV y el sistema de documentación de geles. Esta área debe contar con juegos separados de guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas de filtro, contenedores y demás equipo. No se permite introducir ningún otro reactivo en esta área, a excepción del colorante de carga, el marcador molecular, el gel de agarosa y los componentes del tampón. El área de trabajo de muestras debe limpiarse de la misma manera que el área de la mezcla maestra.
Nota importante
Lo ideal es no entrar en las salas de pre-PCR el mismo día si ya se ha trabajado en las salas de post-PCR. Si esto es completamente inevitable, asegúrese de lavarse bien las manos y de usar batas de laboratorio específicas dentro de las salas. No se deben llevar a las salas de pre-PCR los libros de laboratorio ni la documentación que se haya utilizado en las salas de post-PCR; si es necesario, lleve copias impresas de los protocolos, los identificadores de muestras, etc.
4. Consejos generales sobre biología molecular
Utilice guantes sin polvo para evitar la inhibición del ensayo. Una técnica de pipeteo correcta es fundamental para reducir la contaminación. Un pipeteo incorrecto puede provocar salpicaduras al dispensar líquidos y la formación de aerosoles. Puede encontrar buenas prácticas para un pipeteo correcto en los siguientes enlaces: Guía de pipeteo de Gilson, vídeos de técnicas de pipeteo de Anachem, Centrifugue los tubos antes de abrirlos y ábralos con cuidado para evitar salpicaduras. Cierre los tubos inmediatamente después de su uso para evitar la introducción de contaminantes.
Al realizar múltiples reacciones, prepare una mezcla maestra con reactivos comunes (por ejemplo, agua, dNTPs, tampón, cebadores y enzima) para minimizar la cantidad de transferencias de reactivos y reducir el riesgo de contaminación. Se recomienda mantener la mezcla maestra en hielo o en un bloque refrigerante. El uso de una enzima de arranque en caliente puede ayudar a reducir la producción de productos inespecíficos. Proteja los reactivos que contienen sondas fluorescentes de la luz para evitar su degradación.
5. Controles internos
Incluya controles positivos y negativos bien caracterizados y confirmados, junto con un control sin plantilla en todas las reacciones, y una curva de tendencia multipunto para las reacciones cuantitativas. El control positivo no debe ser tan fuerte que represente un riesgo de contaminación. Incluya controles de extracción positivos y negativos al realizar la extracción de ácidos nucleicos.
Se recomienda colocar instrucciones claras en cada una de las áreas para que los usuarios conozcan las normas de conducta. Los laboratorios de diagnóstico que detectan niveles muy bajos de ADN o ARN en muestras clínicas podrían considerar la medida de seguridad adicional de contar con sistemas de ventilación independientes, con una presión de aire ligeramente positiva en las salas previas a la PCR y una presión de aire ligeramente negativa en las salas posteriores a la PCR.
Por último, resulta útil elaborar un plan de garantía de calidad (GC). Dicho plan debe incluir listas de existencias maestras y de trabajo de reactivos, normas para el almacenamiento de kits y reactivos, informes de resultados de controles, programas de capacitación del personal, algoritmos para la resolución de problemas y medidas correctivas cuando sea necesario.
6. Bibliografía
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Viana RV, Wallis CL. Buenas prácticas de laboratorio clínico (BPLC) para pruebas moleculares utilizadas en laboratorios de diagnóstico. En: Akyar I, editor. Amplio espectro de control de calidad. Rijeka, Croacia: Intech; 2011: 29–52.
Fecha de publicación: 16 de julio de 2020
