आणविक परीक्षण के लिए क्या करें और क्या न करें

आणविक पहचान विधियों में नमूनों में पाई जाने वाली सूक्ष्म मात्राओं के प्रवर्धन द्वारा बड़ी मात्रा में न्यूक्लिक अम्ल उत्पन्न करने की क्षमता होती है। हालांकि यह संवेदनशील पहचान को सक्षम बनाने के लिए लाभकारी है, लेकिन इससे प्रयोगशाला के वातावरण में प्रवर्धन एरोसोल के प्रसार के माध्यम से संदूषण की संभावना भी उत्पन्न होती है। प्रयोग करते समय, अभिकर्मकों, प्रयोगशाला उपकरणों और बेंच स्थान के संदूषण से बचने के लिए उपाय किए जा सकते हैं, क्योंकि इस प्रकार के संदूषण से गलत-सकारात्मक (या गलत-नकारात्मक) परिणाम उत्पन्न हो सकते हैं।

संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, प्रयोगशाला में उचित प्रक्रियाओं का हमेशा पालन किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, निम्नलिखित बिंदुओं के संबंध में सावधानियां बरती जानी चाहिए:

1. अभिकर्मकों का प्रबंधन
2. कार्यक्षेत्र और उपकरणों का संगठन
3. निर्दिष्ट आणविक क्षेत्र के लिए उपयोग और सफाई संबंधी सलाह
4. सामान्य आणविक जीवविज्ञान संबंधी सलाह
5. आंतरिक नियंत्रण
6. संदर्भ सूची

1. अभिकर्मकों का प्रबंधन

एरोसोल बनने से बचने के लिए अभिकर्मक ट्यूबों को खोलने से पहले थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। बार-बार जमने और पिघलने से बचने और मास्टर स्टॉक के संदूषण से बचने के लिए अभिकर्मकों को छोटे-छोटे भागों में बाँटें। सभी अभिकर्मक और प्रतिक्रिया ट्यूबों पर स्पष्ट रूप से लेबल लगाएँ और तिथि अंकित करें, और सभी प्रयोगों में उपयोग किए गए अभिकर्मक के लॉट और बैच नंबरों का रिकॉर्ड रखें। सभी अभिकर्मकों और नमूनों को फिल्टर टिप्स का उपयोग करके पिपेट करें। खरीदने से पहले, निर्माता से यह पुष्टि करना उचित है कि फिल्टर टिप्स उपयोग किए जाने वाले पिपेट के ब्रांड के अनुरूप हैं या नहीं।

2. कार्यक्षेत्र और उपकरणों का संगठन

कार्यक्षेत्र को इस प्रकार व्यवस्थित किया जाना चाहिए कि कार्य का प्रवाह एक ही दिशा में हो, स्वच्छ क्षेत्रों (पीसीआर से पहले) से लेकर गंदे क्षेत्रों (पीसीआर के बाद) तक। निम्नलिखित सामान्य सावधानियां संदूषण की संभावना को कम करने में सहायक होंगी। मास्टरमिक्स तैयार करने, न्यूक्लिक एसिड निकालने और डीएनए टेम्पलेट जोड़ने, प्रवर्धन और प्रवर्धित उत्पाद को संभालने, और उत्पाद विश्लेषण (जैसे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) के लिए अलग-अलग कमरे या कम से कम भौतिक रूप से अलग क्षेत्र निर्धारित करें।

कुछ परिस्थितियों में, चार अलग-अलग कमरे रखना मुश्किल होता है। एक संभावित लेकिन कम सुविधाजनक विकल्प यह है कि मास्टरमिक्स की तैयारी किसी सुरक्षित क्षेत्र में की जाए, जैसे कि लैमिनार फ्लो कैबिनेट। नेस्टेड पीसीआर प्रवर्धन के मामले में, दूसरे चरण की प्रतिक्रिया के लिए मास्टरमिक्स की तैयारी मास्टरमिक्स तैयारी के लिए निर्धारित 'स्वच्छ' क्षेत्र में की जानी चाहिए, लेकिन प्राथमिक पीसीआर उत्पाद के साथ इनोक्यूलेशन प्रवर्धन कक्ष में किया जाना चाहिए, और यदि संभव हो तो किसी समर्पित सुरक्षित क्षेत्र (जैसे कि लैमिनार फ्लो कैबिनेट) में किया जाना चाहिए।

प्रत्येक कमरे/क्षेत्र में स्पष्ट रूप से लेबल किए गए पिपेट, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रैक, वर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज (यदि आवश्यक हो), पेन, सामान्य प्रयोगशाला अभिकर्मक, लैब कोट और दस्तानों के बक्से अलग-अलग होने चाहिए और अपने-अपने कार्यस्थलों पर रखे जाने चाहिए। निर्धारित क्षेत्रों के बीच आवागमन करते समय हाथों को धोना और दस्तानों और लैब कोट को बदलना अनिवार्य है। अभिकर्मकों और उपकरणों को किसी गंदे क्षेत्र से साफ क्षेत्र में नहीं ले जाना चाहिए। यदि किसी अत्यावश्यक स्थिति में किसी अभिकर्मक या उपकरण को वापस ले जाना आवश्यक हो, तो उसे पहले 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट से कीटाणुरहित करना चाहिए, उसके बाद रोगाणु रहित पानी से पोंछना चाहिए।

टिप्पणी

10% सोडियम हाइपोक्लोराइट का घोल प्रतिदिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए। कीटाणुशोधन के लिए उपयोग करते समय, कम से कम 10 मिनट का संपर्क समय अवश्य निर्धारित किया जाना चाहिए।
इसके अलावा, यदि स्थानीय सुरक्षा संबंधी सिफारिशें सोडियम हाइपोक्लोराइट के उपयोग की अनुमति नहीं देती हैं या यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट उपकरण के धात्विक भागों को कीटाणुरहित करने के लिए उपयुक्त नहीं है, तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऐसे उत्पादों का उपयोग किया जा सकता है जो डीएनए को नष्ट करने वाले सतह विसंक्रमणकारी के रूप में मान्य हैं।

आदर्श रूप से, कर्मचारियों को एकतरफ़ा कार्यप्रवाह के सिद्धांत का पालन करना चाहिए और एक ही दिन में गंदे क्षेत्रों (पीसीआर के बाद) से वापस साफ क्षेत्रों (पीसीआर से पहले) में नहीं जाना चाहिए। हालांकि, कभी-कभी ऐसा करना अपरिहार्य हो सकता है। ऐसी स्थिति में, कर्मचारियों को अपने हाथ अच्छी तरह से धोने, दस्ताने बदलने, निर्धारित लैब कोट पहनने और लैब की किताबें जैसी कोई भी ऐसी वस्तु अंदर न लाने का ध्यान रखना चाहिए जिसे वे बाद में कमरे से बाहर ले जाना चाहें। आणविक विधियों पर कर्मचारियों के प्रशिक्षण में ऐसे नियंत्रण उपायों पर जोर दिया जाना चाहिए।

उपयोग के बाद, प्रयोगशाला की सतह को 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (और फिर बचे हुए ब्लीच को हटाने के लिए रोगाणु रहित पानी से) या 70% इथेनॉल, या किसी प्रमाणित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए-नष्ट करने वाले विसंक्रमणक से साफ किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, विकिरण द्वारा विसंक्रमण को सक्षम करने के लिए पराबैंगनी (यूवी) लैंप लगाए जाने चाहिए। हालांकि, प्रयोगशाला कर्मचारियों के यूवी विकिरण के संपर्क को सीमित करने के लिए यूवी लैंप का उपयोग केवल बंद कार्य क्षेत्रों, जैसे सुरक्षा कैबिनेट, तक ही सीमित होना चाहिए। लैंप की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए कृपया यूवी लैंप की देखभाल, वेंटिलेशन और सफाई के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट के स्थान पर 70% इथेनॉल का उपयोग किया जाता है, तो विसंक्रमण को पूरा करने के लिए यूवी प्रकाश से विकिरण की आवश्यकता होगी।
वर्टेक्स और सेंट्रीफ्यूज को सोडियम हाइपोक्लोराइट से साफ न करें; इसके बजाय, 70% इथेनॉल से पोंछकर यूवी प्रकाश में रखें, या डीएनए नष्ट करने वाले किसी व्यावसायिक कीटाणुनाशक का उपयोग करें। रिसाव होने पर, आगे की सफाई संबंधी सलाह के लिए निर्माता से संपर्क करें। यदि निर्माता के निर्देश अनुमति देते हैं, तो पिपेट को नियमित रूप से ऑटोक्लेव द्वारा कीटाणुरहित किया जाना चाहिए। यदि पिपेट को ऑटोक्लेव नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट से साफ करना (और फिर कीटाणुरहित पानी से अच्छी तरह पोंछना) या डीएनए नष्ट करने वाले किसी व्यावसायिक कीटाणुनाशक से साफ करके यूवी प्रकाश में रखना पर्याप्त होगा।

उच्च प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइट से नियमित सफाई करने पर पिपेट के प्लास्टिक और धातु को नुकसान पहुँच सकता है; पहले निर्माता की सलाह अवश्य लें। सभी उपकरणों को निर्माता द्वारा अनुशंसित समय सारिणी के अनुसार नियमित रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। एक नामित व्यक्ति को यह सुनिश्चित करने का दायित्व सौंपा जाना चाहिए कि कैलिब्रेशन समय सारिणी का पालन किया जाए, विस्तृत रिकॉर्ड रखे जाएँ और उपकरणों पर सर्विस लेबल स्पष्ट रूप से प्रदर्शित हों।

3. निर्दिष्ट आणविक क्षेत्र के लिए उपयोग और सफाई संबंधी सलाह

प्री-पीसीआर: अभिकर्मक विभाजन/मास्टरमिक्स तैयार करना: आणविक प्रयोगों की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी स्थानों में यह सबसे स्वच्छ स्थान होना चाहिए और आदर्श रूप से यूवी प्रकाश से सुसज्जित एक निर्दिष्ट लैमिनार फ्लो कैबिनेट होना चाहिए। इस क्षेत्र में नमूनों, निकाले गए न्यूक्लिक एसिड और प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों को नहीं छूना चाहिए। प्रवर्धन अभिकर्मकों को उसी निर्दिष्ट स्थान पर, आदर्श रूप से लैमिनार फ्लो कैबिनेट या प्री-पीसीआर क्षेत्र के बगल में, फ्रीजर (या निर्माता की अनुशंसाओं के अनुसार रेफ्रिजरेटर) में रखा जाना चाहिए। प्री-पीसीआर क्षेत्र या लैमिनार फ्लो कैबिनेट में प्रवेश करते समय हर बार दस्ताने बदलने चाहिए।

प्री-पीसीआर क्षेत्र या लैमिनार फ्लो कैबिनेट को उपयोग से पहले और बाद में निम्नानुसार साफ किया जाना चाहिए: कैबिनेट में रखी सभी वस्तुओं, जैसे कि पिपेट, टिप बॉक्स, वर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रैक, पेन आदि को 70% इथेनॉल या किसी व्यावसायिक डीएनए-नष्ट करने वाले कीटाणुनाशक से पोंछकर सुखा लें। यदि कार्य क्षेत्र बंद है, जैसे कि लैमिनार फ्लो कैबिनेट, तो हुड को 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश में रखें।

टिप्पणी

अभिकर्मकों को पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में न आने दें; उन्हें कैबिनेट में तभी रखें जब वह पूरी तरह से साफ हो। यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर कर रहे हैं, तो सतहों और उपकरणों को ऐसे घोल से पोंछना उपयोगी हो सकता है जो आरएनएज़ को तुरंत नष्ट कर देता है। इससे आरएनए के एंजाइम द्वारा अपघटन के कारण आने वाले गलत-नकारात्मक परिणामों से बचा जा सकता है। कीटाणुशोधन के बाद और मास्टरमिक्स तैयार करने से पहले, दस्ताने एक बार फिर बदल लें, और फिर कैबिनेट उपयोग के लिए तैयार है।

प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण/टेम्प्लेट जोड़ना:

न्यूक्लिक एसिड को निकालने और संभालने के लिए एक अलग निर्दिष्ट क्षेत्र का उपयोग किया जाना चाहिए, जिसमें पिपेट, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रैक, नए दस्ताने, लैब कोट और अन्य उपकरणों का एक अलग सेट इस्तेमाल किया जाता है। यह क्षेत्र मास्टरमिक्स ट्यूब या प्लेट में टेम्पलेट, कंट्रोल और ट्रेंडलाइन डालने के लिए भी है। विश्लेषण किए जा रहे निकाले गए न्यूक्लिक एसिड नमूनों के संदूषण से बचने के लिए, पॉजिटिव कंट्रोल या स्टैंडर्ड को संभालने से पहले दस्ताने बदलने और पिपेट के एक अलग सेट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। पीसीआर अभिकर्मकों और प्रवर्धित उत्पादों को इस क्षेत्र में पिपेट से नहीं निकाला जाना चाहिए। नमूनों को उसी क्षेत्र में निर्दिष्ट फ्रिज या फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए। नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स क्षेत्र की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

पीसीआर के बाद की प्रक्रिया: प्रवर्धन और प्रवर्धित उत्पाद का प्रबंधन

यह निर्धारित स्थान प्रवर्धन के बाद की प्रक्रियाओं के लिए है और इसे पूर्व-पीसीआर क्षेत्रों से भौतिक रूप से अलग रखा जाना चाहिए। इसमें आमतौर पर थर्मोसाइक्लर और रीयल-टाइम प्लेटफॉर्म होते हैं, और आदर्श रूप से इसमें एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट होना चाहिए ताकि नेस्टेड पीसीआर किए जाने पर पहले चरण के पीसीआर उत्पाद को दूसरे चरण की प्रतिक्रिया में मिलाया जा सके। इस क्षेत्र में पीसीआर अभिकर्मकों और निकाले गए न्यूक्लिक अम्ल को नहीं छूना चाहिए क्योंकि संदूषण का खतरा अधिक होता है। इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फिल्टर टिप्स, डिब्बे और अन्य उपकरणों का एक अलग सेट होना चाहिए। ट्यूबों को खोलने से पहले सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए। नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स क्षेत्र की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

पोस्ट-पीसीआर: उत्पाद विश्लेषण

यह कमरा उत्पाद पहचान उपकरणों के लिए है, जैसे कि जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक, पावर पैक, यूवी ट्रांसइल्यूमिनेटर और जेल प्रलेखन प्रणाली। इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फिल्टर टिप्स, डिब्बे और अन्य उपकरणों के अलग-अलग सेट होने चाहिए। लोडिंग डाई, मॉलिक्यूलर मार्कर, एगारोज जेल और बफर घटकों को छोड़कर, इस क्षेत्र में कोई अन्य अभिकर्मक नहीं लाया जा सकता है। नमूना कार्यक्षेत्र को मास्टरमिक्स क्षेत्र की तरह ही साफ किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण नोट

आदर्श रूप से, यदि पोस्ट-पीसीआर कमरों में पहले से ही काम हो चुका है, तो उसी दिन प्री-पीसीआर कमरों में प्रवेश नहीं करना चाहिए। यदि यह बिल्कुल अपरिहार्य है, तो सुनिश्चित करें कि पहले हाथों को अच्छी तरह से धोया जाए और कमरों में विशिष्ट लैब कोट पहने जाएं। यदि लैब की किताबें और कागज़ात पोस्ट-पीसीआर कमरों में उपयोग किए गए हैं, तो उन्हें प्री-पीसीआर कमरों में नहीं ले जाना चाहिए; यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल/नमूना आईडी आदि के डुप्लिकेट प्रिंट-आउट ले लें।

4. सामान्य आणविक जीवविज्ञान संबंधी सलाह

परीक्षण में बाधा से बचने के लिए पाउडर रहित दस्तानों का प्रयोग करें। संदूषण को कम करने के लिए सही पिपेटिंग तकनीक अत्यंत महत्वपूर्ण है। गलत पिपेटिंग से तरल पदार्थ निकालते समय छींटे पड़ सकते हैं और एरोसोल बन सकते हैं। सही पिपेटिंग के लिए उपयोगी जानकारी निम्नलिखित लिंक पर उपलब्ध है: गिलसन की पिपेटिंग गाइड, एनाकेम पिपेटिंग तकनीक के वीडियो। ट्यूब खोलने से पहले उन्हें सेंट्रीफ्यूज करें और छींटे पड़ने से बचने के लिए उन्हें सावधानीपूर्वक खोलें। संदूषकों के प्रवेश को रोकने के लिए उपयोग के तुरंत बाद ट्यूबों को बंद कर दें।

कई अभिक्रियाएँ करते समय, सामान्य अभिकर्मकों (जैसे पानी, dNTPs, बफर, प्राइमर और एंजाइम) वाला एक मास्टरमिक्स तैयार करें ताकि अभिकर्मकों को बार-बार स्थानांतरित न करना पड़े और संदूषण का खतरा कम हो। मास्टरमिक्स को बर्फ या ठंडे ब्लॉक पर तैयार करने की सलाह दी जाती है। हॉट स्टार्ट एंजाइम का उपयोग करने से गैर-विशिष्ट उत्पादों के उत्पादन को कम करने में मदद मिल सकती है। फ्लोरोसेंट प्रोब वाले अभिकर्मकों को प्रकाश से बचाकर रखें ताकि वे खराब न हों।

5. आंतरिक नियंत्रण

सभी अभिक्रियाओं में सुस्थापित, पुष्ट सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के साथ-साथ बिना टेम्पलेट वाला नियंत्रण भी शामिल करें, और मात्रात्मक अभिक्रियाओं के लिए बहु-बिंदु अनुमापित प्रवृत्ति रेखा का प्रयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण इतना प्रबल नहीं होना चाहिए कि संदूषण का जोखिम उत्पन्न हो। न्यूक्लिक अम्ल निष्कर्षण करते समय सकारात्मक और नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रणों का प्रयोग करें।

यह सलाह दी जाती है कि प्रत्येक क्षेत्र में स्पष्ट निर्देश प्रदर्शित किए जाएं ताकि उपयोगकर्ता आचरण के नियमों से अवगत रहें। नैदानिक ​​नमूनों में डीएनए या आरएनए के बहुत कम स्तर का पता लगाने वाली निदान प्रयोगशालाएं अतिरिक्त सुरक्षा उपाय के रूप में प्री-पीसीआर कमरों में थोड़े सकारात्मक वायु दाब और पोस्ट-पीसीआर कमरों में थोड़े नकारात्मक वायु दाब वाले अलग-अलग वायु प्रबंधन प्रणालियों को अपनाना चाह सकती हैं।

अंत में, गुणवत्ता आश्वासन (क्यूए) योजना विकसित करना सहायक होता है। ऐसी योजना में अभिकर्मक मास्टर स्टॉक और वर्किंग स्टॉक की सूचियाँ, किट और अभिकर्मकों के भंडारण के नियम, नियंत्रण परिणामों की रिपोर्टिंग, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्या निवारण एल्गोरिदम और आवश्यकता पड़ने पर सुधारात्मक कार्रवाई शामिल होनी चाहिए।

6. संदर्भ सूची

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