Mekhoa ea ho lemoha limolek'hule e na le bokhoni ba ho hlahisa bongata bo boholo ba nucleic acid ka ho eketsa bongata ba li-track tse fumanoang lisampoleng. Leha sena se le molemo bakeng sa ho nolofalletsa ho lemoha ka mokhoa o bonolo, se boetse se hlahisa monyetla oa ho silafatsoa ka ho ata ha li-aerosol tsa amplification tikolohong ea laboratori. Ha ho etsoa liteko, mehato e ka nkuoa ho qoba tšilafalo ea li-reagent, lisebelisoa tsa laboratori le sebaka sa benche, kaha tšilafalo e joalo e ka hlahisa liphetho tse fosahetseng (kapa tse fosahetseng).
Ho thusa ho fokotsa monyetla oa tšilafalo, Mekhoa e Metle ea Laboratori e lokela ho sebelisoa ka linako tsohle. Haholo-holo, mehato ea tlhokomelo e lokela ho nkuoa mabapi le lintlha tse latelang:
1. Ho sebetsana le li-reagent
2. Tlhophiso ea sebaka sa mosebetsi le lisebelisoa
3. Keletso ea tšebeliso le tlhoekiso bakeng sa sebaka se khethiloeng sa limolek'hule
4. Keletso e akaretsang ea baeloji ea limolek'hule
5. Litaolo tsa kahare
6. Buka ea Libuka
1. Ho sebetsana le li-reagent
Ka bokhutšoanyane, kenya lipeipi tsa reagent tsa centrifuge pele o li bula ho qoba tlhahiso ea li-aerosol. Kenya li-reagent ho qoba ho qhibiliha ka makhetlo a mangata le tšilafalo ea li-stock tse kholo. Ngola lipeipi tsohle tsa reagent le tsa karabelo ka ho hlaka 'me u boloke li-log tsa lot ea reagent le linomoro tsa batch tse sebelisitsoeng litekong tsohle. Phahamisa li-reagent tsohle le lisampole u sebelisa malebela a sefe. Pele u reka, ho eletsoa ho netefatsa le moetsi hore malebela a sefe a lumellana le mofuta oa pipette e tla sebelisoa.
2. Tlhophiso ea sebaka sa mosebetsi le lisebelisoa
Sebaka sa mosebetsi se lokela ho hlophisoa ho netefatsa hore phallo ea mosebetsi e etsahala ka lehlakoreng le le leng, ho tloha libakeng tse hloekileng (pele ho PCR) ho ea libakeng tse litšila (kamora PCR). Litemoso tse latelang tse akaretsang li tla thusa ho fokotsa monyetla oa tšilafalo. E-ba le likamore tse arohaneng tse khethiloeng, kapa bonyane libakeng tse arohaneng 'meleng, bakeng sa: ho lokisa motsoako oa mastermix, ho ntša nucleic acid le ho eketsa template ea DNA, ho eketsa le ho sebetsana le sehlahisoa se matlafalitsoeng, le tlhahlobo ea sehlahisoa, mohlala, gel electrophoresis.
Maemong a mang, ho ba le likamore tse 4 tse arohaneng ho thata. Khetho e ka khonehang empa e sa rateheng ke ho etsa tokisetso ea mastermix sebakeng sa containment, mohlala, khabinete ea phallo ea laminar. Tabeng ea ho eketsa PCR ka sehlaha, ho lokisa mastermix bakeng sa karabelo ea potoloho ea bobeli ho lokela ho lokisoa sebakeng se 'hloekileng' bakeng sa tokisetso ea mastermix, empa ente e nang le sehlahisoa sa mantlha sa PCR e lokela ho etsoa ka phapusing ea amplification, 'me haeba ho khoneha sebakeng se khethehileng sa containment (mohlala, khabinete ea phallo ea laminar).
Kamore/sebaka se seng le se seng se hloka sete e arohaneng ya di-pipette tse ngotsweng ka ho hlaka, dintlha tsa sefe, di-tube racks, di-vortexes, di-centrifuge (haeba ho hlokahala), dipene, di-reagent tsa laboratori tse tlwaelehileng, dijase tsa laboratori le mabokose a diatlana tse tla sala dibakeng tsa tsona tsa mosebetsi. Matsoho a lokela ho hlatsuwa mme diatlana le dijase tsa laboratori di fetolwe ha di tsamaya pakeng tsa dibaka tse kgethilweng. Di-reagent le disebediswa ha di a lokela ho tloswa sebakeng se ditshila ho ya sebakeng se hlwekileng. Haeba ho hlaha taba e feteletseng moo reagent kapa sesebediswa se hlokang ho kgutlisetswa morao, se lokela ho tloswa pele ka 10% sodium hypochlorite, e latelwe ke ho hlatswa ka metsi a hlwekileng.
Hlokomela
Tharollo ea sodium hypochlorite ea 10% e lokela ho etsoa e le foreshe letsatsi le letsatsi. Ha e sebelisoa bakeng sa ho hloekisa litšila, bonyane nako ea ho kopana le eona ea metsotso e 10 e lokela ho lateloa.
Ka tsela e 'ngoe, lihlahisoa tse fumanehang khoebong tse netefalitsoeng e le li-detaminant tse senyang DNA li ka sebelisoa haeba likhothaletso tsa polokeho ea lehae li sa lumelle tšebeliso ea sodium hypochlorite kapa haeba sodium hypochlorite e sa lokela ho hloekisa likarolo tsa tšepe tsa lisebelisoa.
Ka nepo, basebetsi ba lokela ho latela melao ea tsamaiso ea mosebetsi e le 'ngoe 'me ba se ke ba tloha libakeng tse litšila (kamora PCR) ba khutlela libakeng tse hloekileng (pele ho PCR) ka letsatsi lona leo. Leha ho le joalo, ho ka ba le linako tseo sena se ke keng sa qojoa. Ha ketsahalo e joalo e hlaha, basebetsi ba tlameha ho ela hloko ho hlatsoa matsoho ka botlalo, ho fetola liatlana, ho sebelisa seaparo se khethiloeng sa laboratori le ho se kenye lisebelisoa tseo ba tla batla ho li ntša ka phapusing hape, joalo ka libuka tsa laboratori. Mehato e joalo ea taolo e lokela ho hatisoa koetlisong ea basebetsi mabapi le mekhoa ea limolek'hule.
Kamora ho sebelisoa, libaka tsa benche li lokela ho hloekisoa ka 10% sodium hypochlorite (e lateloe ke metsi a hloekisitsoeng ho tlosa bleach e setseng), 70% ethanol, kapa setlolo se bolaeang DNA se fumanehang khoebong se netefalitsoeng. Ha e le hantle, mabone a ultra-violet (UV) a lokela ho kenngoa ho nolofalletsa ho hloekisa ka mahlaseli. Leha ho le joalo, tšebeliso ea mabone a UV e lokela ho lekanyetsoa libakeng tse koetsoeng tsa mosebetsi, mohlala, lik'habote tsa polokeho, e le ho fokotsa ho pepesehela mahlaseli a UV ha basebetsi ba laboratori. Ka kopo latela litaelo tsa moetsi bakeng sa tlhokomelo ea mabone a UV, moea o kenang le o hloekileng ho netefatsa hore mabone a lula a sebetsa.
Haeba ho sebediswa ethanol ya 70% ho ena le sodium hypochlorite, ho tla hlokahala mahlasedi a nang le lesedi la UV ho phethela ho hlwekisa.
O se ke wa hlwekisa vortex le centrifuge ka sodium hypochlorite; ho ena le hoo, hlakola ka 70% ethanol mme o e behe khanyeng ya UV, kapa o sebedise sebolaya dikokwana-hloko sa kgwebo se senyang DNA. Bakeng sa ho tsholoha, buisana le moetsi bakeng sa keletso e eketsehileng ya ho hlwekisa. Haeba ditaelo tsa moetsi di dumella, di-pipettes di lokela ho hlwekiswa ka ho hlwekisa ka autoclave. Haeba di-pipettes di sa kgone ho hlatsuwa ka autoclave, ho lokela ho lekana ho di hlwekisa ka 10% sodium hypochlorite (e latelwe ke ho hlakola ka botlalo ka metsi a hlwekileng) kapa ka sebolaya dikokwana-hloko sa kgwebo se senyang DNA se latelwang ke ho pepesehela UV.
Ho hlwekisa ka sodium hypochlorite e nang le karolo e phahameng ea peresente ho ka qetella ho sentse liphasetiki le litšepe tsa pipette haeba ho etsoa khafetsa; hlahloba likhothaletso tse tsoang ho moetsi pele. Lisebelisoa tsohle li hloka ho lekanngoa khafetsa ho latela kemiso e khothaletsoang ke moetsi. Motho ea khethiloeng o lokela ho ikarabella ho netefatsa hore kemiso ea ho lekanngoa e lateloa, li-log tse qaqileng lia bolokoa, 'me mabitso a litšebeletso a bontšitsoe ka ho hlaka lisebelisoa.
3. Keletso ea tšebeliso le tlhoekiso bakeng sa sebaka se khethiloeng sa limolek'hule
Pele ho PCR: Ho lokisa Reagent / mastermix: Ena e lokela ho ba sebaka se hloekileng ka ho fetisisa se sebelisetsoang ho lokisa liteko tsa limolek'hule 'me ka ho khetheha e lokela ho ba khabinete ea phallo ea laminar e khethiloeng e nang le leseli la UV. Disampole, nucleic acid e ntšitsoeng le lihlahisoa tsa PCR tse amplified ha lia lokela ho tšoaroa sebakeng sena. Li-reagent tsa amplification li lokela ho bolokoa ka sehatsetsing (kapa sehatsetsing, ho latela litlhahiso tsa moetsi) sebakeng se le seng se khethiloeng, ka ho khetheha haufi le khabinete ea phallo ea laminar kapa sebaka sa pele ho PCR. Liatlana li lokela ho fetoloa nako le nako ha li kena sebakeng sa pele ho PCR kapa khabinete ea phallo ea laminar.
Sebaka sa pele ho PCR kapa khabinete ea phallo ea laminar se lokela ho hloekisoa pele le ka mor'a tšebeliso ka tsela e latelang: Hlakola lintho tsohle tse ka har'a khabinete, mohlala, li-pipettes, mabokose a malelele, vortex, centrifuge, li-tube racks, lipene, jj. ka 70% ethanol kapa sesebelisoa sa khoebo se senyang DNA, 'me u se lumelle hore se ome. Tabeng ea sebaka sa mosebetsi se koetsoeng, mohlala, khabinete ea phallo ea laminar, pepesa hood khanyeng ea UV metsotso e 30.
Hlokomela
O se ke wa pepesetsa di-reagent khanyeng ya UV; di kenye feela ka hara khabinete hang ha e hlwekile. Haeba o etsa PCR ya reverse transcription, ho ka ba molemo hape ho hlakola bokahodimo le disebediswa ka tharollo e senyang di-RNase ha di kopana. Sena se ka thusa ho qoba diphetho tse fosahetseng tse tswang ho senyeha ha enzyme ya RNA. Kamora ho hlwekisa le pele o lokisa mastermix, diatlana di lokela ho fetolwa hape, ebe khabinete e se e loketse ho sebediswa.
Pele ho PCR: Ho ntšoa ha asiti ea nucleic/ho eketsa template:
Asiti ea nucleic e tlameha ho ntšoa le ho sebetsoa sebakeng sa bobeli se khethiloeng, ho sebelisoa sete e arohaneng ea li-pipettes, lintlheng tsa sefe, li-tube racks, liatlana tse foreshe, liaparo tsa laboratori le lisebelisoa tse ling. Sebaka sena se boetse se sebelisetsoa ho eketsa template, li-control le trendlines ho li-tubes kapa li-plate tsa mastermix. Ho qoba tšilafalo ea lisampole tsa nucleic acid tse ntšitsoeng tse ntseng li hlahlojoa, ho khothalletsoa ho fetola liatlana pele u sebetsana le li-control kapa maemo a matle le ho sebelisa sete e arohaneng ea li-pipettes. Li-reagent tsa PCR le lihlahisoa tse amplified ha lia lokela ho kenngoa li-pipettes sebakeng sena. Lisampole li lokela ho bolokoa ka har'a li-fridge kapa li-freezer tse khethiloeng sebakeng se le seng. Sebaka sa mosebetsi sa sampole se lokela ho hloekisoa ka tsela e tšoanang le sebaka sa mastermix.
Kamora PCR: Ho eketsa le ho sebetsana le sehlahisoa se matlafalitsoeng
Sebaka sena se kgethilweng ke sa ditshebetso tsa kamora ho amplification mme se lokela ho arolwa ka mmele ho dibaka tsa pele ho PCR. Hangata se na le di-thermocycler le di-platform tsa nako ya sebele, mme ka nepo se lokela ho ba le khabinete ya phallo ya laminar bakeng sa ho eketsa sehlahiswa sa round 1 PCR ho karabelo ya round 2, haeba ho etswa PCR e nang le sehlaha. Di-reagent tsa PCR le nucleic acid e ntshitsweng ha di a lokela ho sebetswa sebakeng sena kaha kotsi ya tšilafalo e hodimo. Sebaka sena se lokela ho ba le sete e arohaneng ya diatlana, dijase tsa laboratori, di-racks tsa poleiti le di-tube, di-pipettes, di-filter tips, di-bin le disebediswa tse ding. Di-tube di lokela ho kenngwa ka sentrifuge pele di bulwa. Sebaka sa mosebetsi sa sampole se lokela ho hlwekiswa ka tsela e tshwanang le sebaka sa mastermix.
Kamora PCR: Tlhahlobo ea sehlahisoa
Kamore ena ke ea lisebelisoa tsa ho lemoha lihlahisoa, mohlala, litanka tsa gel electrophoresis, lipakete tsa motlakase, transilluminator ea UV le sistimi ea litokomane tsa gel. Sebaka sena se lokela ho ba le lisete tse arohaneng tsa liatlana, liaparo tsa laboratori, li-rack tsa poleiti le li-tube, li-pipettes, lintlheng tsa sefe, lithōle le lisebelisoa tse ling. Ha ho li-reagent tse ling tse ka tlisoang sebakeng sena, ntle le dae ea ho kenya, lets'oao la molek'hule le gel ea agarose, le likarolo tsa buffer. Sebaka sa mosebetsi sa sampole se lokela ho hloekisoa ka tsela e tšoanang le sebaka sa mastermix.
Ntlha ea bohlokoa
Ka nepo, likamore tsa pele ho PCR ha lia lokela ho kenngoa ka letsatsi lona leo haeba mosebetsi o se o entsoe likamoreng tsa kamora PCR. Haeba sena se ke ke sa qojoa ka ho feletseng, etsa bonnete ba hore matsoho a hlatsuoa hantle pele le hore ho aparoa liaparo tse itseng tsa laboratori ka likamoreng. Libuka tsa laboratori le lipampiri ha lia lokela ho isoa likamoreng tsa pele ho PCR haeba li sebelisitsoe likamoreng tsa kamora PCR; haeba ho hlokahala, nka likhatiso tse peli tsa liprothokholi/li-ID tsa sampole, jj.
4. Keletso e akaretsang ea baeloji ea limolek'hule
Sebelisa liatlana tse se nang phofo ho qoba thibelo ea tlhahlobo. Mokhoa o nepahetseng oa ho kenya liphaephe ke oa bohlokoa ho fokotsa tšilafalo. Ho kenya liphaephe ka tsela e fosahetseng ho ka fella ka ho fafatsa ha ho ntšoa metsi le ho thehoa ha li-aerosol. Mokhoa o motle oa ho kenya liphaephe ka nepo o ka fumanoa lihokelong tse latelang: Tataiso ea Gilson ea ho kenya liphaephe, livideo tsa mokhoa oa ho kenya liphaephe tsa Anachem, liphaephe tsa Centrifuge pele li buloa, 'me u li bule ka hloko ho qoba ho fafatsa. Koala liphaephe hang ka mor'a tšebeliso ho qoba ho kenngoa ha litšila.
Ha o etsa dikarabelo tse ngata, lokisa mastermix e le nngwe e nang le di-reagent tse tlwaelehileng (mohlala, metsi, dNTPs, buffer, di-primer le enzyme) ho fokotsa palo ya diphetisetso tsa di-reagent le ho fokotsa tshoso ya tšilafalo. Ho kgothaletswa ho seta mastermix leqhoeng kapa sekoting se batang. Tshebediso ya enzyme ya Hot Start e ka thusa ho fokotsa tlhahiso ya dihlahiswa tse seng tse ikgethang. Sireletsa di-reagent tse nang le di-probe tsa fluorescent khanyeng e le ho qoba ho senyeha.
5. Litaolo tsa kahare
Kenyeletsa ditaolo tse ntle le tse mpe tse hlalositsweng hantle, tse tiisitsweng, hammoho le taolo e se nang template dikarabelong tsohle, le moedi wa dintlha tse ngata bakeng sa dikarabelo tsa bongata. Taolo e ntle ha ea lokela ho ba matla hoo e ka bakang kotsi ya tšilafalo. Kenyeletsa ditaolo tse ntle le tse mpe tsa ho ntsha ha o etsa ho ntsha nucleic acid.
Ho kgothaletswa hore ditaelo tse hlakileng di bewe sebakeng ka seng e le hore basebedisi ba tsebe melao ya boitshwaro. Dilaboratori tsa tlhahlobo tse fumanang maemo a tlase haholo a DNA kapa RNA disampoleng tsa bongaka di ka batla ho nka tekanyo e eketsehileng ya tshireletso ya ho ba le ditsamaiso tse arohaneng tsa ho tshwara moya tse nang le kgatello ya moya e ntle hanyane dikamoreng tsa pele ho PCR le kgatello ya moya e mpe hanyane dikamoreng tsa kamora PCR.
Qetellong, ho theha moralo oa netefatso ea boleng (QA) hoa thusa. Morero o joalo o lokela ho kenyelletsa lethathamo la li-stock tse kholo tsa reagent le li-stock tse sebetsang, melao ea ho boloka lisebelisoa le li-reagent, ho tlaleha liphetho tsa taolo, mananeo a koetliso ea basebetsi, li-algorithms tsa ho rarolla mathata le liketso tsa tokiso ha ho hlokahala.
6. Buka ea Libuka
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Khaolo ea 3: Ho theha laboratori ea qPCR. Tokomane ea tataiso bakeng sa ho leka metsi a boikhathollo ho sebelisoa mokhoa oa USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.
Bophelo ba Sechaba Engelane, NHS. Litekanyetso tsa UK bakeng sa lipatlisiso tsa microbiology: Mokhoa o Motle oa Laboratori ha ho etsoa liteko tsa ho eketsa limolek'hule). Tataiso ea Boleng. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Ho theha laboratori ea PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Tlhokomelo ya kamehla ya di-centrifuge: ho hlwekisa, ho hlokomela le ho bolaya dikokwana-hloko tsa di-centrifuge, di-rotor le di-adapter (Pampiri e Tshweu Nomoro ya 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Mokhoa o Motle oa Laboratori ea Bongaka (GCLP) bakeng sa liteko tse thehiloeng ho limolek'hule tse sebelisoang lilaboratoring tsa tlhahlobo, Ho: Akyar I, mohlophisi. Li-spectra tse pharaletseng tsa taolo ea boleng. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Nako ea poso: Phupu-16-2020
