Molekulyar aşkarlama metodları nümunələrdə tapılan iz miqdarlarının gücləndirilməsi yolu ilə çoxlu miqdarda nuklein turşusu istehsal etmək qabiliyyətinə malikdir. Bu, həssas aşkarlamanı təmin etmək üçün faydalı olsa da, laboratoriya mühitində gücləndirmə aerozollarının yayılması yolu ilə çirklənmə ehtimalını da artırır. Təcrübələr apararkən, reagentlərin, laboratoriya avadanlıqlarının və dəzgah sahəsinin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün tədbirlər görülə bilər, çünki bu cür çirklənmə yalançı müsbət (və ya yalançı mənfi) nəticələr verə bilər.
Çirklənmə ehtimalını azaltmaq üçün hər zaman Yaxşı Laboratoriya Təcrübəsi tətbiq olunmalıdır. Xüsusilə, aşağıdakı məqamlarla bağlı tədbirlər görülməlidir:
1. Reagentlərlə işləmə
2. İş sahəsinin və avadanlıqların təşkili
3. Təyin olunmuş molekulyar məkan üçün istifadə və təmizləmə tövsiyələri
4. Ümumi molekulyar biologiya məsləhətləri
5. Daxili nəzarət
6. Biblioqrafiya
1. Reagentlərlə işləmə
Aerosolların əmələ gəlməsinin qarşısını almaq üçün reagent borularını açmazdan əvvəl qısa müddətə santrifüj edin. Çoxsaylı donma-ərimə proseslərinin və əsas ehtiyatların çirklənməsinin qarşısını almaq üçün reagentlərin miqdarını bərabərləşdirin. Bütün reagent və reaksiya borularını aydın şəkildə etiketləyin və tarix qoyun, həmçinin bütün təcrübələrdə istifadə olunan reagent partiyası və partiya nömrələrinin qeydlərini aparın. Bütün reagentləri və nümunələri filtr ucluqlarından istifadə edərək pipetlə süzün. Satın almadan əvvəl istehsalçı ilə filtr ucluqlarının istifadə olunacaq pipet markasına uyğun olduğunu təsdiqləmək məsləhətdir.
2. İş sahəsinin və avadanlıqların təşkili
İş sahəsi iş axınının təmiz sahələrdən (PCR-dən əvvəl) çirkli sahələrə (PCR-dən sonra) bir istiqamətdə baş verməsini təmin etmək üçün təşkil edilməlidir. Aşağıdakı ümumi tədbirlər çirklənmə ehtimalını azaltmağa kömək edəcək. Ayrı otaqlar və ya ən azı fiziki olaraq ayrı sahələr olmalıdır: mastermix hazırlanması, nuklein turşusunun çıxarılması və DNT şablonunun əlavə edilməsi, gücləndirilmiş məhsulun gücləndirilməsi və işlənməsi, eləcə də məhsulun təhlili, məsələn, gel elektroforez.
Bəzi şəraitdə 4 ayrı otağın olması çətindir. Mümkün, lakin daha az arzuolunan bir seçim, master qarışığın hazırlanmasını saxlama sahəsində, məsələn, laminar axın kabinetində aparmaqdır. İçinə qoyulmuş PCR gücləndirilməsi halında, ikinci mərhələ reaksiyası üçün master qarışığın hazırlanması master qarışığın hazırlanması üçün "təmiz" sahədə hazırlanmalıdır, lakin əsas PCR məhsulu ilə peyvənd gücləndirmə otağında və mümkün olduqda xüsusi saxlama sahəsində (məsələn, laminar axın kabineti) aparılmalıdır.
Hər otaq/sahə üçün ayrıca aydın şəkildə etiketlənmiş pipetlər, filtr ucluqları, boru rəfləri, burulğanlar, santrifüjlər (əgər varsa), qələmlər, ümumi laboratoriya reagentləri, laboratoriya xalatları və müvafiq iş yerlərində qalacaq əlcək qutuları dəsti lazımdır. Təyin olunmuş sahələr arasında hərəkət edərkən əllər yuyulmalı və əlcəklər və laboratoriya xalatları dəyişdirilməlidir. Reagentlər və avadanlıqlar çirkli ərazidən təmiz əraziyə köçürülməməlidir. Reagent və ya avadanlıq parçasının geriyə daşınması lazım olduğu ekstremal hal yaranarsa, əvvəlcə 10% natrium hipoxlorit ilə dezinfeksiya edilməli, sonra isə steril su ilə silinməlidir.
Qeyd
10%-li natrium hipoxlorit məhlulu hər gün təzə hazırlanmalıdır. Dezinfeksiya üçün istifadə edildikdə, minimum 10 dəqiqəlik təmas müddətinə riayət edilməlidir.
Alternativ olaraq, yerli təhlükəsizlik tövsiyələri natrium hipoxloritin istifadəsinə icazə vermirsə və ya natrium hipoxlorit avadanlığın metal hissələrini dezinfeksiya etmək üçün uyğun deyilsə, DNT-ni məhv edən səth dekontaminantları kimi təsdiqlənmiş kommersiya məqsədli məhsullardan istifadə etmək olar.
İdeal olaraq, işçilər birtərəfli iş axını etosuna riayət etməli və eyni gündə çirkli sahələrdən (PCR-dən sonra) təmiz sahələrə (PCR-dən əvvəl) qayıtmamalıdırlar. Lakin bunun qaçılmaz olduğu hallar da ola bilər. Belə bir hal yarandıqda, işçilər əllərini yaxşıca yumalı, əlcəklərini dəyişdirməli, təyin olunmuş laboratoriya xalatından istifadə etməli və laboratoriya kitabları kimi otaqdan çıxarmaq istədikləri heç bir avadanlıqdan istifadə etməməlidirlər. Bu cür nəzarət tədbirləri işçilərin molekulyar metodlar üzrə təlimində vurğulanmalıdır.
İstifadədən sonra dəzgah boşluqları 10% natrium hipoxlorit (qalıq ağartıcını təmizləmək üçün steril su ilə), 70% etanol və ya kommersiya baxımından mövcud olan DNT-ni məhv edən dekontaminantla təmizlənməlidir. İdeal olaraq, şüalanma ilə dekontaminasiyanı təmin etmək üçün ultrabənövşəyi (UB) lampalar quraşdırılmalıdır. Lakin, laboratoriya işçilərinin UB şüalarına məruz qalmasını məhdudlaşdırmaq üçün UB lampalarının istifadəsi qapalı iş sahələri, məsələn, təhlükəsizlik şkafları ilə məhdudlaşdırılmalıdır. Lampaların effektiv qalmasını təmin etmək üçün UB lampasına qulluq, ventilyasiya və təmizləmə üçün istehsalçının təlimatlarına əməl edin.
Natrium hipoxlorit əvəzinə 70% etanol istifadə edilərsə, dekontaminasiyanı tamamlamaq üçün UB şüalanması tələb olunacaq.
Burulğanı və santrifüjü natrium hipoxloritlə təmizləməyin; bunun əvəzinə 70% etanol ilə silin və UB işığına məruz qoyun və ya ticari DNT-ni məhv edən dekontaminantdan istifadə edin. Tökülmələr üçün əlavə təmizləmə məsləhəti üçün istehsalçı ilə əlaqə saxlayın. İstehsalçının təlimatları icazə verirsə, pipetlər müntəzəm olaraq avtoklavla sterilizasiya edilməlidir. Pipetlər avtoklavlana bilmirsə, onları 10% natrium hipoxloritlə (ardınca steril su ilə yaxşıca silin) və ya ticari DNT-ni məhv edən dekontaminantla, ardınca UB şüalarına məruz qalaraq təmizləmək kifayətdir.
Yüksək faizli natrium hipoxloritlə təmizləmə müntəzəm olaraq aparılarsa, nəticədə pipet plastiklərinə və metallarına zərər verə bilər; əvvəlcə istehsalçının tövsiyələrini yoxlayın. Bütün avadanlıqlar istehsalçı tərəfindən tövsiyə olunan cədvələ uyğun olaraq müntəzəm olaraq kalibrlənməlidir. Kalibrləmə cədvəlinə riayət olunmasını, ətraflı jurnalların aparılmasını və avadanlıqlarda xidmət etiketlərinin aydın şəkildə göstərilməsini təmin etmək üçün təyin olunmuş şəxs məsuliyyət daşımalıdır.
3. Təyin olunmuş molekulyar məkan üçün istifadə və təmizləmə tövsiyələri
Əvvəlcədən PCR: Reagentlərin alikotalanması / mastermix hazırlanması: Bu, molekulyar təcrübələrin hazırlanması üçün istifadə edilən bütün məkanlar arasında ən təmizi olmalı və ideal olaraq UB işığı ilə təchiz olunmuş xüsusi laminar axın kabineti olmalıdır. Nümunələr, ekstraksiya edilmiş nuklein turşusu və gücləndirilmiş PCR məhsulları bu ərazidə istifadə edilməməlidir. Gücləndirmə reagentləri dondurucuda (və ya istehsalçının tövsiyələrinə uyğun olaraq soyuducuda) eyni təyin olunmuş məkanda, ideal olaraq laminar axın kabinetinin və ya əvvəlcədən PCR sahəsinin yanında saxlanılmalıdır. Əvvəlcədən PCR sahəsinə və ya laminar axın kabinetinə daxil olduqda hər dəfə əlcəklər dəyişdirilməlidir.
PCR-dən əvvəlki sahə və ya laminar axın şkafı istifadədən əvvəl və sonra aşağıdakı kimi təmizlənməlidir: Şkafdakı bütün əşyaları, məsələn, pipetləri, ucluq qutularını, burulğanı, santrifüjü, boru rəflərini, qələmləri və s. 70% etanol və ya kommersiya DNT-ni məhv edən dekontaminantla silin və qurumağa qoyun. Qapalı iş sahəsi, məsələn, laminar axın şkafı halında, qapağı 30 dəqiqə UB işığına məruz qoyun.
Qeyd
Reagentləri UB işığına məruz qoymayın; onları yalnız təmizləndikdən sonra kabinetə yerləşdirin. Əks transkripsiya PZR aparılırsa, səthləri və avadanlıqları təmasda RN-ləri parçalayan məhlul ilə silmək də faydalı ola bilər. Bu, RNT-nin ferment parçalanmasından yalançı mənfi nəticələrin qarşısını almağa kömək edə bilər. Dekontaminasiyadan sonra və mastermiks hazırlamadan əvvəl əlcəklər bir daha dəyişdirilməlidir və sonra kabinet istifadəyə hazırdır.
PCR-dən əvvəl: Nuklein turşusunun çıxarılması/şablon əlavə edilməsi:
Nuklein turşusu ayrıca pipet dəsti, filtr ucları, boru rəfləri, təzə əlcəklər, laboratoriya örtükləri və digər avadanlıqlardan istifadə etməklə ikinci təyin olunmuş ərazidə çıxarılmalı və işlənməlidir. Bu sahə həmçinin mastermix borularına və ya lövhələrinə şablon, nəzarət və trend xətlərinin əlavə edilməsi üçündür. Təhlil edilən çıxarılan nuklein turşusu nümunələrinin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün müsbət nəzarət və ya standartlarla işləməzdən əvvəl əlcəkləri dəyişdirmək və ayrıca pipet dəstindən istifadə etmək tövsiyə olunur. PCR reagentləri və gücləndirilmiş məhsullar bu ərazidə pipetlənməməlidir. Nümunələr eyni ərazidə təyin olunmuş soyuducularda və ya dondurucularda saxlanılmalıdır. Nümunə iş sahəsi mastermix sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.
PCR sonrası: Gücləndirilmiş məhsulun gücləndirilməsi və işlənməsi
Bu təyin olunmuş məkan gücləndirmədən sonrakı proseslər üçündür və PCR-dən əvvəlki sahələrdən fiziki olaraq ayrı olmalıdır. Adətən termosiklerlər və real vaxt platformaları ehtiva edir və ideal olaraq, iç-içə PCR aparılırsa, 1-ci raund PCR məhsulunu 2-ci raund reaksiyasına əlavə etmək üçün laminar axın kabineti olmalıdır. Çirklənmə riski yüksək olduğundan, PCR reagentləri və ekstraksiya olunmuş nuklein turşusu bu sahədə istifadə edilməməlidir. Bu sahədə ayrıca əlcək dəsti, laboratoriya örtükləri, boşqab və boru rəfləri, pipetlər, filtr ucları, qablar və digər avadanlıqlar olmalıdır. Borular açılmadan əvvəl santrifüj edilməlidir. Nümunə iş sahəsi mastermix sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.
PCR sonrası: Məhsul təhlili
Bu otaq məhsul aşkarlama avadanlığı, məsələn, gel elektroforez çənləri, enerji blokları, UB transilüminiatoru və gel sənədləşdirmə sistemi üçündür. Bu ərazidə ayrıca əlcək dəstləri, laboratoriya örtükləri, boşqab və boru rəfləri, pipetlər, filtr ucluqları, qablar və digər avadanlıqlar olmalıdır. Boya doldurma, molekulyar marker və agaroza geli və bufer komponentləri istisna olmaqla, bu əraziyə başqa heç bir reagent gətirilə bilməz. Nümunə iş sahəsi mastermix sahəsi ilə eyni şəkildə təmizlənməlidir.
Vacib qeyd
İdeal olaraq, PCR-dən sonrakı otaqlarda iş artıq görülübsə, PCR-dən əvvəlki otaqlara eyni gündə daxil olmamalısınız. Bu tamamilə qaçılmazdırsa, əvvəlcə əllərin yaxşıca yuyulduğundan və otaqlarda xüsusi laboratoriya xalatlarının geyinildiyindən əmin olun. Laboratoriya kitabları və sənədləşmə materialları PCR-dən sonrakı otaqlarda istifadə olunubsa, PCR-dən əvvəlki otaqlara aparılmamalıdır; zərurət yarandıqda, protokolların/nümunə şəxsiyyət vəsiqələrinin və s. dublikatlarını çıxarın.
4. Ümumi molekulyar biologiya məsləhətləri
Testin qarşısını almaq üçün tozsuz əlcəklərdən istifadə edin. Düzgün pipetləmə texnikası çirklənmənin azaldılmasında çox vacibdir. Yanlış pipetləmə maye paylanarkən sıçramalara və aerozolların əmələ gəlməsinə səbəb ola bilər. Düzgün pipetləmə üçün yaxşı təcrübəni aşağıdakı linklərdə tapa bilərsiniz: Gilson pipetləmə təlimatı, Anachem pipetləmə texnikası videoları, Boruları açmazdan əvvəl santrifüj edin və sıçramamaq üçün diqqətlə açın. Çirkləndiricilərin daxil olmasının qarşısını almaq üçün istifadədən dərhal sonra boruları bağlayın.
Birdən çox reaksiya apararkən, reagent ötürülmələrinin sayını minimuma endirmək və çirklənmə təhlükəsini azaltmaq üçün ümumi reagentlərdən (məsələn, su, dNTP-lər, bufer, primerlər və ferment) ibarət bir mastermiks hazırlayın. Mastermiksi buz və ya soyuq blok üzərində qurmaq tövsiyə olunur. İsti Başlanğıc fermentinin istifadəsi qeyri-spesifik məhsulların istehsalını azaltmağa kömək edə bilər. Parçalanmanın qarşısını almaq üçün flüoresan zondlar olan reagentləri işıqdan qoruyun.
5. Daxili nəzarət
Bütün reaksiyalarda şablonsuz nəzarət və kəmiyyət reaksiyaları üçün çoxnöqtəli titrlənmiş trend xətti ilə yanaşı, yaxşı xarakterizə olunmuş, təsdiqlənmiş müsbət və mənfi nəzarətləri də daxil edin. Müsbət nəzarət çirklənmə riski yaradacaq qədər güclü olmamalıdır. Nuklein turşusu ekstraksiyasını həyata keçirərkən müsbət və mənfi ekstraksiya nəzarətlərini də daxil edin.
İstifadəçilərin davranış qaydalarından xəbərdar olması üçün hər bir ərazidə aydın təlimatların asılması tövsiyə olunur. Klinik nümunələrdə çox aşağı səviyyədə DNT və ya RNT aşkar edən diaqnostik laboratoriyalar, PCR-dən əvvəlki otaqlarda bir qədər müsbət hava təzyiqi və PCR-dən sonrakı otaqlarda bir qədər mənfi hava təzyiqi olan ayrı hava idarəetmə sistemlərinin olması kimi əlavə təhlükəsizlik tədbiri qəbul etmək istəyə bilərlər.
Nəhayət, keyfiyyət təminatı (KT) planının hazırlanması faydalıdır. Belə bir plana reagent əsas və işçi ehtiyatlarının siyahıları, dəstlərin və reagentlərin saxlanması qaydaları, nəzarət nəticələrinin hesabatı, işçi heyətinin təlim proqramları, problemlərin aradan qaldırılması alqoritmləri və lazım olduqda düzəliş tədbirləri daxil edilməlidir.
6. Biblioqrafiya
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Fəsil 3: KPCR laboratoriyasının qurulması. USEPA kPCR metodundan istifadə edərək istirahət sularının sınaqdan keçirilməsi üçün rəhbər sənəd 1611. Lansing-Miçiqan Dövlət Universiteti.
İngiltərə İctimai Səhiyyə Xidməti, NHS. Mikrobiologiya tədqiqatları üçün Böyük Britaniya standartları: Molekulyar gücləndirmə analizləri apararkən yaxşı laboratoriya təcrübəsi). Keyfiyyət Təlimatları. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR laboratoriyasının qurulması. Cold Spring Harb Protocol. 2007;7.
Schroeder S 2013. Santrifüjlərin müntəzəm texniki xidməti: santrifüjlərin, rotorların və adapterlərin təmizlənməsi, texniki xidməti və dezinfeksiyası (Ağ sənəd № 14). Hamburq: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Diaqnostik laboratoriyalarda istifadə olunan molekulyar əsaslı testlər üçün Yaxşı Klinik Laboratoriya Təcrübəsi (GCLP), In: Akyar I, redaktor. Geniş spektrli keyfiyyət nəzarəti. Rijeka, Xorvatiya: Intech; 2011: 29–52.
Yazı vaxtı: 16 iyul 2020
