Àwọn ọ̀nà ìwádìí molikula ní agbára láti ṣe àgbékalẹ̀ ìwọ̀n nucleic acid púpọ̀ nípasẹ̀ ìdàgbàsókè iye àmì tí a rí nínú àwọn àyẹ̀wò. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé èyí ṣe àǹfààní fún ṣíṣe àwárí onímọ̀lára, ó tún ń mú kí ó ṣeé ṣe kí ó jẹ́ ...
Láti dín ewu kí ó má baà jẹ́, ó yẹ kí a máa lo Good Laboratory Practice ní gbogbo ìgbà. Ní pàtàkì, a gbọ́dọ̀ ṣọ́ra nípa àwọn kókó wọ̀nyí:
1. Bí a ṣe ń lo àwọn ohun èlò ìtọ́jú
2. Ajọ ti ibi iṣẹ ati ẹrọ
3. Ìmọ̀ràn nípa lílo àti ìmọ́tótó fún ààyè molikula tí a yàn
4. Ìmọ̀ràn gbogbogbò nípa ìmọ̀ nípa ẹ̀dá alààyè
5. Awọn iṣakoso inu
6. Ìwé Ìròyìn
1. Bí a ṣe ń lo àwọn ohun èlò ìtọ́jú
Fi centrifuge awọn ọpọn reagent sinu awọn tubes reagent ni kukuru ṣaaju ki o to ṣii lati yago fun idagbasoke awọn aerosols. Ya awọn reagent kuro lati yago fun ọpọlọpọ awọn didi-yo ati ibajẹ ti awọn iṣura akọkọ. Ṣe aami si gbogbo awọn ọpọn reagent ati awọn ọna ṣiṣe ni kedere ati ọjọ ati ṣetọju awọn akọọlẹ ti awọn nọmba reagent ati awọn nọmba ipele ti a lo ninu gbogbo awọn idanwo. Gbogbo awọn reagent ati awọn ayẹwo Pipette nipa lilo awọn imọran àlẹmọ. Ṣaaju ki o to ra, o ni imọran lati jẹrisi pẹlu olupese pe awọn opin àlẹmọ baamu ami iyasọtọ pipette ti a yoo lo.
2. Ajọ ti ibi iṣẹ ati ẹrọ
A gbọ́dọ̀ ṣètò ibi iṣẹ́ láti rí i dájú pé ìṣàn iṣẹ́ náà wáyé ní ọ̀nà kan, láti àwọn agbègbè mímọ́ (pre-PCR) sí àwọn agbègbè ẹlẹ́gbin (post-PCR). Àwọn ìṣọ́ra gbogbogbòò wọ̀nyí yóò ran lọ́wọ́ láti dín àǹfààní ìbàjẹ́ kù. Ní àwọn yàrá pàtó kan, tàbí ó kéré tán àwọn agbègbè tí ó yàtọ̀ síra, fún: ìpèsè mastermix, yíyọ nucleic acid kúrò àti fífi àwòṣe DNA kún un, fífúnni ní ìlọsókè àti mímú ọjà tí a ti mú pọ̀ sí i, àti ìwádìí ọjà, fún àpẹẹrẹ gel electrophoresis.
Ní àwọn ibi kan, ó ṣòro láti ní yàrá mẹ́rin ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀. Ọ̀nà tó ṣeé ṣe ṣùgbọ́n tí kò fi bẹ́ẹ̀ wù ni láti ṣe ìpèsè mastermix ní agbègbè ìpamọ́, fún àpẹẹrẹ àpótí ìṣàn laminar. Ní ti ìpèsè PCR tí a fi sínú àpò, ìpèsè mastermix fún ìyípadà ìpele kejì yẹ kí ó wà ní agbègbè 'mímọ́' fún ìpèsè mastermix, ṣùgbọ́n ìfúnni pẹ̀lú ọjà PCR àkọ́kọ́ yẹ kí ó wà ní yàrá ìfúnni, àti bí ó bá ṣeé ṣe ní agbègbè ìpamọ́ pàtó kan (fún àpẹẹrẹ àpótí ìṣàn laminar).
Yàrá/àgbègbè kọ̀ọ̀kan nílò àkójọpọ̀ àwọn pipette tí a fi àmì sí, àwọn àtẹ̀gùn àlẹ̀mọ́, àwọn àgbékalẹ̀ tube, vortexes, centrifuges (tí ó bá yẹ), àwọn pẹ́n, àwọn reagents yàrá gbogbogbò, àwọn aṣọ yàrá àti àpótí àwọn ibọ̀wọ́ tí yóò wà ní àwọn ibi iṣẹ́ wọn. A gbọ́dọ̀ fọ ọwọ́ wa kí a sì yí ibọ̀wọ́ àti aṣọ yàrá padà nígbà tí a bá ń gbéra láàárín àwọn agbègbè tí a yàn. A kò gbọdọ̀ gbé àwọn reagents àti ohun èlò láti ibi tí ó dọ̀tí sí agbègbè tí ó mọ́. Tí ọ̀ràn bá le koko bá ṣẹlẹ̀ níbi tí a bá nílò láti gbé reagent tàbí ohun èlò padà sẹ́yìn, a gbọ́dọ̀ kọ́kọ́ fi 10% sodium hypochlorite nu ún, lẹ́yìn náà ni kí a fi omi mímọ́ wẹ̀ ẹ́.
Àkíyèsí
Omi sodium hypochlorite 10% gbọ́dọ̀ jẹ́ tuntun lójoojúmọ́. Tí a bá lò ó fún pípa àbàwọ́n náà, ó yẹ kí a tẹ̀lé àkókò tí ó kéré jù fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá.
Ni omiiran, awọn ọja ti o wa ni iṣowo ti a fọwọsi gẹgẹbi awọn ohun elo imukuro oju ilẹ ti o n pa DNA run le ṣee lo ti awọn iṣeduro aabo agbegbe ko ba gba laaye lilo sodium hypochlorite tabi ti sodium hypochlorite ko ba yẹ fun imukuro awọn ẹya irin ti ẹrọ naa.
Ó dára jù, àwọn òṣìṣẹ́ gbọ́dọ̀ tẹ̀lé ìlànà iṣẹ́ tí ó wà ní ọ̀nà kan ṣoṣo, kí wọ́n má sì kúrò ní àwọn ibi tí ó dọ̀tí (lẹ́yìn PCR) padà sí àwọn ibi tí ó mọ́ (ṣáájú PCR) ní ọjọ́ kan náà. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àkókò kan lè wà tí èyí kò ṣeé yẹ̀ sílẹ̀. Nígbà tí irú ìṣẹ̀lẹ̀ bẹ́ẹ̀ bá ṣẹlẹ̀, àwọn òṣìṣẹ́ gbọ́dọ̀ ṣọ́ra láti fọ ọwọ́ wọn dáadáa, yí ibọ̀wọ́ padà, lo aṣọ yàrá tí a yàn fún wọn, kí wọ́n má sì ṣe fi ohun èlò tí wọ́n fẹ́ mú jáde kúrò nínú yàrá náà, bí ìwé yàrá. Irú àwọn ìgbésẹ̀ ìṣàkóso bẹ́ẹ̀ yẹ kí a tẹnu mọ́ nígbà tí a bá ń kọ́ àwọn òṣìṣẹ́ nípa àwọn ọ̀nà tí ó wà nínú mọ́líkúùkì.
Lẹ́yìn lílò, ó yẹ kí a fi 10% sodium hypochlorite nu àwọn àyè ìjókòó (lẹ́yìn náà ni a ó fi omi aláìléèérí mú kúrò nínú bleach), 70% ethanol, tàbí ohun ìpalára tó ń pa DNA run tí ó wà ní ọjà. Ó dára jù pé kí a fi àwọn fìtílà ultraviolet (UV) sí àwọn ibi iṣẹ́ tí a ti sé mọ́, fún àpẹẹrẹ àwọn kọ́bọ̀ọ̀dù ààbò, kí a lè dín ìfarahàn UV tí àwọn òṣìṣẹ́ yàrá ìwádìí yóò ní kù. Jọ̀wọ́ tẹ̀lé àwọn ìlànà olùpèsè fún ìtọ́jú fìtílà UV, afẹ́fẹ́ àti ìwẹ̀nùmọ́ kí àwọn fìtílà náà lè máa ṣiṣẹ́ dáadáa.
Tí o bá ń lo ethanol 70% dípò sodium hypochlorite, ìtànṣán pẹ̀lú ìmọ́lẹ̀ UV yóò nílò láti parí ìtúpalẹ̀ náà.
Má ṣe fi sodium hypochlorite nu vortex àti centrifuge náà; dípò bẹ́ẹ̀, fi ethanol 70% nu ú kí o sì fi sí ìmọ́lẹ̀ UV, tàbí lo ohun èlò ìpalára DNA tí ń pa á run. Fún ìtújáde, bá olùpèsè sọ̀rọ̀ fún ìmọ̀ràn ìmọ́tótó síwájú sí i. Tí ìtọ́ni olùpèsè bá gbà á láàyè, ó yẹ kí a máa fi autoclave pa àwọn pipettes mọ́ déédéé. Tí a kò bá lè pa àwọn pipettes mọ́, ó yẹ kí ó tó láti fi sodium hypochlorite 10% nu wọ́n (lẹ́yìn náà, kí a fi omi aláìlera nu ú pátápátá) tàbí pẹ̀lú ohun èlò ìpalára DNA tí ń pa á run lẹ́yìn náà kí a sì fi UV hàn.
Fífọmọ́ pẹ̀lú sodium hypochlorite tó ní ìwọ̀n gíga lè ba àwọn pipette àti irin jẹ́ nígbẹ̀yìn-gbẹ́yín tí a bá ń ṣe é déédéé; kọ́kọ́ ṣàyẹ̀wò àwọn àbá láti ọ̀dọ̀ olùpèsè. Gbogbo ohun èlò gbọ́dọ̀ wà ní ìwọ̀n déédéé gẹ́gẹ́ bí ìṣètò tí olùpèsè dámọ̀ràn. Ẹni tí a yàn yẹ kí ó jẹ́ olórí láti rí i dájú pé a tẹ̀lé ìṣètò ìṣàtúnṣe náà, a ń tọ́jú àkọsílẹ̀ kíkún, àti pé a ń fi àwọn àmì iṣẹ́ hàn kedere lórí ohun èlò náà.
3. Ìmọ̀ràn nípa lílo àti ìmọ́tótó fún ààyè molikula tí a yàn
Ṣáájú PCR: Ṣíṣe àtúnṣe àtúnṣe àtúnṣe/ìpèsè mastermix: Èyí yẹ kí ó jẹ́ ibi tí ó mọ́ jùlọ nínú gbogbo àwọn ààyè tí a lò fún ṣíṣe àwọn àyẹ̀wò molecule, ó sì yẹ kí ó jẹ́ àpótí ìṣàn laminar tí a yàn tí a fi ìmọ́lẹ̀ UV ṣe. Àwọn àpẹẹrẹ, nucleic acid tí a yọ jáde àti àwọn ọjà PCR tí a ti mú pọ̀ sí i kò gbọdọ̀ ṣe é ní agbègbè yìí. Àwọn ohun èlò ìṣàn amplification gbọ́dọ̀ wà nínú firisa (tàbí fìríìjì, gẹ́gẹ́ bí àwọn olùpèsè ṣe gbà nímọ̀ràn) ní ààyè kan náà, ó yẹ kí ó wà lẹ́gbẹ̀ẹ́ àpótí ìṣàn laminar tàbí agbègbè PCR tí a ti mú ṣáájú. A gbọ́dọ̀ yí àwọn ibọ̀wọ́ padà nígbàkúgbà tí a bá wọ inú agbègbè PCR tàbí àpótí ìṣàn laminar.
A gbọ́dọ̀ fọ agbègbè PCR tàbí àpótí ìṣàn laminar kí a tó lò ó àti lẹ́yìn lílò rẹ̀ gẹ́gẹ́ bí a ṣe tẹ̀lé: Nu gbogbo àwọn ohun tí ó wà nínú àpótí náà, fún àpẹẹrẹ, àwọn pipettes, àpótí ìsàlẹ̀, vortex, centrifuge, àwọn pákó ìṣàn, àwọn pẹ́ń, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ pẹ̀lú ethanol 70% tàbí ohun tí ó ń pa DNA run, kí o sì jẹ́ kí ó gbẹ. Tí ibi iṣẹ́ bá ti sé, fún àpẹẹrẹ àpótí ìṣàn laminar, fi ìbòrí náà sí ìmọ́lẹ̀ UV fún ọgbọ̀n ìṣẹ́jú.
Àkíyèsí
Má ṣe fi àwọn ohun èlò tí a fi ń ṣe àtúnṣe sí ìmọ́lẹ̀ UV; o lè gbé wọn sínú àpótí nígbà tí ó bá ti mọ́. Tí o bá ń lo PCR ìkọ̀wé ìyípadà, ó tún lè wúlò láti nu àwọn ojú ilẹ̀ àti ohun èlò pẹ̀lú omi tí ó ń ba àwọn RNAse jẹ́ nígbà tí ó bá fara kan ara wọn. Èyí lè ran lọ́wọ́ láti yẹra fún àwọn àbájáde èké tí ó lè jẹ́ àìdára láti inú ìbàjẹ́ enzyme ti RNA. Lẹ́yìn ìtúpalẹ̀ àti kí o tó ṣe àtúnṣe mastermix, ó yẹ kí o yí àwọn ibọ̀wọ́ padà lẹ́ẹ̀kan sí i, lẹ́yìn náà àpótí náà ti ṣetán láti lò.
Ṣáájú PCR: Ìyọkúrò/àfikún àwòṣe nucleic acid:
A gbọ́dọ̀ fa ásíìdì nucleic jáde kí a sì tọ́jú rẹ̀ ní agbègbè kejì tí a yàn, nípa lílo àwọn pipettes ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, àwọn àlẹ̀mọ́ àlẹ̀mọ́, àwọn àgbékalẹ̀ tube, àwọn ibọ̀wọ́ tuntun, àwọn aṣọ yàrá àti àwọn ohun èlò míràn. Agbègbè yìí tún wà fún àfikún àwọn template, àwọn ìṣàkóso àti àwọn ìlà ìṣàpẹẹrẹ sí àwọn mastermix tube tàbí àwọn àwo. Láti yẹra fún ìbàjẹ́ àwọn àpẹẹrẹ nucleic acid tí a yọ jáde tí a ń ṣàyẹ̀wò, a gbani nímọ̀ràn láti yí àwọn ibọ̀wọ́ padà kí a tó lo àwọn ìṣàkóso tàbí ìlànà rere àti láti lo àwọn pipettes ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀. Àwọn reagents PCR àti àwọn ọjà tí a ti mú pọ̀ sí i kò gbọdọ̀ di pipette ní agbègbè yìí. Àwọn àpẹẹrẹ yẹ kí a tọ́jú sínú àwọn fìríìjì tàbí firíìjì ní agbègbè kan náà. A gbọ́dọ̀ fọ ibi iṣẹ́ àpẹẹrẹ náà mọ́ ní ọ̀nà kan náà gẹ́gẹ́ bí ibi mastermix náà ṣe rí.
Lẹ́yìn PCR: Ṣíṣe àfikún àti mímú ọjà tí a ti mú pọ̀ sí i
Ààyè tí a yàn yìí wà fún àwọn iṣẹ́ lẹ́yìn ìdàgbàsókè, ó sì yẹ kí ó yàtọ̀ sí àwọn agbègbè tí a ti ṣe PCR tẹ́lẹ̀. Ó sábà máa ń ní àwọn ohun èlò thermocycler àti àwọn ìpele gidi-akoko, ó sì dára kí ó ní àpótí ìṣàn laminar fún fífi ọjà PCR yíká 1 kún ìṣe ìyípadà yíká 2, tí a bá ń ṣe PCR tí a ti fi sínú ìtò. A kò gbọdọ̀ lo àwọn ohun èlò PCR àti nucleic acid tí a yọ jáde ní agbègbè yìí nítorí pé ewu ìbàjẹ́ ga. Agbègbè yìí yẹ kí ó ní àwọn ibọ̀wọ́ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, àwọn aṣọ yàrá, àwọn àwo àti àwọn àpò ìtútù, àwọn pipettes, àwọn àlẹ̀mọ́ àlẹ̀, àwọn àpótí àti àwọn ohun èlò míràn. A gbọ́dọ̀ fi centrifuge sí àwọn tube kí a tó ṣí i. A gbọ́dọ̀ fọ ibi iṣẹ́ àpẹẹrẹ náà mọ́ ní ọ̀nà kan náà gẹ́gẹ́ bí ibi tí a ti ṣe àpò ìtútù.
Lẹ́yìn PCR: Ìṣàyẹ̀wò ọjà
Yàrá yìí wà fún àwọn ohun èlò ìwádìí ọjà, fún àpẹẹrẹ àwọn táńkì electrophoresis gel, àwọn àpò agbára, transilluminator UV àti ètò ìwé-ẹ̀rí gel. Agbègbè yìí yẹ kí ó ní àwọn ìbọ̀wọ́ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, àwọn aṣọ yàrá, àwọn àpò àti àwọn àpò tube, àwọn pipettes, àwọn àlẹ̀mọ́ àlẹ̀mọ́, àwọn àpótí àti àwọn ohun èlò míràn. A kò le mú àwọn ohun èlò míràn wá sí agbègbè yìí, yàtọ̀ sí àwọ̀ tí a fi ń rù ú, àmì molecular àti gel agarose, àti àwọn èròjà buffer. A gbọ́dọ̀ fọ ibi iṣẹ́ àpẹẹrẹ náà ní ọ̀nà kan náà tí a fi ń fọ ààyè mastermix.
Àkíyèsí pàtàkì
Ó dára jù, a kò gbọdọ̀ wọ àwọn yàrá tí a ti ṣe PCR ní ọjọ́ kan náà tí a bá ti ṣe iṣẹ́ náà ní àwọn yàrá lẹ́yìn PCR. Tí èyí bá jẹ́ ohun tí a kò lè yẹ̀ sílẹ̀ pátápátá, rí i dájú pé a kọ́kọ́ fọ ọwọ́ wa dáadáa àti pé a wọ àwọn aṣọ yàrá pàtó kan nínú àwọn yàrá náà. A kò gbọdọ̀ gbé àwọn ìwé yàrá àti ìwé iṣẹ́ sínú àwọn yàrá tí a ti ṣe PCR tẹ́lẹ̀ tí a bá ti lò wọ́n ní àwọn yàrá lẹ́yìn PCR; tí ó bá pọndandan, mú àwọn àtẹ̀jáde ìtẹ̀jáde tí ó jọra ti àwọn ìlànà/ìdámọ̀ àpẹẹrẹ, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ.
4. Ìmọ̀ràn gbogbogbò nípa ìmọ̀ nípa ẹ̀dá alààyè
Lo awọn ibọwọ ti ko ni lulú lati yago fun idena idanwo. Ọna pipe ti o tọ jẹ pataki julọ lati dinku idoti. Pipe ti ko tọ le ja si fifọ omi nigbati o ba n fun awọn olomi ati ṣiṣẹda awọn aerosols. A le rii ilana ti o dara fun pipetting ti o tọ ni awọn ọna asopọ wọnyi: Itọsọna Gilson si pipetting, awọn fidio ilana pipetting Anachem, awọn tube Centrifuge ṣaaju ki o to ṣii, ki o si ṣi wọn pẹlu iṣọra lati yago fun fifọ omi. Ti awọn tube lẹsẹkẹsẹ lẹhin lilo lati yago fun ifihan awọn idoti.
Nígbà tí o bá ń ṣe ọ̀pọ̀ ìṣesí, pèsè mastermix kan tí ó ní àwọn reagents tí a sábà máa ń lò (fún àpẹẹrẹ omi, dNTPs, buffer, primers àti enzyme) láti dín iye àwọn ìyípadà reagents kù àti láti dín ewu ìbàjẹ́ kù. A gbani nímọ̀ràn láti ṣètò mastermix lórí yìnyín tàbí block tútù. Lílo enzyme Hot Start lè ran lọ́wọ́ láti dín ìṣelọ́pọ́ àwọn ọjà tí kì í ṣe pàtó kù. Dáàbò bo àwọn reagents tí ó ní fluorescent probes kúrò nínú ìmọ́lẹ̀ láti yẹra fún ìbàjẹ́.
5. Awọn iṣakoso inu
Fi àwọn ìṣàkóso rere àti odi tí a ti fìdí rẹ̀ múlẹ̀ kún un, pẹ̀lú ìṣàkóso tí kò ní àwòṣe nínú gbogbo àwọn ìṣesí, àti ìlà ìṣàfihàn ọ̀pọ̀lọpọ̀ àmì fún àwọn ìṣesí iye. Ìṣàkóso rere kò gbọdọ̀ lágbára tó bẹ́ẹ̀ tí ó fi lè fa ewu ìbàjẹ́. Fi àwọn ìṣàkóso ìyọkúrò rere àti odi kún un nígbà tí a bá ń ṣe ìyọkúrò nucleic acid.
A gbani nímọ̀ràn pé kí a gbé àwọn ìlànà tó ṣe kedere sí àwọn agbègbè kọ̀ọ̀kan kí àwọn olùlò lè mọ̀ nípa àwọn òfin ìwà rere. Àwọn yàrá ìwádìí tó ń ṣàwárí ìwọ̀n DNA tàbí RNA tó kéré gan-an nínú àwọn àyẹ̀wò ìṣègùn lè fẹ́ láti lo ìlànà ààbò afikún ti níní àwọn ètò ìtọ́jú afẹ́fẹ́ tó yàtọ̀ síra pẹ̀lú ìfúnpá afẹ́fẹ́ tó dára díẹ̀ nínú àwọn yàrá ṣáájú PCR àti ìfúnpá afẹ́fẹ́ tó burú díẹ̀ nínú àwọn yàrá lẹ́yìn PCR.
Níkẹyìn, ṣíṣe ètò ìdánilójú dídára (QA) wúlò. Irú ètò bẹ́ẹ̀ yẹ kí ó ní àkójọ àwọn ọjà àkójọpọ̀ àti ọjà iṣẹ́, àwọn òfin fún títọ́jú àwọn ohun èlò àti àwọn ohun èlò ìtọ́jú, ìròyìn àwọn àbájáde ìṣàkóso, àwọn ètò ìdánilẹ́kọ̀ọ́ òṣìṣẹ́, àwọn algoridimu ìṣòro, àti àwọn ìgbésẹ̀ àtúnṣe nígbà tí ó bá yẹ.
6. Ìwé Ìròyìn
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Orí Kẹta: Ṣíṣe àgbékalẹ̀ yàrá qPCR kan. Ìwé ìtọ́sọ́nà fún dídánwò omi ìtura nípa lílo ọ̀nà USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.
Ìlera Àpapọ̀ England, NHS. Àwọn ìlànà UK fún ìwádìí microbiology: Ìdánrawò Ilé Ìwòsàn Dáradára nígbà tí a bá ń ṣe àwọn àyẹ̀wò ìdàgbàsókè molikula). Ìtọ́sọ́nà Dídára. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Ṣíṣe àgbékalẹ̀ yàrá PCR kan. Ìlànà Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Ìtọ́jú àwọn centrifuges déédéé: ìwẹ̀nùmọ́, ìtọ́jú àti ìpalára àwọn centrifuges, rotors àti adapters (White paper No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Iṣẹ́ Àyẹ̀wò Ìṣègùn Tó Dáa (GCLP) fún àwọn ìdánwò tí a lò nínú àwọn yàrá ìwádìí, Nínú: Akyar I, olóòtú. Ìwòye gbogbogbòò ti ìṣàkóso dídára. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Oṣù Keje-16-2020
