Mbinu za kugundua molekuli zina uwezo wa kutoa kiasi kikubwa cha asidi ya kiini kupitia ukuzaji wa kiasi kidogo kinachopatikana katika sampuli. Ingawa hii ni muhimu kwa kuwezesha ugunduzi nyeti, pia inaleta uwezekano wa uchafuzi kupitia kuenea kwa erosoli za ukuzaji katika mazingira ya maabara. Wakati wa kufanya majaribio, hatua zinaweza kuchukuliwa ili kuepuka uchafuzi wa vitendanishi, vifaa vya maabara na nafasi ya benchi, kwani uchafuzi huo unaweza kutoa matokeo chanya ya uwongo (au hasi ya uwongo).
Ili kusaidia kupunguza uwezekano wa uchafuzi, Mazoezi Mazuri ya Maabara yanapaswa kutekelezwa wakati wote. Hasa, tahadhari zinapaswa kuchukuliwa kuhusu mambo yafuatayo:
1. Kushughulikia vitendanishi
2. Mpangilio wa nafasi ya kazi na vifaa
3. Ushauri wa matumizi na usafi kwa nafasi maalum ya molekuli
4. Ushauri wa jumla wa biolojia ya molekuli
5. Udhibiti wa ndani
6. Marejeleo
1. Kushughulikia vitendanishi
Kwa ufupi mirija ya vitendanishi vya centrifuge kabla ya kufunguliwa ili kuepuka uzalishaji wa erosoli. Weka vitendanishi sawa ili kuepuka kuyeyuka mara nyingi na uchafuzi wa hifadhi kuu. Weka lebo na tarehe wazi kwenye mirija yote ya vitendanishi na majibu na uhifadhi kumbukumbu za nambari za vitendanishi na kundi la vitendanishi vilivyotumika katika majaribio yote. Pipette vitendanishi na sampuli zote kwa kutumia vidokezo vya vichujio. Kabla ya kununua, inashauriwa kuthibitisha na mtengenezaji kwamba vidokezo vya vichujio vinafaa chapa ya bomba litakalotumika.
2. Mpangilio wa nafasi ya kazi na vifaa
Nafasi ya kazi inapaswa kupangwa ili kuhakikisha kwamba mtiririko wa kazi unafanyika katika mwelekeo mmoja, kutoka maeneo safi (kabla ya PCR) hadi maeneo machafu (baada ya PCR). Tahadhari zifuatazo za jumla zitasaidia kupunguza uwezekano wa uchafuzi. Kuwa na vyumba tofauti vilivyotengwa, au angalau maeneo tofauti kimwili, kwa: maandalizi ya mchanganyiko mkuu, uchimbaji wa asidi ya kiini na uongezaji wa kiolezo cha DNA, ukuzaji na utunzaji wa bidhaa iliyokuzwa, na uchambuzi wa bidhaa, k.m. gel electrophoresis.
Katika baadhi ya mipangilio, kuwa na vyumba 4 tofauti ni vigumu. Chaguo linalowezekana lakini lisilofaa ni kufanya maandalizi ya mchanganyiko mkuu katika eneo la kuzuia, k.m. kabati la mtiririko wa laminar. Katika kesi ya ukuzaji wa PCR uliowekwa kwenye kiota, maandalizi ya mchanganyiko mkuu kwa mmenyuko wa raundi ya pili yanapaswa kutayarishwa katika eneo 'safi' kwa ajili ya maandalizi ya mchanganyiko mkuu, lakini chanjo na bidhaa ya msingi ya PCR inapaswa kufanywa katika chumba cha kukuza, na ikiwezekana katika eneo maalum la kuzuia (k.m. kabati la mtiririko wa laminar).
Kila chumba/eneo linahitaji seti tofauti ya mabomba yenye lebo zilizo wazi, ncha za vichujio, raki za mirija, vortexes, centrifuges (ikiwa inafaa), kalamu, vitendanishi vya maabara vya kawaida, makoti ya maabara na masanduku ya glavu ambayo yatabaki kwenye vituo vyao vya kazi. Mikono lazima ioshwe na glavu na makoti ya maabara yabadilishwe wakati wa kusogea kati ya maeneo yaliyotengwa. Vitendanishi na vifaa havipaswi kuhamishwa kutoka eneo chafu hadi eneo safi. Ikiwa hali mbaya itatokea ambapo kitendanishi au kipande cha kifaa kinahitaji kuhamishwa nyuma, lazima kwanza kiondolewe uchafu na 10% ya sodiamu hipokloriti, ikifuatiwa na kuifuta kwa maji safi.
Dokezo
Mmumunyo wa 10% wa sodiamu hipokloriti lazima utengenezwe upya kila siku. Unapotumika kwa ajili ya kuondoa uchafu, muda wa chini wa kugusa wa dakika 10 unapaswa kufuatwa.
Vinginevyo, bidhaa zinazopatikana kibiashara ambazo zimethibitishwa kama viondoa uchafuzi wa uso vinavyoharibu DNA zinaweza kutumika ikiwa mapendekezo ya usalama wa ndani hayaruhusu matumizi ya hipokloriti ya sodiamu au ikiwa hipokloriti ya sodiamu haifai kwa kuondoa uchafuzi wa sehemu za chuma za vifaa.
Kwa hakika, wafanyakazi wanapaswa kufuata maadili ya mtiririko wa kazi wa mwelekeo mmoja na wasirudi kutoka maeneo machafu (baada ya PCR) hadi maeneo safi (kabla ya PCR) siku hiyo hiyo. Hata hivyo, kunaweza kuwa na matukio ambapo hili haliwezi kuepukika. Wakati tukio kama hilo linapotokea, wafanyakazi lazima waangalie kunawa mikono vizuri, kubadilisha glavu, kutumia koti la maabara lililoteuliwa na wasiingize vifaa vyovyote watakavyotaka kutoa nje ya chumba tena, kama vile vitabu vya maabara. Hatua hizo za udhibiti zinapaswa kusisitizwa katika mafunzo ya wafanyakazi kuhusu mbinu za molekuli.
Baada ya matumizi, nafasi za benchi zinapaswa kusafishwa kwa 10% ya sodiamu hipokloriti (ikifuatiwa na maji tasa ili kuondoa bleach iliyobaki), 70% ya ethanoli, au dawa ya kuua vijidudu inayopatikana kibiashara inayoweza kuharibu DNA. Kwa hakika, taa za ultra-violet (UV) zinapaswa kuwekwa ili kuwezesha kuondoa vijidudu kwa kutumia mionzi. Hata hivyo, matumizi ya taa za UV yanapaswa kuzuiwa katika maeneo ya kazi yaliyofungwa, k.m. makabati ya usalama, ili kupunguza mfiduo wa UV kwa wafanyakazi wa maabara. Tafadhali fuata maagizo ya mtengenezaji kuhusu utunzaji wa taa za UV, uingizaji hewa na usafi ili kuhakikisha kwamba taa zinabaki kuwa na ufanisi.
Ikiwa unatumia ethanoli 70% badala ya hipokloriti ya sodiamu, mionzi yenye mwanga wa UV itahitajika ili kukamilisha usafishaji.
Usisafisha vortex na centrifuge kwa kutumia hypochlorite ya sodiamu; badala yake, futa kwa ethanoli 70% na uweke kwenye mwanga wa UV, au tumia dawa ya kuua vijidudu inayoharibu DNA ya kibiashara. Kwa kumwagika, wasiliana na mtengenezaji kwa ushauri zaidi wa usafi. Ikiwa maelekezo ya mtengenezaji yanaruhusu, pipettes zinapaswa kusafishwa mara kwa mara kwa kutumia autoclave. Ikiwa pipettes haziwezi kufungwa otomatiki, inapaswa kutosha kuzisafisha kwa hypochlorite ya sodiamu 10% (ikifuatiwa na kuifuta kabisa kwa maji safi) au kwa dawa ya kuua vijidudu inayoharibu DNA ya kibiashara ikifuatiwa na mfiduo wa UV.
Kusafisha kwa kutumia hipokloriti ya sodiamu yenye asilimia kubwa kunaweza kuharibu plastiki na metali za bomba ikiwa kutafanywa mara kwa mara; angalia mapendekezo kutoka kwa mtengenezaji kwanza. Vifaa vyote vinahitaji kupimwa mara kwa mara kulingana na ratiba iliyopendekezwa na mtengenezaji. Mtu aliyeteuliwa anapaswa kuwa na jukumu la kuhakikisha kwamba ratiba ya urekebishaji inafuatwa, kumbukumbu za kina zinatunzwa, na lebo za huduma zinaonyeshwa wazi kwenye vifaa.
3. Ushauri wa matumizi na usafi kwa nafasi maalum ya molekuli
Kabla ya PCR: Utayarishaji wa vitendanishi / mchanganyiko mkuu: Hii inapaswa kuwa nafasi safi zaidi kati ya zote zinazotumika kwa ajili ya maandalizi ya majaribio ya molekuli na ikiwezekana iwe kabati la mtiririko wa laminar lililotengwa lenye mwanga wa UV. Sampuli, asidi ya kiini iliyotolewa na bidhaa za PCR zilizoongezwa hazipaswi kushughulikiwa katika eneo hili. Vitendanishi vya kuongeza vinapaswa kuwekwa kwenye friji (au jokofu, kulingana na mapendekezo ya mtengenezaji) katika nafasi ile ile iliyotengwa, ikiwezekana karibu na kabati la mtiririko wa laminar au eneo la kabla ya PCR. Glavu zinapaswa kubadilishwa kila wakati zinapoingia katika eneo la kabla ya PCR au kabati la mtiririko wa laminar.
Eneo la kabla ya PCR au kabati la mtiririko wa laminar linapaswa kusafishwa kabla na baada ya matumizi kama ifuatavyo: Futa vitu vyote kwenye kabati, k.m. pipettes, masanduku ya ncha, vortex, centrifuge, mirija ya kuwekea, kalamu, n.k. kwa ethanoli 70% au dawa ya kuua vijidudu inayoharibu DNA ya kibiashara, na uiache ikauke. Katika eneo la kazi lililofungwa, k.m. kabati la mtiririko wa laminar, weka kofia kwenye mwanga wa UV kwa dakika 30.
Dokezo
Usiwaachie vitendanishi kwenye mwanga wa UV; vihamishe tu kwenye kabati mara tu linapokuwa safi. Ukifanya PCR ya unukuzi wa kinyume, inaweza pia kuwa muhimu kufuta nyuso na vifaa kwa kutumia suluhisho linalovunja RNases zinapogusana. Hii inaweza kusaidia kuepuka matokeo hasi ya uwongo kutokana na uharibifu wa kimeng'enya cha RNA. Baada ya kuondoa uchafu na kabla ya kuandaa mchanganyiko mkuu, glavu zinapaswa kubadilishwa tena, na kisha kabati litakuwa tayari kutumika.
Kabla ya PCR: Uchimbaji/kuongeza kiolezo cha asidi ya nyuklia:
Asidi ya nyuklia lazima itolewe na kushughulikiwa katika eneo la pili lililotengwa, kwa kutumia seti tofauti ya pipettes, ncha za vichujio, raki za mirija, glavu mpya, koti za maabara na vifaa vingine. Eneo hili pia ni la kuongezwa kwa kiolezo, vidhibiti na mitindo kwenye mirija au sahani za mchanganyiko mkuu. Ili kuepuka uchafuzi wa sampuli za asidi ya nyuklia zilizotolewa zinazochambuliwa, inashauriwa kubadilisha glavu kabla ya kushughulikia vidhibiti au viwango chanya na kutumia seti tofauti ya pipettes. Vitendanishi vya PCR na bidhaa zilizoongezwa havipaswi kusafishwa katika eneo hili. Sampuli zinapaswa kuhifadhiwa kwenye friji au friji zilizotengwa katika eneo moja. Nafasi ya kazi ya sampuli inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mchanganyiko mkuu.
Baada ya PCR: Upanuzi na utunzaji wa bidhaa iliyopanuliwa
Nafasi hii iliyotengwa ni kwa ajili ya michakato ya baada ya ukuzaji na inapaswa kuwa tofauti kimwili na maeneo ya kabla ya PCR. Kwa kawaida huwa na vidhibiti joto na majukwaa ya wakati halisi, na ikiwezekana inapaswa kuwa na kabati la mtiririko la laminar kwa ajili ya kuongeza bidhaa ya PCR ya duara 1 kwenye mmenyuko wa duara 2, ikiwa PCR iliyo na kiota inafanywa. Vitendanishi vya PCR na asidi ya kiini iliyotolewa haipaswi kushughulikiwa katika eneo hili kwa sababu hatari ya uchafuzi ni kubwa. Eneo hili linapaswa kuwa na seti tofauti ya glavu, koti za maabara, raki za sahani na mirija, mabomba, ncha za vichujio, mapipa ya taka na vifaa vingine. Mirija lazima ifungwe kwa njia ya centrifuge kabla ya kufunguliwa. Nafasi ya kazi ya sampuli inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mchanganyiko mkuu.
Baada ya PCR: Uchambuzi wa bidhaa
Chumba hiki ni cha vifaa vya kugundua bidhaa, k.m. matangi ya electrophoresis ya jeli, pakiti za umeme, transilluminator ya UV na mfumo wa uandishi wa jeli. Eneo hili linapaswa kuwa na seti tofauti za glavu, koti za maabara, raki za sahani na mirija, mabomba, ncha za vichujio, mapipa ya taka na vifaa vingine. Hakuna vitendanishi vingine vinavyoweza kuletwa katika eneo hili, ukiondoa rangi ya upakiaji, alama ya molekuli na jeli ya agarose, na vipengele vya bafa. Nafasi ya kazi ya sampuli inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mchanganyiko mkuu.
Dokezo muhimu
Kwa hakika, vyumba vya kabla ya PCR havipaswi kuingizwa siku hiyo hiyo ikiwa kazi tayari imefanywa katika vyumba vya baada ya PCR. Ikiwa hili haliepukiki kabisa, hakikisha kwamba mikono inaoshwa vizuri kwanza na kwamba makoti maalum ya maabara huvaliwa katika vyumba. Vitabu na makaratasi ya maabara hayapaswi kupelekwa katika vyumba vya kabla ya PCR ikiwa yametumika katika vyumba vya baada ya PCR; ikiwa ni lazima, chukua nakala rudufu za itifaki/vitambulisho vya sampuli, n.k.
4. Ushauri wa jumla wa biolojia ya molekuli
Tumia glavu zisizo na unga ili kuepuka kizuizi cha kipimo. Mbinu sahihi ya kuweka mabomba ni muhimu sana katika kupunguza uchafuzi. Kuweka mabomba vibaya kunaweza kusababisha kumwagika wakati wa kutoa vimiminika na kuunda erosoli. Mbinu nzuri ya kuweka mabomba sahihi inaweza kupatikana katika viungo vifuatavyo: Mwongozo wa Gilson wa kuweka mabomba, video za mbinu ya kuweka mabomba ya Anachem, Mirija ya Centrifuge kabla ya kufungua, na uifungue kwa uangalifu ili kuepuka kumwagika. Funga mirija mara baada ya matumizi ili kuepuka kuingiza uchafu.
Unapofanya athari nyingi, andaa mchanganyiko mkuu mmoja wenye vitendanishi vya kawaida (km maji, dNTPs, bafa, primers na kimeng'enya) ili kupunguza idadi ya uhamisho wa vitendanishi na kupunguza tishio la uchafuzi. Inashauriwa kuweka mchanganyiko mkuu kwenye barafu au kizuizi cha baridi. Matumizi ya kimeng'enya cha Hot Start yanaweza kusaidia kupunguza uzalishaji wa bidhaa zisizo maalum. Linda vitendanishi vyenye probes za fluorescent kutoka kwa mwanga ili kuepuka uharibifu.
5. Udhibiti wa ndani
Jumuisha vidhibiti chanya na hasi vilivyothibitishwa vyema, pamoja na udhibiti usio na kiolezo katika athari zote, na mwelekeo wa mienendo ya kiasi yenye nukta nyingi. Udhibiti chanya haupaswi kuwa na nguvu sana kiasi kwamba unaleta hatari ya uchafuzi. Jumuisha vidhibiti chanya na hasi vya uchimbaji wakati wa uchimbaji wa asidi ya kiini.
Inashauriwa kwamba maagizo yaliyo wazi yaandikwe katika kila moja ya maeneo ili watumiaji wafahamu sheria za mwenendo. Maabara za uchunguzi zinazogundua viwango vya chini sana vya DNA au RNA katika sampuli za kliniki zinaweza kutaka kutumia kipimo cha ziada cha usalama cha kuwa na mifumo tofauti ya utunzaji wa hewa yenye shinikizo chanya kidogo la hewa katika vyumba vya kabla ya PCR na shinikizo hasi kidogo la hewa katika vyumba vya baada ya PCR.
Mwishowe, kutengeneza mpango wa uhakikisho wa ubora (QA) ni muhimu. Mpango kama huo unapaswa kujumuisha orodha ya hisa kuu za vitendanishi na hisa zinazofanya kazi, sheria za kuhifadhi vifaa na vitendanishi, kuripoti matokeo ya udhibiti, programu za mafunzo ya wafanyakazi, algoriti za utatuzi wa matatizo, na hatua za kurekebisha inapohitajika.
6. Marejeleo
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Sura ya 3: Kuanzisha maabara ya qPCR. Hati ya mwongozo wa kupima maji ya burudani kwa kutumia mbinu ya USEPA qPCR 1611. Lansing- Chuo Kikuu cha Jimbo la Michigan.
Afya ya Umma Uingereza, NHS. Viwango vya Uingereza vya uchunguzi wa mikrobiolojia: Utendaji Bora wa Maabara wakati wa kufanya majaribio ya ukuzaji wa molekuli). Mwongozo wa Ubora. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Kuanzisha maabara ya PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Matengenezo ya kawaida ya sentrifuji: kusafisha, matengenezo na kuua vijidudu vya sentrifuji, rotors na adapta (Karatasi Nyeupe Nambari 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Utendaji Mzuri wa Maabara ya Kliniki (GCLP) kwa ajili ya vipimo vya molekuli vinavyotumika katika maabara za uchunguzi, Katika: Akyar I, mhariri. Spektra pana ya udhibiti wa ubora. Rijeka, Kroatia: Intech; 2011: 29–52.
Muda wa chapisho: Julai-16-2020
