Các phương pháp phát hiện phân tử có khả năng tạo ra một lượng lớn axit nucleic thông qua việc khuếch đại lượng vết có trong mẫu. Mặc dù điều này có lợi cho việc phát hiện nhạy bén, nhưng nó cũng làm tăng nguy cơ ô nhiễm do sự phát tán các hạt khí dung khuếch đại trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi tiến hành thí nghiệm, cần thực hiện các biện pháp để tránh ô nhiễm thuốc thử, thiết bị phòng thí nghiệm và không gian làm việc, vì sự ô nhiễm như vậy có thể tạo ra kết quả dương tính giả (hoặc âm tính giả).
Để giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn, cần luôn luôn thực hiện các nguyên tắc Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt (Good Laboratory Practice). Cụ thể, cần lưu ý các điểm sau:
1. Xử lý hóa chất
2. Tổ chức không gian làm việc và thiết bị
3. Hướng dẫn sử dụng và vệ sinh cho không gian phân tử được chỉ định.
4. Lời khuyên chung về sinh học phân tử
5. Kiểm soát nội bộ
6. Tài liệu tham khảo
1. Xử lý hóa chất
Ly tâm nhanh các ống đựng hóa chất trước khi mở để tránh tạo ra các hạt khí dung. Chia nhỏ hóa chất để tránh làm đông và rã đông nhiều lần cũng như làm nhiễm bẩn dung dịch gốc. Ghi nhãn và ngày tháng rõ ràng cho tất cả các ống đựng hóa chất và ống phản ứng, đồng thời ghi chép lại số lô và số mẻ hóa chất được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm. Sử dụng pipet có đầu lọc để hút và lấy mẫu. Trước khi mua, nên xác nhận với nhà sản xuất rằng đầu lọc phù hợp với nhãn hiệu pipet sẽ sử dụng.
2. Tổ chức không gian làm việc và thiết bị
Không gian làm việc cần được tổ chức sao cho quy trình làm việc diễn ra theo một chiều, từ khu vực sạch (trước PCR) đến khu vực bẩn (sau PCR). Các biện pháp phòng ngừa chung sau đây sẽ giúp giảm nguy cơ nhiễm bẩn. Cần có các phòng riêng biệt, hoặc ít nhất là các khu vực riêng biệt về mặt vật lý, cho: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (mastermix), chiết tách axit nucleic và thêm mẫu DNA, khuếch đại và xử lý sản phẩm khuếch đại, và phân tích sản phẩm, ví dụ như điện di gel.
Trong một số trường hợp, việc có 4 phòng riêng biệt là khó khăn. Một lựa chọn khả thi nhưng ít được ưa chuộng hơn là chuẩn bị hỗn hợp phản ứng chính (mastermix) trong khu vực cách ly, ví dụ như tủ hút khí laminar. Trong trường hợp khuếch đại PCR lồng ghép, việc chuẩn bị hỗn hợp phản ứng chính cho vòng phản ứng thứ hai nên được thực hiện trong khu vực "sạch" dành cho việc chuẩn bị hỗn hợp phản ứng chính, nhưng việc cấy sản phẩm PCR sơ cấp nên được thực hiện trong phòng khuếch đại, và nếu có thể, trong một khu vực cách ly chuyên dụng (ví dụ như tủ hút khí laminar).
Mỗi phòng/khu vực cần có một bộ dụng cụ riêng biệt được dán nhãn rõ ràng gồm pipet, đầu lọc, giá đỡ ống nghiệm, máy khuấy vortex, máy ly tâm (nếu có), bút, hóa chất thí nghiệm thông dụng, áo khoác phòng thí nghiệm và hộp găng tay, và phải được đặt tại vị trí làm việc tương ứng. Phải rửa tay và thay găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm khi di chuyển giữa các khu vực được chỉ định. Không được di chuyển hóa chất và thiết bị từ khu vực bẩn sang khu vực sạch. Trong trường hợp khẩn cấp cần phải di chuyển hóa chất hoặc thiết bị ngược lại, trước tiên phải khử trùng bằng dung dịch natri hypoclorit 10%, sau đó lau sạch bằng nước vô trùng.
Ghi chú
Dung dịch natri hypoclorit 10% phải được pha mới mỗi ngày. Khi sử dụng để khử trùng, cần tuân thủ thời gian tiếp xúc tối thiểu 10 phút.
Ngoài ra, có thể sử dụng các sản phẩm thương mại đã được kiểm chứng là chất khử trùng bề mặt có khả năng phá hủy DNA nếu các khuyến nghị an toàn địa phương không cho phép sử dụng natri hypoclorit hoặc nếu natri hypoclorit không phù hợp để khử trùng các bộ phận kim loại của thiết bị.
Lý tưởng nhất là nhân viên nên tuân thủ nguyên tắc luồng công việc một chiều và không di chuyển từ khu vực bẩn (sau khi thực hiện PCR) trở lại khu vực sạch (trước khi thực hiện PCR) trong cùng một ngày. Tuy nhiên, có thể có những trường hợp không thể tránh khỏi. Khi đó, nhân viên phải chú ý rửa tay kỹ, thay găng tay, sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm được chỉ định và không mang bất kỳ thiết bị nào mà họ sẽ muốn mang ra khỏi phòng sau này, chẳng hạn như sổ ghi chép thí nghiệm. Các biện pháp kiểm soát này cần được nhấn mạnh trong quá trình đào tạo nhân viên về các phương pháp sinh học phân tử.
Sau khi sử dụng, khu vực làm việc cần được làm sạch bằng dung dịch natri hypoclorit 10% (sau đó rửa lại bằng nước vô trùng để loại bỏ chất tẩy trắng còn sót lại), etanol 70% hoặc chất khử trùng tiêu hủy DNA đã được kiểm định trên thị trường. Tốt nhất nên lắp đặt đèn cực tím (UV) để khử trùng bằng chiếu xạ. Tuy nhiên, việc sử dụng đèn UV cần được hạn chế trong các khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ an toàn sinh học, để hạn chế sự tiếp xúc của nhân viên phòng thí nghiệm với tia UV. Vui lòng tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về bảo dưỡng, thông gió và vệ sinh đèn UV để đảm bảo đèn vẫn hoạt động hiệu quả.
Nếu sử dụng etanol 70% thay vì natri hypoclorit, cần phải chiếu tia UV để hoàn tất quá trình khử trùng.
Không được làm sạch bộ phận khuấy xoáy và ly tâm bằng natri hypoclorit; thay vào đó, hãy lau sạch bằng cồn 70% và chiếu tia UV, hoặc sử dụng chất khử trùng phá hủy DNA thương mại. Đối với các vết đổ, hãy liên hệ với nhà sản xuất để được tư vấn thêm về cách làm sạch. Nếu hướng dẫn của nhà sản xuất cho phép, nên tiệt trùng pipet thường xuyên bằng nồi hấp. Nếu không thể tiệt trùng pipet bằng nồi hấp, chỉ cần làm sạch chúng bằng dung dịch natri hypoclorit 10% (sau đó lau kỹ bằng nước vô trùng) hoặc bằng chất khử trùng phá hủy DNA thương mại rồi chiếu tia UV là đủ.
Việc vệ sinh bằng dung dịch natri hypoclorit nồng độ cao thường xuyên có thể làm hỏng nhựa và kim loại của pipet; trước tiên hãy kiểm tra khuyến cáo của nhà sản xuất. Tất cả thiết bị cần được hiệu chuẩn định kỳ theo lịch trình do nhà sản xuất khuyến nghị. Cần chỉ định một người chịu trách nhiệm đảm bảo tuân thủ lịch trình hiệu chuẩn, ghi chép chi tiết và dán nhãn bảo dưỡng rõ ràng trên thiết bị.
3. Hướng dẫn sử dụng và vệ sinh cho không gian phân tử được chỉ định.
Chuẩn bị trước PCR: Chia nhỏ thuốc thử / chuẩn bị hỗn hợp chính: Khu vực này phải là khu vực sạch nhất trong tất cả các khu vực được sử dụng để chuẩn bị cho các thí nghiệm phân tử và lý tưởng nhất là một tủ hút khí vô trùng được trang bị đèn UV. Không được phép chạm vào mẫu, axit nucleic đã chiết xuất và sản phẩm PCR khuếch đại trong khu vực này. Thuốc thử khuếch đại nên được bảo quản trong tủ đông (hoặc tủ lạnh, theo khuyến cáo của nhà sản xuất) trong cùng khu vực được chỉ định, lý tưởng nhất là cạnh tủ hút khí vô trùng hoặc khu vực chuẩn bị trước PCR. Nên thay găng tay mỗi khi vào khu vực chuẩn bị trước PCR hoặc tủ hút khí vô trùng.
Khu vực chuẩn bị trước PCR hoặc tủ hút khí vô trùng cần được làm sạch trước và sau khi sử dụng như sau: Lau sạch tất cả các vật dụng trong tủ, ví dụ như pipet, hộp đựng tip, máy khuấy vortex, máy ly tâm, giá đỡ ống nghiệm, bút viết, v.v., bằng cồn 70% hoặc chất khử trùng phá hủy DNA thương mại và để khô. Trong trường hợp khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ hút khí vô trùng, hãy chiếu tia UV vào tủ trong 30 phút.
Ghi chú
Không được chiếu tia cực tím vào các hóa chất; chỉ được đưa chúng vào tủ sau khi tủ đã được làm sạch. Nếu thực hiện PCR phiên mã ngược, việc lau sạch các bề mặt và thiết bị bằng dung dịch có khả năng phân hủy RNase khi tiếp xúc cũng có thể hữu ích. Điều này có thể giúp tránh kết quả âm tính giả do sự phân hủy RNA bởi enzyme. Sau khi khử trùng và trước khi chuẩn bị hỗn hợp chính, cần thay găng tay một lần nữa, sau đó tủ đã sẵn sàng để sử dụng.
Chuẩn bị trước PCR: Chiết tách axit nucleic/thêm mẫu:
Axit nucleic phải được chiết xuất và xử lý trong một khu vực riêng biệt, sử dụng bộ pipet, đầu lọc, giá đỡ ống nghiệm, găng tay mới, áo khoác phòng thí nghiệm và các thiết bị khác riêng biệt. Khu vực này cũng dùng để thêm mẫu, mẫu đối chứng và đường xu hướng vào các ống hoặc đĩa hỗn hợp chính. Để tránh nhiễm bẩn các mẫu axit nucleic đã chiết xuất đang được phân tích, nên thay găng tay trước khi xử lý các mẫu đối chứng dương tính hoặc mẫu chuẩn và sử dụng bộ pipet riêng biệt. Không được dùng pipet để nhỏ giọt thuốc thử PCR và sản phẩm khuếch đại trong khu vực này. Các mẫu nên được bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đông được chỉ định trong cùng khu vực. Khu vực làm việc với mẫu cần được làm sạch tương tự như khu vực pha chế hỗn hợp chính.
Sau PCR: Khuếch đại và xử lý sản phẩm khuếch đại.
Khu vực này dành cho các quy trình sau khuếch đại và cần được tách biệt hoàn toàn với khu vực trước PCR. Khu vực này thường chứa các máy luân nhiệt và hệ thống thời gian thực, và lý tưởng nhất là nên có tủ hút khí vô trùng để thêm sản phẩm PCR vòng 1 vào phản ứng vòng 2, nếu đang thực hiện PCR lồng ghép. Không được phép xử lý thuốc thử PCR và axit nucleic đã chiết xuất trong khu vực này vì nguy cơ nhiễm bẩn rất cao. Khu vực này cần có bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống nghiệm, pipet, đầu lọc, thùng chứa và các thiết bị khác riêng biệt. Các ống nghiệm phải được ly tâm trước khi mở. Khu vực làm việc với mẫu cần được làm sạch tương tự như khu vực pha chế hỗn hợp chính.
Sau PCR: Phân tích sản phẩm
Phòng này dành cho các thiết bị kiểm tra sản phẩm, ví dụ như bể điện di gel, bộ nguồn, đèn chiếu tia cực tím và hệ thống ghi hình gel. Khu vực này cần có bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống nghiệm, pipet, đầu lọc, thùng chứa và các thiết bị khác riêng biệt. Không được mang bất kỳ hóa chất nào khác vào khu vực này, ngoại trừ thuốc nhuộm tải mẫu, chất đánh dấu phân tử, gel agarose và các thành phần dung dịch đệm. Khu vực làm việc với mẫu cần được vệ sinh tương tự như khu vực pha chế hỗn hợp chính.
Lưu ý quan trọng
Tốt nhất là không nên vào phòng chuẩn bị PCR trong cùng ngày nếu công việc đã được thực hiện ở phòng hậu PCR. Nếu điều này hoàn toàn không thể tránh khỏi, hãy đảm bảo rửa tay thật kỹ trước khi vào và mặc áo khoác phòng thí nghiệm chuyên dụng. Không được mang sổ ghi chép và giấy tờ vào phòng chuẩn bị PCR nếu chúng đã được sử dụng ở phòng hậu PCR; nếu cần, hãy in bản sao các quy trình/mã số mẫu, v.v.
4. Lời khuyên chung về sinh học phân tử
Sử dụng găng tay không có bột để tránh ức chế xét nghiệm. Kỹ thuật hút mẫu đúng cách là tối quan trọng để giảm thiểu ô nhiễm. Hút mẫu không đúng cách có thể dẫn đến bắn tung tóe khi nhỏ chất lỏng và tạo ra các sol khí. Bạn có thể tìm thấy hướng dẫn thực hành hút mẫu đúng cách tại các liên kết sau: Hướng dẫn hút mẫu của Gilson, video hướng dẫn kỹ thuật hút mẫu của Anachem, Ly tâm ống nghiệm trước khi mở và mở cẩn thận để tránh bắn tung tóe. Đóng kín ống nghiệm ngay sau khi sử dụng để tránh đưa chất gây ô nhiễm vào.
Khi thực hiện nhiều phản ứng, hãy chuẩn bị một hỗn hợp chính (mastermix) chứa các thuốc thử thông dụng (ví dụ: nước, dNTPs, dung dịch đệm, mồi và enzyme) để giảm thiểu số lần chuyển thuốc thử và giảm nguy cơ nhiễm bẩn. Nên làm lạnh hỗn hợp chính trên đá hoặc khối lạnh. Sử dụng enzyme khởi động nóng (Hot Start enzyme) có thể giúp giảm sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu. Bảo vệ các thuốc thử chứa chất phát huỳnh quang khỏi ánh sáng để tránh bị phân hủy.
5. Kiểm soát nội bộ
Bao gồm các mẫu đối chứng dương tính và âm tính đã được xác định rõ ràng và kiểm chứng, cùng với mẫu đối chứng không có khuôn mẫu trong tất cả các phản ứng, và một đường xu hướng chuẩn độ đa điểm cho các phản ứng định lượng. Mẫu đối chứng dương tính không nên quá mạnh đến mức gây nguy cơ nhiễm bẩn. Bao gồm các mẫu đối chứng dương tính và âm tính khi thực hiện chiết tách axit nucleic.
Nên niêm yết các hướng dẫn rõ ràng ở từng khu vực để người dùng nắm rõ các quy tắc ứng xử. Các phòng thí nghiệm chẩn đoán phát hiện nồng độ DNA hoặc RNA rất thấp trong mẫu lâm sàng có thể muốn áp dụng thêm biện pháp an ninh bằng cách sử dụng hệ thống xử lý không khí riêng biệt với áp suất không khí dương nhẹ trong phòng tiền PCR và áp suất không khí âm nhẹ trong phòng hậu PCR.
Cuối cùng, việc xây dựng một kế hoạch đảm bảo chất lượng (QA) là rất hữu ích. Kế hoạch này nên bao gồm danh sách các mẫu thuốc thử gốc và mẫu thuốc thử dùng trong thí nghiệm, quy tắc bảo quản bộ dụng cụ và thuốc thử, báo cáo kết quả kiểm soát, chương trình đào tạo nhân viên, thuật toán xử lý sự cố và các biện pháp khắc phục khi cần thiết.
6. Tài liệu tham khảo
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chương 3: Thiết lập phòng thí nghiệm qPCR. Tài liệu hướng dẫn kiểm tra nguồn nước giải trí bằng phương pháp qPCR 1611 của USEPA. Lansing - Đại học Tiểu bang Michigan.
Cơ quan Y tế Công cộng Anh, NHS. Tiêu chuẩn Vương quốc Anh cho các cuộc điều tra vi sinh: Thực hành phòng thí nghiệm tốt khi thực hiện các xét nghiệm khuếch đại phân tử). Hướng dẫn chất lượng. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Thiết lập phòng thí nghiệm PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Bảo trì định kỳ máy ly tâm: làm sạch, bảo dưỡng và khử trùng máy ly tâm, rôto và bộ chuyển đổi (Tài liệu trắng số 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Thực hành phòng thí nghiệm lâm sàng tốt (GCLP) cho các xét nghiệm dựa trên phân tử được sử dụng trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán, Trong: Akyar I, biên tập. Phạm vi rộng của kiểm soát chất lượng. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Thời gian đăng bài: 16/7/2020
