Усулҳои ошкоркунии молекулавӣ қобилияти тавлиди миқдори зиёди кислотаи нуклеинро тавассути тақвияти миқдори микроскопии дар намунаҳо мавҷудбуда доранд. Гарчанде ки ин барои имкон додани ошкоркунии ҳассос муфид аст, он инчунин имконияти олудашавиро тавассути паҳншавии аэрозолҳои тақвияткунанда дар муҳити лабораторӣ ба вуҷуд меорад. Ҳангоми гузаронидани таҷрибаҳо, чораҳоеро метавон андешид, то аз олудашавии реагентҳо, таҷҳизоти лабораторӣ ва фазои миз пешгирӣ карда шавад, зеро чунин олудашавӣ метавонад натиҷаҳои бардурӯғи мусбат (ё бардурӯғи манфӣ) ба бор орад.
Барои кам кардани эҳтимолияти олудашавӣ, бояд ҳамеша амалияи хуби лабораторӣ анҷом дода шавад. Хусусан, чораҳои эҳтиётӣ бояд дар робита ба нуктаҳои зерин андешида шаванд:
1. Коркарди реагентҳо
2. Ташкили фазои корӣ ва таҷҳизот
3. Маслиҳатҳо оид ба истифода ва тозакунӣ барои фазои молекулавии муайяншуда
4. Маслиҳатҳои умумии биологияи молекулавӣ
5. Назорати дохилӣ
6. Феҳристи адабиёт
1. Коркарди реагентҳо
Пеш аз кушодан, барои пешгирӣ аз пайдоиши аэрозолҳо, найчаҳои реагентҳоро кӯтоҳ сентрифуга кунед. Реагентҳои алоҳида барои пешгирӣ аз обшавии чандкарата ва ифлосшавии захираҳои асосӣ. Ҳамаи найчаҳои реагент ва реаксияро ба таври возеҳ нишонгузорӣ ва сана гузоред ва гузоришҳои партия ва рақамҳои реактивро, ки дар ҳама таҷрибаҳо истифода шудаанд, нигоҳ доред. Ҳамаи реагентҳо ва намунаҳоро бо истифода аз нӯгҳои филтр пипетка кунед. Пеш аз харид, тавсия дода мешавад, ки бо истеҳсолкунанда тасдиқ кунед, ки нӯгҳои филтр ба бренди пипеткаи истифодашаванда мувофиқат мекунанд.
2. Ташкили фазои корӣ ва таҷҳизот
Фазои корӣ бояд тавре ташкил карда шавад, ки ҷараёни кор дар як самт, аз ҷойҳои тоза (пеш аз PCR) то ҷойҳои ифлос (пас аз PCR) сурат гирад. Чораҳои умумии эҳтиётии зерин барои кам кардани эҳтимолияти ифлосшавӣ кӯмак мекунанд. Барои тайёр кардани омехтаи асосӣ, истихроҷи кислотаи нуклеинӣ ва илова кардани қолаби ДНК, тақвият ва коркарди маҳсулоти тақвиятшуда ва таҳлили маҳсулот, масалан, электрофорези гелӣ, утоқҳои алоҳидаи таъиншуда ё ҳадди ақал минтақаҳои аз ҷиҳати ҷисмонӣ ҷудошуда дошта бошед.
Дар баъзе ҳолатҳо, доштани 4 ҳуҷраи алоҳида душвор аст. Як варианти имконпазир, вале камтар матлуб ин анҷом додани омодасозии омехтаи асосӣ дар минтақаи нигоҳдорӣ, масалан, шкафи ҷараёни ламинарӣ мебошад. Дар мавриди тақвияти PCR-и дохилӣ, омодасозии омехтаи асосӣ барои аксуламали даври дуюм бояд дар минтақаи "тоза" барои омодасозии омехтаи асосӣ омода карда шавад, аммо эмгузаронӣ бо маҳсулоти асосии PCR бояд дар утоқи тақвият ва агар имкон бошад, дар минтақаи нигоҳдории махсус (масалан, шкафи ҷараёни ламинарӣ) анҷом дода шавад.
Ҳар як ҳуҷра/минтақа ба маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳои бо возеҳ нишондодашуда, нӯгҳои филтр, рафҳои найчаҳо, гирдобҳо, сентрифугаҳо (агар лозим бошад), қаламҳо, реагентҳои лаборатории умумӣ, халатҳои лабораторӣ ва қуттиҳои дастпӯшакҳо, ки дар ҷойҳои кории мувофиқи онҳо боқӣ мемонанд, ниёз дорад. Ҳангоми ҳаракат байни минтақаҳои муайяншуда дастҳо бояд шуста ва дастпӯшакҳо ва халатҳои лабораторӣ иваз карда шаванд. Реагентҳо ва таҷҳизот набояд аз ҷои ифлос ба ҷои тоза интиқол дода шаванд. Агар ҳолати фавқулоддае ба миён ояд, ки реагент ё қисме аз таҷҳизотро ба қафо интиқол додан лозим аст, он бояд аввал бо гипохлорити 10% натрий безарар карда шавад ва сипас бо оби стерилизатсияшуда пок карда шавад.
Шарҳ
Маҳлули 10%-и гипохлорити натрий бояд ҳар рӯз тару тоза тайёр карда шавад. Ҳангоми истифода барои безараргардонӣ, мӯҳлати тамос бо он бояд ҳадди ақал 10 дақиқа риоя карда шавад.
Интихобан, маҳсулоти дастраси тиҷорӣ, ки ҳамчун безараргардонии сатҳи ДНК-ро нобуд мекунанд, метавонанд истифода шаванд, агар тавсияҳои маҳаллии бехатарӣ истифодаи гипохлорити натрийро иҷозат надиҳанд ё гипохлорити натрий барои безараргардонии қисмҳои металлии таҷҳизот мувофиқ набошад.
Дар ҳолати беҳтарин, кормандон бояд ба этикаи ҷараёни кори яктарафа риоя кунанд ва дар ҳамон рӯз аз ҷойҳои ифлос (пас аз PCR) ба ҷойҳои тоза (пеш аз PCR) барнагарданд. Аммо, мавридҳое метавонанд бошанд, ки ин ногузир аст. Вақте ки чунин мавридҳо ба миён меоянд, кормандон бояд дастҳоро бодиққат бишӯянд, дастпӯшакҳоро иваз кунанд, либоси махсуси лабораториро истифода баранд ва ягон таҷҳизотеро, ки мехоҳанд аз утоқ берун бароранд, ба монанди китобҳои лабораторӣ, истифода набаранд. Чунин чораҳои назоратӣ бояд дар омӯзиши кормандон оид ба усулҳои молекулавӣ таъкид карда шаванд.
Пас аз истифода, ҷойҳои нишаст бояд бо 10% гипохлорити натрий (баъд аз он оби стерилизатсияшуда барои тоза кардани боқимондаҳои сафедкунанда), 70% этанол ё деконтаминанти ДНК-ро, ки аз ҷониби тиҷоратӣ дастрас аст, тоза карда шаванд. Дар ҳолати беҳтарин, чароғҳои ултрабунафш (UV) бояд насб карда шаванд, то безараргардонӣ тавассути шуоъдиҳӣ имконпазир бошад. Аммо, истифодаи чароғҳои UV бояд танҳо дар ҷойҳои кории пӯшида, масалан, шкафҳои бехатарӣ, маҳдуд карда шавад, то таъсири кормандони лабораторияро маҳдуд кунад. Лутфан, дастурҳои истеҳсолкунандаро оид ба нигоҳубини чароғҳои UV, вентилятсия ва тозакунӣ риоя кунед, то боварӣ ҳосил кунед, ки чароғҳо самаранок боқӣ мемонанд.
Агар ба ҷои гипохлориди натрий этаноли 70% истифода шавад, барои анҷом додани безараргардонӣ нури ултрабунафш истифода бурдан лозим аст.
Вортекс ва сентрифугаро бо гипохлориди натрий тоза накунед; ба ҷои ин, онро бо 70% этанол пок кунед ва ба нури ултрабунафш гузоред, ё аз деконтаминантҳои тиҷоратии нобудкунандаи ДНК истифода баред. Дар сурати рехтани маводи мухаддир, барои маслиҳатҳои бештари тозакунӣ бо истеҳсолкунанда тамос гиред. Агар дастурҳои истеҳсолкунанда иҷозат диҳанд, пипеткаҳо бояд мунтазам бо автоклав стерилизатсия карда шаванд. Агар пипеткаҳоро автоклав кардан имконнопазир бошад, бояд онҳоро бо гипохлориди 10% натрий (баъд аз он бо оби стерилизатсияшуда пурра тоза кунед) ё бо деконтаминантҳои тиҷоратии нобудкунандаи ДНК ва баъд аз он бо таъсири ултрабунафш тоза кардан кофист.
Тозакунӣ бо гипохлорити натрий бо фоизи баланд, агар мунтазам анҷом дода шавад, метавонад дар ниҳоят ба пластикҳо ва металлҳои пипетка зарар расонад; аввал тавсияҳои истеҳсолкунандаро тафтиш кунед. Ҳамаи таҷҳизот бояд мувофиқи ҷадвали тавсияшудаи истеҳсолкунанда мунтазам калибр карда шаванд. Шахси таъиншуда бояд масъули риояи ҷадвали калибркунӣ, нигоҳдории гузоришҳои муфассал ва нишонагузории хизматрасонии таҷҳизот бошад.
3. Маслиҳатҳо оид ба истифода ва тозакунӣ барои фазои молекулавии муайяншуда
Пеш аз PCR: Аликвот кардани реагентҳо / омодасозии омехтаи асосӣ: Ин бояд аз ҳама фазоҳое, ки барои тайёр кардани таҷрибаҳои молекулавӣ истифода мешаванд, тозатарин бошад ва дар ҳолати беҳтарин бояд як кабинаи ҷараёни ламинарии махсус бо нури ултрабунафш муҷаҳҳаз бошад. Намунаҳо, кислотаи нуклеинии истихроҷшуда ва маҳсулоти PCR-и тақвиятёфта набояд дар ин минтақа кор карда шаванд. Реагентҳои тақвият бояд дар яхдон (ё яхдон, мувофиқи тавсияҳои истеҳсолкунанда) дар ҳамон фазои таъиншуда, дар ҳолати беҳтарин дар паҳлӯи кабинаи ҷараёни ламинарӣ ё минтақаи пеш аз PCR нигоҳ дошта шаванд. Дастпӯшакҳо бояд ҳар дафъа ҳангоми ворид шудан ба минтақаи пеш аз PCR ё кабинаи ҷараёни ламинарӣ иваз карда шаванд.
Минтақаи пеш аз PCR ё шкафи ҷараёни ламинарӣ бояд пеш аз истифода ва баъд аз он чунин тоза карда шавад: Ҳамаи ашёҳои дар шкаф мавҷудбударо, масалан, пипеткаҳо, қуттиҳои нӯг, гирдоб, сентрифуга, рафҳои найчаҳо, қаламҳо ва ғайраро бо этаноли 70% ё деконтаминанти тиҷоратии нобудкунандаи ДНК пок кунед ва бигзоред, ки хушк шавад. Дар сурати минтақаи кории пӯшида, масалан, шкафи ҷараёни ламинарӣ, капотро барои 30 дақиқа дар зери нури ултрабунафш гузоред.
Шарҳ
Реагентҳоро дар зери таъсири нури ултрабунафш нагузоред; онҳоро танҳо пас аз тоза шудан ба шкаф гузаронед. Агар PCR транскрипсияи баръакс анҷом дода шавад, инчунин метавонад муфид бошад, ки сатҳҳо ва таҷҳизотро бо маҳлуле, ки ҳангоми тамос RNase-ро вайрон мекунад, тоза кунед. Ин метавонад барои пешгирӣ аз натиҷаҳои бардурӯғи манфӣ аз таҷзияи ферментии RNA кӯмак кунад. Пас аз безараргардонӣ ва пеш аз тайёр кардани омехтаи асосӣ, дастпӯшакҳо бояд бори дигар иваз карда шаванд ва сипас шкаф барои истифода омода мешавад.
Пре-PCR: Истихроҷи кислотаи нуклеинӣ/иловаи шаблон:
Кислотаи нуклеинӣ бояд дар минтақаи дуюми муайяншуда бо истифода аз маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳо, нӯгҳои филтр, рафҳои найчаҳо, дастпӯшакҳои нав, халатҳои лабораторӣ ва дигар таҷҳизот истихроҷ ва коркард карда шавад. Ин минтақа инчунин барои илова кардани шаблонҳо, идоракунӣ ва хатҳои тамоюл ба найчаҳо ё лавҳаҳои омехтаи асосӣ пешбинӣ шудааст. Барои пешгирӣ аз ифлосшавии намунаҳои кислотаи нуклеинии истихроҷшуда, ки таҳлил карда мешаванд, тавсия дода мешавад, ки пеш аз коркарди назорати мусбат ё стандартҳо дастпӯшакҳоро иваз кунед ва маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳоро истифода баред. Реагентҳои PCR ва маҳсулоти амплификатсияшуда набояд дар ин минтақа пипетка карда шаванд. Намунаҳо бояд дар яхдонҳо ё яхдонҳои махсус дар ҳамон минтақа нигоҳ дошта шаванд. Фазои кории намуна бояд ба ҳамон тарзе, ки фазои омехтаи асосӣ тоза карда шавад, тоза карда шавад.
Пас аз PCR: Амплификация ва коркарди маҳсулоти амплизатсияшуда
Ин фазои муайяншуда барои равандҳои пас аз тақвият пешбинӣ шудааст ва бояд аз ҷиҳати ҷисмонӣ аз минтақаҳои пеш аз PCR ҷудо бошад. Он одатан термоциклерҳо ва платформаҳои вақти воқеиро дар бар мегирад ва дар ҳолати зарурӣ бояд як кабинаи ҷараёни ламинарӣ барои илова кардани маҳсулоти PCR даври 1 ба реаксияи даври 2 дошта бошад, агар PCR-и дохилӣ анҷом дода шавад. Реагентҳои PCR ва кислотаи нуклеинии истихроҷшуда набояд дар ин минтақа кор кунанд, зеро хатари ифлосшавӣ баланд аст. Ин минтақа бояд маҷмӯи алоҳидаи дастпӯшакҳо, халатҳои лабораторӣ, рафҳои табақча ва найчаҳо, пипеткаҳо, нӯгҳои филтр, контейнерҳо ва дигар таҷҳизот дошта бошад. Найчаҳо бояд пеш аз кушодан сентрифуга карда шаванд. Фазои кории намуна бояд ба ҳамон тарзе, ки фазои омехтаи асосӣ тоза карда шавад, тоза карда шавад.
Пас аз PCR: Таҳлили маҳсулот
Ин ҳуҷра барои таҷҳизоти муайянкунии маҳсулот, масалан, зарфҳои электрофорези гелӣ, батареяҳои барқӣ, трансиллюминатори ултрабунафш ва системаи ҳуҷҷатгузории гелӣ пешбинӣ шудааст. Ин минтақа бояд маҷмӯи алоҳидаи дастпӯшакҳо, халатҳои лабораторӣ, рафҳои табақча ва найчаҳо, пипеткаҳо, нӯгҳои филтр, контейнерҳо ва дигар таҷҳизот дошта бошад. Ба ин минтақа ягон реагентҳои дигар, ба истиснои рангҳои боркунӣ, маркери молекулавӣ ва гели агарозӣ ва ҷузъҳои буферӣ, ворид карда намешаванд. Фазои кории намуна бояд ба ҳамон тарзе, ки фазои омехтаи асосӣ тоза карда шавад, тоза карда шавад.
Эзоҳи муҳим
Агар кор аллакай дар утоқҳои пас аз PCR анҷом дода шуда бошад, беҳтар аст, ки ба утоқҳои пеш аз PCR дар ҳамон рӯз ворид нашавед. Агар ин комилан ногузир бошад, аввал дастҳоро бодиққат шуста, дар утоқҳо либосҳои махсуси лабораторӣ пӯшидан лозим аст. Агар китобҳои лабораторӣ ва коғазҳои коғазӣ дар утоқҳои пеш аз PCR истифода шуда бошанд, набояд ба утоқҳои пеш аз PCR бурда шаванд; дар ҳолати зарурӣ, нусхаҳои такрории протоколҳо/шаҳодатномаҳои намунавӣ ва ғайраро гиред.
4. Маслиҳатҳои умумии биологияи молекулавӣ
Барои пешгирӣ аз монеаи озмоиш аз дастпӯшакҳои бе хока истифода баред. Усули дурусти пипетка барои кам кардани ифлосшавӣ муҳим аст. Пипеткакунии нодуруст метавонад боиси пошидани моеъҳо ҳангоми пошидани моеъҳо ва пайдоиши аэрозолҳо гардад. Таҷрибаи хуби пипеткакунии дурустро дар истинодҳои зерин пайдо кардан мумкин аст: Дастури Гилсон оид ба пипетка, видеоҳои техникаи пипеткакунии Аначем, найчаҳои сентрифуга пеш аз кушодан ва онҳоро бодиққат кушоед, то аз пошидани онҳо пешгирӣ карда шавад. Пас аз истифода найчаҳоро фавран пӯшед, то аз ворид шудани ифлоскунандаҳо пешгирӣ кунед.
Ҳангоми анҷом додани якчанд реаксия, як омехтаи асосӣ, ки дорои реактивҳои маъмулӣ (масалан, об, dNTP, буфер, праймерҳо ва фермент) мебошад, омода кунед, то шумораи интиқоли реактивҳо кам карда шавад ва хатари ифлосшавӣ кам карда шавад. Тавсия дода мешавад, ки омехтаи асосӣ дар ях ё блоки хунук ҷойгир карда шавад. Истифодаи ферменти "Оғози гарм" метавонад ба кам кардани истеҳсоли маҳсулоти ғайримушаххас мусоидат кунад. Реагентҳоеро, ки дорои зондҳои флуоресцентӣ мебошанд, аз нур муҳофизат кунед, то аз вайроншавӣ пешгирӣ кунед.
5. Назорати дохилӣ
Назорати мусбат ва манфии хуб тавсифшуда ва тасдиқшуда, инчунин назорати бе шаблон дар ҳама реаксияҳо ва хати тамоюли титршудаи бисёрнуқтаӣ барои реаксияҳои миқдорӣ дохил карда шавад. Назорати мусбат набояд он қадар қавӣ бошад, ки хатари ифлосшавиро ба вуҷуд орад. Ҳангоми иҷрои истихроҷи кислотаи нуклеинӣ, назорати истихроҷи мусбат ва манфии мусбатро дохил кунед.
Тавсия дода мешавад, ки дар ҳар як минтақа дастурҳои возеҳ овезон карда шаванд, то корбарон аз қоидаҳои рафтор огоҳ бошанд. Лабораторияҳои ташхисӣ, ки сатҳи хеле пасти ДНК ё РНК-ро дар намунаҳои клиникӣ муайян мекунанд, метавонанд чораи иловагии амниятиро дар бораи доштани системаҳои алоҳидаи коркарди ҳаво бо фишори ҳавои каме мусбат дар утоқҳои пеш аз PCR ва фишори ҳавои каме манфӣ дар утоқҳои пас аз PCR қабул кунанд.
Ниҳоят, таҳияи нақшаи кафолати сифат (QA) муфид аст. Чунин нақша бояд рӯйхати захираҳои асосии реагентҳо ва захираҳои корӣ, қоидаҳои нигоҳдории маҷмӯаҳо ва реагентҳо, гузоришдиҳии натиҷаҳои назорат, барномаҳои омӯзиши кормандон, алгоритмҳои ҳалли мушкилот ва чораҳои ислоҳӣ дар ҳолати заруриро дар бар гирад.
6. Феҳристи адабиёт
Аслан А, Кинзелман Ҷ, Дрелин Э, Ананьева Т, Лавандер Ҷ. Боби 3: Таъсиси лабораторияи qPCR. Ҳуҷҷати роҳнамо барои санҷиши обҳои фароғатӣ бо истифода аз усули qPCR USEPA 1611. Донишгоҳи давлатии Лансинг - Мичиган.
Тандурустии ҷамъиятии Англия, NHS. Стандартҳои Британияи Кабир барои таҳқиқоти микробиология: Амалияи хуби лабораторӣ ҳангоми гузаронидани санҷишҳои тақвияти молекулавӣ). Дастури сифат. 2013;4(4):1–15.
Миффлин Т. Таъсиси лабораторияи PCR. Протоколи Cold Spring Harb. 2007;7.
Шредер С 2013. Нигоҳдории мунтазами сентрифугаҳо: тозакунӣ, нигоҳдорӣ ва безараргардонии сентрифугаҳо, роторҳо ва адаптерҳо (Ҳуҷҷати сафед № 14). Ҳамбург: Эппендорф; 2013.
Виана Р.В., Уоллис К.Л. Амалияи хуби лаборатории клиникӣ (GCLP) барои санҷишҳои молекулавӣ, ки дар лабораторияҳои ташхисӣ истифода мешаванд, Дар: Акяр И., муҳаррир. Спектрҳои васеи назорати сифат. Риека, Хорватия: Intech; 2011: 29–52.
Вақти нашр: 16 июли соли 2020
