O metotia e iloa ai molekiula e mafai ona gaosia ai se tele o le nucleic acid e ala i le faʻateleina o ni nai vaega o loʻo maua i faʻataʻitaʻiga. E ui o lenei mea e aoga mo le faʻafaigofieina o le iloa ma le maaleale, ae e faʻaalia ai foʻi le avanoa e ono afaina ai e ala i le salalau o le aerosol faʻateleina i totonu o le siosiomaga o le fale suʻesuʻe. A faia ni faʻataʻitaʻiga, e mafai ona faia ni fuafuaga e aloese ai mai le faʻaleagaina o reagents, meafaigaluega o le fale suʻesuʻe ma le avanoa i luga o le laulau, aua o ia faʻaleagaina e ono mafua ai ni taunuuga sese-lelei (pe sese-leaga).
Ina ia fesoasoani e faʻaitiitia le ono aʻafia ai o le fale suʻesuʻe, e tatau ona faʻatinoina i taimi uma le Good Laboratory Practice. Aemaise lava, e tatau ona faia ni puipuiga e tusa ai ma mea nei:
1. Taulimaina o vailaʻau faʻasaina
2. Fa'atulagaina o le avanoa faigaluega ma meafaigaluega
3. Fautuaga mo le fa'aaogaina ma le fa'amamaina o le avanoa molecular ua atofaina
4. Fautuaga lautele i le biology molecular
5. Pulega i totonu
6. Lisi o Mataupu
1. Taulimaina o vailaʻau faʻasaina
Fa'asolo pu'upu'u paipa o le reagent a'o le'i tatalaina ina ia 'alofia ai le fa'atupuina o aerosol. Fa'asolo vaega o reagent ina ia 'alofia ai le tele o le aisa-liu ma le fa'aleagaina o oloa autu. Fa'ailoga manino ma fa'amau le aso o paipa uma o le reagent ma le reaction ma teu fa'amaumauga o numera o le reagent ma numera o le batch na fa'aaogaina i fa'ata'ita'iga uma. Fa'asusu uma reagent ma fa'ata'ita'iga e fa'aaoga ai pito o le filter. A'o le'i fa'atauina, e fautuaina e fa'amaonia ma le kamupani gaosi oloa o pito o le filter e fetaui ma le ituaiga o le pipette o le a fa'aaogaina.
2. Fa'atulagaina o le avanoa faigaluega ma meafaigaluega
E tatau ona fa'atulaga le nofoaga faigaluega ina ia mautinoa o lo'o fa'agasolo galuega i le itu e tasi, mai nofoaga mama (pre-PCR) i nofoaga palapala (post-PCR). O puipuiga lautele nei o le a fesoasoani e fa'aitiitia ai le avanoa e fa'aleagaina ai. Ia i ai ni potu fa'apitoa eseese, pe itiiti ifo ma ni nofoaga eseese fa'aletino, mo: sauniuniga o le mastermix, fa'a'esea o le nucleic acid ma le fa'aopoopoina o le DNA template, fa'ateleina ma le taulimaina o oloa fa'ateleina, ma le au'ili'iliga o oloa, e pei o le gel electrophoresis.
I nisi tulaga, e faigata le i ai o potu eseese e 4. O se filifiliga e mafai ae e le manaʻomia tele, o le faia lea o le sauniuniga o le mastermix i totonu o se nofoaga e taofia ai siama, e pei o se kapeneta tafe laminar. I le tulaga o le faʻateleina o le PCR, o le sauniuniga o le mastermix mo le tali lona lua e tatau ona saunia i le nofoaga 'mama' mo le sauniuniga o le mastermix, ae o le tui i le oloa autu o le PCR e tatau ona faia i totonu o le potu faʻateleina, ma afai e mafai i se nofoaga faʻapitoa e taofia ai siama (e pei o se kapeneta tafe laminar).
E manaʻomia e potu/nofoaga taʻitasi se seti eseese o pipettes ua faʻailogaina manino, pito o le faamama, fata o paipa, vortexes, centrifuges (pe a talafeagai), peni, reagents masani a le fale suʻesuʻe, ofu suʻesuʻe ma pusa o totigilima o le a tuʻu pea i o latou nofoaga faigaluega. E tatau ona fufulu lima ma sui totigilima ma ofu suʻesuʻe pe a feoaʻi i le va o nofoaga ua atofaina. E le tatau ona siitia reagents ma meafaigaluega mai se nofoaga palapala i se nofoaga mama. Afai e tulaʻi mai se tulaga ogaoga e manaʻomia ai ona toe siitia i tua se reagent poʻo se meafaigaluega, e tatau muamua ona faʻamamāina i le 10% sodium hypochlorite, ona sosoo ai lea ma le solo i le vai mama.
Fa'amatalaga
E tatau ona faia fou i aso taitasi le vailaʻau e 10% sodium hypochlorite. A faʻaaogaina mo le faʻamamāina, e tatau ona tausisi i le itiiti ifo i le 10 minute le umi e faʻafesoʻotaʻi ai.
O se isi itu, o oloa o loʻo maua faapisinisi ua faʻamaonia o ni vailaʻau e faʻaumatia ai mea leaga e faʻaleagaina ai le DNA e mafai ona faʻaaogaina pe afai e le faʻatagaina e fautuaga saogalemu faʻalotoifale le faʻaaogaina o le sodium hypochlorite pe afai e le talafeagai le sodium hypochlorite mo le faʻamamaina o vaega uʻamea o masini.
O le mea sili, e tatau i le aufaigaluega ona usita'ia le faiga masani o le fa'agasologa o galuega e tasi le itu ma aua ne'i toe fo'i atu mai nofoaga palapala (post-PCR) i nofoaga mama (pre-PCR) i le aso lava e tasi. Peita'i, atonu e iai taimi e lē mafai ai ona 'alofia lenei mea. A tula'i mai sea tulaga, e tatau i le aufaigaluega ona fa'aeteete e fufulu lelei o latou lima, sui totigilima, fa'aaoga le ofuvae fa'apitoa mo le su'esu'ega ma 'aua ne'i toe fa'afo'i mai ni mea faigaluega latou te manana'o e ave'ese mai le potu, e pei o tusi su'esu'ega. O ia faiga fa'atonutonu e tatau ona fa'amamafa i a'oa'oga a le aufaigaluega i metotia fa'amolekuli.
A uma ona fa'aoga, e tatau ona fa'amamāina avanoa o nofoa i le 10% sodium hypochlorite (soso'o ai ma le vai mama e aveese ai le vaila'au fa'amama e totoe), 70% ethanol, po'o se vaila'au fa'amamā DNA ua fa'amaonia e maua i pisinisi. O le mea sili, e tatau ona fa'apipi'i lamepa ultraviolet (UV) ina ia mafai ai ona fa'amamāina mea leaga e ala i le fa'avevela. Peita'i, e tatau ona fa'atapula'aina le fa'aaogaina o lamepa UV i nofoaga faigaluega tapuni, e pei o kapoti saogalemu, ina ia fa'atapula'aina ai le a'afiaga o le UV i le aufaigaluega o le fale su'esu'e. Fa'amolemole usita'i i fa'atonuga a le kamupani gaosi mo le tausiga o lamepa UV, fa'amamafana ma le fa'amamaina ina ia mautinoa o lo'o aoga pea lamepa.
Afai e fa'aaogā le 70% ethanol nai lo le sodium hypochlorite, o le a mana'omia le fa'avevela i le malamalama UV e fa'amae'a ai le fa'amamāina.
Aua le fa'amamāina le vortex ma le centrifuge i le sodium hypochlorite; nai lo lea, solo i lalo i le 70% ethanol ma fa'aali i le malamalama UV, pe fa'aaoga se vaila'au fa'amamā e fa'aumatia ai le DNA. Mo mea e masa'a, siaki ma le kamupani gaosi mo nisi fautuaga fa'amamā. Afai e fa'atagaina e fa'atonuga a le kamupani gaosi, e tatau ona fa'amamāina pea pipettes i le autoclave. Afai e le mafai ona fa'amamāina pipettes, e lava le fa'amamāina i le 10% sodium hypochlorite (soso'o ai ma le solo lelei i le vai mama) pe fa'aaoga se vaila'au fa'amamā e fa'aumatia ai le DNA ona soso'o ai lea ma le fa'aalia i le UV.
O le fa'amamāina i le pasene maualuga o le sodium hypochlorite e ono fa'aleagaina ai palasitika ma u'amea o pipette pe a faia i taimi uma; siaki muamua fautuaga mai le kamupani gaosi oloa. E mana'omia ona fa'atulaga lelei masini uma e tusa ai ma le fa'asologa ua fautuaina e le kamupani gaosi oloa. E tatau i se tagata ua tofia ona nafa ma le fa'amautinoaina o lo'o tausisia le fa'asologa o le fa'atulagaina, tausia fa'amaumauga auiliili, ma fa'aalia manino fa'ailoga tautua i masini.
3. Fautuaga mo le fa'aaogaina ma le fa'amamaina o le avanoa molecular ua atofaina
Pre-PCR: Sauniuniga o le reagent aliquoting / mastermix: O le avanoa lea e sili ona mama e faʻaaogaina mo le sauniuniga o faʻataʻitaʻiga molecular ma e sili ai pe a fai o se laminar flow cabinet ua faʻatulagaina ma se moli UV. E le tatau ona taulimaina faʻataʻitaʻiga, nucleic acid ua faʻamamāina ma oloa PCR ua faʻateleina i lenei vaega. E tatau ona teuina faʻamalosi reagent i totonu o se pusaaisa (poʻo se pusaaisa, e tusa ai ma fautuaga a le kamupani gaosi oloa) i le avanoa lava e tasi ua faʻatulagaina, e sili ai pe a fai o le laminar flow cabinet poʻo le pre-PCR area. E tatau ona sui totigilima i taimi uma e ulufale ai i le pre-PCR area poʻo le laminar flow cabinet.
E tatau ona fa'amamāina le vaega a'o le'i faia le PCR po'o le kapeneta tafe laminar a'o le'i fa'aaogaina ma pe a uma ona fa'aaoga e pei ona taua i lalo: Solo ese mea uma i totonu o le kapeneta, e pei o pipettes, tip boxes, vortex, centrifuge, tube racks, pens, ma isi mea fa'apena i le 70% ethanol po'o se vaila'au fa'amamā e fa'aumatia ai le DNA, ma tu'u e mago. Afai o se nofoaga faigaluega tapuni, e pei o se kapeneta tafe laminar, fa'aali le pulou i le malamalama UV mo le 30 minute.
Fa'amatalaga
Aua ne'i fa'aalia mea fa'aola i le malamalama UV; na'o le ave i totonu o le kapeneta pe a mama. Afai e faia le reverse transcription PCR, e ono fesoasoani fo'i le soloina o mea ma masini i se vaila'au e fa'aleagaina ai RNases pe a pa'i i ai. Atonu e fesoasoani lea e 'alofia ai ni taunuuga sese mai le fa'aleagaina o le enzyme o le RNA. A mae'a ona fa'amamāina mea leaga ma a'o le'i saunia le mastermix, e tatau ona toe sui totigilima, ona sauni loa lea o le kapeneta e fa'aaoga.
Pre-PCR: Fa'a'esega o le nucleic acid/fa'aopoopoga o le template:
E tatau ona aveese ma taulimaina le nucleic acid i se isi nofoaga ua atofaina, e faʻaaoga ai se seti ese o pipettes, pito faamama, fata paipa, totigilima fou, ofu suʻesuʻe ma isi meafaigaluega. O lenei nofoaga e faʻaopoopoina ai foʻi faʻataʻitaʻiga, vaega faʻatonutonu ma laina faʻasolosolo i paipa poʻo ipu mastermix. Ina ia ʻalofia le faʻaleagaina o faʻataʻitaʻiga o le nucleic acid ua aveeseina o loʻo suʻesuʻeina, e fautuaina e sui totigilima aʻo leʻi taulimaina vaega faʻatonutonu poʻo tulaga faʻatonuina ma faʻaaoga se seti ese o pipettes. E le tatau ona faʻasusuina ni reagents PCR ma oloa faʻateleina i lenei nofoaga. E tatau ona teuina faʻataʻitaʻiga i totonu o pusaaisa poʻo pusaaisa ua atofaina i le nofoaga lava e tasi. E tatau ona faʻamamaina le avanoa faigaluega mo faʻataʻitaʻiga i le auala lava e tasi e pei o le avanoa mastermix.
Post-PCR: Fa'ateleina ma le taulimaina o le oloa fa'ateleina
O lenei avanoa ua atofaina mo faiga fa'atino pe a uma le fa'ateleina ma e tatau ona vavae'ese faaletino mai vaega o le pre-PCR. E masani ona i ai ni thermocyclers ma ni fa'avae taimi moni, ma e sili ai le i ai o se kapeneta tafe laminar mo le fa'aopoopoina o le oloa PCR ta'amilosaga 1 i le tali ta'amilosaga 2, pe afai o lo'o faia le nested PCR. E le tatau ona taulimaina ni reagents PCR ma ni nucleic acid ua fa'a'esea i lenei vaega ona e maualuga le lamatiaga o le fa'aleagaina. E tatau ona i ai i lenei vaega se seti eseese o totigilima, ofu su'esu'e, fata ipu ma paipa, pipettes, pito faamama, pusa ma isi meafaigaluega. E tatau ona fa'a-centrifuge paipa a'o le'i tatalaina. E tatau ona fa'amamaina le avanoa faigaluega fa'ata'ita'i i le auala lava e tasi e pei o le avanoa mastermix.
Pe a uma le PCR: Su'esu'ega o oloa
O lenei potu e mo masini e iloa ai oloa, e pei o tane eletise gel, pusa eletise, UV transilluminator ma le faiga e fa'amaumau ai le gel. E tatau ona i ai i lenei vaega ni seti eseese o totigilima, ofu su'esu'e, fata ipu ma paipa, pipettes, pito faamama, pusa ma isi masini. E le mafai ona aumaia ni isi reagents i totonu o lenei vaega, vagana ai le vali uta, maka molecular ma le agarose gel, ma vaega buffer. E tatau ona fa'amamaina le avanoa faigaluega fa'ata'ita'i i le auala lava e tasi e pei o le avanoa mastermix.
Fa'amatalaga tāua
E sili atu, e le tatau ona ulufale i potu pre-PCR i le aso lava e tasi pe afai ua uma ona faia galuega i potu post-PCR. Afai e matuā lē mafai ona ʻalofia lenei mea, ia mautinoa ua fufulu lelei muamua lima ma ia ofuina ni ofu faapitoa o le fale suʻesuʻe i totonu o potu. E le tatau ona aveina tusi ma pepa o le fale suʻesuʻe i totonu o potu pre-PCR pe afai na faʻaaogaina i potu post-PCR; afai e manaʻomia, ia faia ni kopi lolomi o protocols/faʻataʻitaʻiga ID, ma isi mea faapena.
4. Fautuaga lautele i le biology molecular
Faaaoga ni totigilima e leai ni pauta e aloese ai mai le faalavelaveina o le suʻega. O le auala saʻo o le faʻapipiʻiina o paipa e taua tele mo le faʻaitiitia o le faʻaleagaina. O le faʻapipiʻiina sese o paipa e mafai ona iʻu ai i le pisia pe a tuʻuina atu vai ma le faia o aerosol. O faiga lelei mo le faʻapipiʻiina saʻo o paipa e mafai ona maua i soʻotaga nei: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes aʻo leʻi tatalaina, ma tatala ma le faʻaeteete ina ia ʻalofia ai le pisia. Tapuni loa paipa pe a uma ona faʻaaoga ina ia ʻalofia ai le faʻaofiina mai o mea leaga.
A faia ni tali eseese, saunia se tasi o mea e fa'afefiloi ai le tele o vaila'au e masani ona fa'aaogaina (e pei o le vai, dNTPs, buffer, primers ma le enzyme) e fa'aitiitia ai le aofa'i o fesiitaiga o vaila'au ma fa'aitiitia ai le lamatiaga o le fa'aleagaina. E fautuaina e fa'atulaga le mea e fa'afefiloi ai le tele o vaila'au i luga o le aisa po'o se poloka malulu. O le fa'aaogaina o se enzyme Hot Start e mafai ona fesoasoani e fa'aitiitia ai le gaosiga o oloa e le o ni oloa fa'apitoa. Puipui vaila'au o lo'o i ai ni su'esu'ega fluorescent mai le malamalama ina ia 'alofia ai le fa'aleagaina.
5. Pulega i totonu
Ia aofia ai vaega pulea lelei ma leaga ua fa'ailoaina lelei, fa'atasi ai ma se vaega pulea e leai se fa'ata'ita'iga i tali uma, ma se laina fa'asolosolo titrated mo tali fa'atatau. E le tatau ona malosi tele le vaega pulea lelei e ono lamatia ai le fa'aleagaina. Ia aofia ai vaega pulea lelei ma leaga pe a fa'atinoina le fa'amamāina o le nucleic acid.
E fautuaina le fa'apipi'iina o fa'atonuga manino i vaega ta'itasi ina ia silafia e tagata fa'aoga tulafono o amioga. O fale su'esu'e su'esu'e e iloa ai tulaga maualalo o le DNA po'o le RNA i fa'ata'ita'iga fa'aklinikal atonu e mana'o e fa'aaoga le puipuiga fa'aopoopo o le i ai o ni faiga eseese e taulimaina ai le ea ma le mamafa o le ea e sili atu le lelei i potu a'o le'i faia le PCR ma le mamafa o le ea e sili atu le leaga i potu pe a uma le PCR.
Ma le mea mulimuli, o le atiaeina o se fuafuaga mo le faʻamautinoaga o le lelei (QA) e fesoasoani tele. O sea fuafuaga e tatau ona aofia ai lisi o oloa autu o reagent ma oloa faigaluega, tulafono mo le teuina o pusa ma reagent, lipotiina o taunuuga o le pulea, polokalame aʻoaʻoga a le aufaigaluega, algorithms mo le foia o faafitauli, ma gaioiga faʻaleleia pe a manaʻomia.
6. Lisi o Mataupu
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Mataupu 3: Fa'atuina o se fale su'esu'e qPCR. O se pepa taiala mo le su'eina o vai fa'afiafia e fa'aaoga ai le metotia USEPA qPCR 1611. Lansing- Iunivesite o le Setete o Michigan.
Soifua Maloloina Lautele i Egelani, NHS. Tulaga faatonuina a Peretania mo suʻesuʻega o siama: Faiga Lelei i le Fale Suʻesuʻe pe a faia suʻega faʻateleina molecular). Taiala mo le Tulaga Lelei. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Fa'atuina o se fale su'esu'e PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Tausiga masani o centrifuges: fa'amamaina, tausiga ma le fa'amamāina o centrifuges, rotors ma adapters (Papa Pa'epa'e Nu. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Fa'ata'ita'iga Lelei o le Fale Su'esu'e Fa'afoma'i (GCLP) mo su'ega fa'avae molecular e fa'aaogaina i fale su'esu'e fa'ama'i, I totonu o: Akyar I, faatonu. Fa'ailoga lautele o le pulea lelei. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Taimi na lafoina ai: Iulai-16-2020
