Afaka mamokatra asidra nokleika be dia be ny fomba fitiliana molekiola amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny habetsahana kely hita ao anaty santionany. Na dia mahasoa aza izany amin'ny alàlan'ny fahafahana mamantatra mora foana, dia mampiditra ny mety hisian'ny loto amin'ny alàlan'ny fiparitahan'ny aerosols fanamafisana ao amin'ny tontolo iainana laboratoara. Rehefa manao andrana dia azo atao ny mandray fepetra mba hisorohana ny loto amin'ny reagents, ny fitaovan'ny laboratoara ary ny toerana fanaovana andrana, satria mety hiteraka valiny diso-positive (na diso-negative) izany loto izany.
Mba hampihenana ny mety hisian'ny loto dia tokony hampiharina foana ny Fomba Fanao Tsara ao amin'ny Laboratoara. Ireto indrindra no tokony hotandremana:
1. Fikirakirana ireo akora simika
2. Fandaminana ny toeram-piasana sy ny fitaovana
3. Torohevitra momba ny fampiasana sy fanadiovana ho an'ny habaka molekiola voatondro
4. Torohevitra ankapobeny momba ny biolojia molekiola
5. Fanaraha-maso anatiny
6. Bibliôgrafia
1. Fikirakirana ireo akora simika
Arotsaho vetivety ao anaty "centrifuge" ny fantsona "réagent" alohan'ny hanokafana azy mba hisorohana ny fiforonan'ny "aerosol". Zarao ny "réagent" mba hisorohana ny fiatoana miverimberina sy ny fandotoana ny tahiry fototra. Asiana marika mazava tsara sy daty ny fantsona "réagent" sy "réaction" rehetra ary tehirizo ny lisitry ny laharan'ny "réagent" sy ny laharan'ny andiany nampiasaina tamin'ny andrana rehetra. Araraka amin'ny "pipette" ny "réagent" sy ny santionany rehetra amin'ny alalan'ny "pipette". Alohan'ny hividianana azy, tsara ny manamarina amin'ny mpanamboatra fa mifanaraka amin'ny marika "pipette" hampiasaina ny tendron'ny sivana.
2. Fandaminana ny toeram-piasana sy ny fitaovana
Tokony halamina ny toeram-piasana mba hahazoana antoka fa ny fizotran'ny asa dia atao amin'ny lafiny iray, manomboka amin'ny faritra madio (pre-PCR) mankany amin'ny faritra maloto (post-PCR). Ireto fepetra ankapobeny manaraka ireto dia hanampy amin'ny fampihenana ny mety hisian'ny loto. Asio efitrano natokana misaraka, na farafaharatsiny faritra misaraka ara-batana, ho an'ny: fanomanana mastermix, fitrandrahana asidra nokleika sy fanampiana môdely ADN, fanamafisana sy fikirakirana ny vokatra nohamafisina, ary famakafakana ny vokatra, ohatra ny electrophoresis gel.
Amin'ny toe-javatra sasany, sarotra ny manana efitrano 4 misaraka. Safidy azo atao saingy tsy dia tsara loatra ny manao ny fanomanana ny mastermix ao amin'ny faritra fitanana, ohatra ny kabinetra mikoriana laminar. Raha ny amin'ny fanamafisana PCR mifampitohy, ny fanomanana ny mastermix ho an'ny fihetsika fihodinana faharoa dia tokony homanina ao amin'ny faritra 'madio' ho an'ny fanomanana mastermix, fa ny fampidirana ny vokatra PCR voalohany dia tokony hatao ao amin'ny efitrano fanamafisana, ary raha azo atao dia ao amin'ny faritra fitanana natokana (oh: kabinetra mikoriana laminar).
Mila andiana pipette mazava tsara, tendron'ny sivana, fitoeran-drano, vortex, centrifuge (raha ilaina), penina, reagents laboratoara mahazatra, akanjo laboratoara ary boaty fonon-tanana izay hapetraka ao amin'ny toeram-piasany avy ny efitrano/faritra tsirairay. Tsy maintsy sasana ny tanana ary soloina ny fonon-tanana sy ny akanjo laboratoara rehefa mifindrafindra toerana. Tsy tokony hafindra avy amin'ny toerana maloto mankany amin'ny toerana madio ny reagents sy ny fitaovana. Raha misy tranga tafahoatra izay ilàna famindrana miverina ny reagents na fitaovana, dia tsy maintsy diovina aloha amin'ny sodium hypochlorite 10% izany, arahin'ny famafana amin'ny rano madio.
Fanamarihana
Tsy maintsy amboarina vaovao isan'andro ny vahaolana 10% sodium hypochlorite. Rehefa ampiasaina amin'ny fanadiovana dia tokony harahina farafahakeliny 10 minitra ny fotoana fifandraisana.
Na koa, azo ampiasaina ireo vokatra eny an-tsena izay voamarina fa mpanadio eny ambonin'ny tany manimba ADN raha toa ka tsy mamela ny fampiasana sodium hypochlorite ny tolo-kevitra momba ny fiarovana eo an-toerana na raha toa ka tsy mety amin'ny fanadiovana ny faritra metaly amin'ny fitaovana ny sodium hypochlorite.
Ny tsara indrindra dia ny manaraka ny fitsipiky ny fiasana tokana ny mpiasa ary tsy miala amin'ny toerana maloto (post-PCR) hiverina any amin'ny toerana madio (pre-PCR) amin'io andro io ihany. Na izany aza, mety hisy fotoana tsy azo ihodivirana izany. Rehefa mitranga izany, dia tsy maintsy mitandrina ny mpiasa mba hanasa tanana tsara, hanova fonon-tanana, hampiasa ny akanjo laboratoara voatondro ary tsy hampiditra fitaovana izay tiany hoentina mivoaka ny efitrano indray, toy ny bokin'ny laboratoara. Tokony hohamafisina ireo fepetra fanaraha-maso ireo amin'ny fiofanana momba ny fomba molekiola.
Aorian'ny fampiasana azy dia tokony hodiovina amin'ny sodium hypochlorite 10% ny toerana fanaovana dabilio (arahin'ny rano madio mba hanesorana ny "javelle" sisa tavela), "ethanol" 70%, na "désinfectant" mpandringana ADN efa nohamarinina eny an-tsena. Ny tsara indrindra dia ny fametrahana jiro ultraviolet (UV) mba ahafahana manadio amin'ny alalan'ny taratra. Na izany aza, ny fampiasana jiro UV dia tokony ho ferana amin'ny toeram-piasana mihidy, ohatra ny kabinetra fiarovana, mba hampihenana ny fiparitahan'ny taratra UV amin'ny mpiasan'ny laboratoara. Azafady araho ny torolalan'ny mpanamboatra momba ny fikarakarana ny jiro UV, ny fampidirana rivotra ary ny fanadiovana mba hahazoana antoka fa miasa tsara ny jiro.
Raha etanôl 70% no ampiasaina fa tsy sodium hypochlorite, dia ilaina ny taratra UV mba hamitana ny fanadiovana.
Aza diovina amin'ny sodium hypochlorite ny vortex sy ny centrifuge; fa fafao amin'ny 70% ethanol ary ataovy amin'ny taratra UV, na ampiasao fanafody famonoana ADN ara-barotra. Raha misy raraka, dia miresaha amin'ny mpanamboatra raha mila torohevitra fanampiny momba ny fanadiovana. Raha mamela izany ny torolalan'ny mpanamboatra, dia tokony hodiovina tsy tapaka amin'ny autoclave ny pipettes. Raha tsy azo atao autoclave ny pipettes, dia ampy ny manadio azy ireo amin'ny 10% sodium hypochlorite (arahina famafana tsara amin'ny rano sterile) na amin'ny fanafody famonoana ADN ara-barotra arahin'ny taratra UV.
Ny fanadiovana amin'ny sodium hypochlorite be dia mety hanimba ny plastika sy metaly pipette raha atao tsy tapaka; jereo aloha ny tolo-kevitra avy amin'ny mpanamboatra. Mila amboarina tsy tapaka ny fitaovana rehetra araka ny fandaharam-potoana natolotry ny mpanamboatra. Tokony hisy olona voatendry hiandraikitra ny fanaraha-maso ny fandaharam-potoanan'ny amboarina, ny fitazonana ny tatitra amin'ny antsipiriany, ary ny fampisehoana mazava tsara ny marika momba ny serivisy eo amin'ny fitaovana.
3. Torohevitra momba ny fampiasana sy fanadiovana ho an'ny habaka molekiola voatondro
Pre-PCR: Fiomanana amin'ny fanavahana reagent / mastermix: Ity no tokony ho toerana madio indrindra ampiasaina amin'ny fanomanana ny andrana molekiola ary tsara kokoa raha toerana voatokana ho an'ny kabinetra mikoriana laminar misy jiro UV. Tsy tokony hokarakaraina eto amin'ity faritra ity ny santionany, ny asidra nokleika nalaina ary ny vokatra PCR nohamafisina. Tokony hotehirizina ao anaty vata fampangatsiahana (na vata fampangatsiahana, araka ny tolo-kevitry ny mpanamboatra) ny reagent fanamafisana ao amin'ny toerana voatokana ihany, tsara kokoa raha eo akaikin'ny kabinetra mikoriana laminar na ny faritra pre-PCR. Tokony hosoloina fonon-tanana isaky ny miditra ao amin'ny faritra pre-PCR na ny kabinetra mikoriana laminar.
Tokony hodiovina toy izao manaraka izao ny faritra mialoha ny PCR na ny kabinetra mikoriana laminar alohan'ny sy aorian'ny fampiasana azy: Fafao amin'ny etanôla 70% na fanafody famonoana otrikaretina manimba ADN ny zavatra rehetra ao anaty kabinetra, ohatra ny pipettes, ny boaty misy tendron-tsoroka, ny vortex, ny centrifuge, ny fitoeran-javatra, ny penina, sns., ary avela ho maina. Raha toa ka mihidy ny toeram-piasana, ohatra ny kabinetra mikoriana laminar, dia ataovy amin'ny jiro UV mandritra ny 30 minitra ny sarony.
Fanamarihana
Aza atao amin'ny taratra UV ireo akora simika; afindrao ao anaty kabinetra ihany izy ireo rehefa madio. Raha manao PCR fandikana mivadika, dia mety hanampy ihany koa ny mamafa ny velarana sy ny fitaovana amin'ny vahaolana izay mandrava ny RNases rehefa mikasika. Izany dia mety hanampy amin'ny fisorohana ny valiny diso ratsy avy amin'ny fahasimban'ny anzima amin'ny RNA. Aorian'ny fanadiovana sy alohan'ny hanomanana ny mastermix, dia tokony hosoloina indray ny fonon-tanana, ary avy eo dia vonona hampiasaina ny kabinetra.
Pre-PCR: Fitrandrahana asidra nokleika/fanampiana môdely:
Tsy maintsy alaina sy karakaraina ao amin'ny faritra faharoa voatondro ny asidra nokleika, amin'ny fampiasana andiana pipettes, tendron'ny sivana, fitoeran-drano, fonon-tanana vaovao, akanjo laboratoara ary fitaovana hafa misaraka. Ity faritra ity koa dia natao hanampiana môdely, fanaraha-maso ary tsipika fironana amin'ny fantsona na takelaka mastermix. Mba hisorohana ny fahalotoan'ny santionan'ny asidra nokleika nalaina izay dinihina, dia asaina manova fonon-tanana alohan'ny hikirakirana fanaraha-maso na fenitra tsara ary mampiasa andiana pipettes misaraka. Tsy tokony hatao pipettes amin'ity faritra ity ny reagents PCR sy ny vokatra nohamafisina. Tokony hotehirizina ao anaty vata fampangatsiahana na vata fampangatsiahana voatokana ao amin'io faritra io ihany ny santionany. Tokony hodiovina mitovy amin'ny toerana mastermix ny toeram-piasana santionany.
Post-PCR: Fanamafisana sy fikirakirana ny vokatra nohamafisina
Ity toerana natokana ho an'ny dingana aorian'ny fanamafisana ity dia tokony ho misaraka ara-batana amin'ny faritra mialoha ny PCR. Matetika izy io dia misy thermocyclers sy sehatra mivantana, ary tsara raha misy kabinetra mikoriana laminar hanampiana ny vokatra PCR fihodinana 1 amin'ny fihetsika fihodinana 2, raha toa ka misy PCR miraikitra atao. Tsy tokony hokarakaraina amin'ity faritra ity ny reagents PCR sy ny asidra nokleika nalaina satria avo dia avo ny mety hisian'ny loto. Tokony hanana fonon-tanana, akanjo laboratoara, fitoeran-javatra ho an'ny takelaka sy fantsona, pipettes, tendron'ny sivana, fitoeran-javatra ary fitaovana hafa misaraka ity faritra ity. Tsy maintsy atsoboka ao anaty centrifuge ny fantsona alohan'ny hanokafana azy. Tokony hodiovina mitovy amin'ny toerana mastermix ny toeram-piasana santionany.
Aorian'ny PCR: Famakafakana ny vokatra
Ity efitrano ity dia ho an'ny fitaovana famantarana vokatra, ohatra ny fitoeran-javatra misy gel electrophoresis, power packs, UV transilluminator ary ny rafitra fanoratana gel. Tokony hanana andiana fonon-tanana misaraka ity faritra ity, akanjo laboratoara, fitoeran-takelaka sy fantsona, pipette, tendron'ny sivana, fitoeran-javatra ary fitaovana hafa. Tsy azo ampidirina eto amin'ity faritra ity ny reagents hafa, ankoatra ny loko fampidirana, ny marika molekiola sy ny gel agarose, ary ny singa buffer. Tokony hodiovina mitovy amin'ny toerana mastermix ny toeram-piasana santionany.
Fanamarihana manan-danja
Raha tsara indrindra, tsy tokony hiditra amin'io andro io ihany ireo efitrano mialoha ny fitiliana PCR raha efa vita ny asa tao amin'ireo efitrano taorian'ny fitiliana PCR. Raha tsy azo ihodivirana mihitsy izany, dia ataovy izay hanasana tsara ny tanana aloha ary hanaovana akanjo manokana ho an'ny laboratoara ao amin'ireo efitrano. Tsy tokony hoentina ao amin'ireo efitrano mialoha ny fitiliana PCR ny boky sy taratasy momba ny laboratoara raha efa nampiasaina tao amin'ireo efitrano taorian'ny fitiliana PCR izy ireo; raha ilaina, dia makà dika mitovy amin'ny pirinty ny protocols/santionany ID, sns.
4. Torohevitra ankapobeny momba ny biolojia molekiola
Mampiasà fonon-tanana tsy misy vovoka mba hisorohana ny fanakanana ny fitiliana. Ny teknika fametrahana fantsona tsara dia tena ilaina amin'ny fampihenana ny loto. Ny fametrahana fantsona tsy mety dia mety hiteraka fiparitahana rehefa mizara ranon-javatra sy ny famoronana aerosol. Ny fomba fanao tsara amin'ny fametrahana fantsona tsara dia azo jerena amin'ireto rohy manaraka ireto: Torolàlana Gilson momba ny fametrahana fantsona, Lahatsary momba ny teknika fametrahana fantsona Anachem, Fantsona centrifuge alohan'ny hanokafana azy, ary sokafy tsara mba tsy hiparitaka. Akombony avy hatrany ny fantsona aorian'ny fampiasana mba hisorohana ny fidiran'ny loto.
Rehefa manao fihetsika maromaro, dia manomàna mastermix iray misy reagents mahazatra (ohatra ny rano, dNTPs, buffer, primers ary enzyme) mba hampihenana ny isan'ny famindrana reagents sy hampihenana ny mety hisian'ny loto. Soso-kevitra ny hametraka ny mastermix amin'ny ranomandry na "cold block". Ny fampiasana anzima Hot Start dia mety hanampy amin'ny fampihenana ny famokarana vokatra tsy manokana. Arovy amin'ny hazavana ireo reagents misy "fluorescent probes" mba hisorohana ny fahasimbana.
5. Fanaraha-maso anatiny
Ampidiro ireo fanaraha-maso tsara sy ratsy voamarina tsara, miaraka amin'ny fanaraha-maso tsy misy môdely amin'ny fihetsika rehetra, ary tsipika fironana titrated marobe ho an'ny fihetsika quantitative. Tsy tokony ho matanjaka loatra ny fanaraha-maso tsara ka mety hampidi-doza ny fahalotoana. Ampidiro ireo fanaraha-maso fitrandrahana tsara sy ratsy rehefa manao fitrandrahana asidra nokleika.
Soso-kevitra ny hametrahana toromarika mazava amin'ny faritra tsirairay mba hahafantaran'ny mpampiasa ny fitsipiky ny fitondran-tena. Ireo laboratoara diagnostika izay mahita ADN na RNA ambany dia ambany amin'ny santionany ara-pitsaboana dia mety te-hampiasa fepetra fiarovana fanampiny amin'ny fananana rafitra fikirakirana rivotra misaraka misy tsindrin'ny rivotra somary tsara ao amin'ny efitrano mialoha ny PCR ary tsindrin'ny rivotra somary ratsy ao amin'ny efitrano aorian'ny PCR.
Farany, mahasoa ny famolavolana drafitra fiantohana kalitao (QA). Tokony ahitana lisitr'ireo tahiry lehibe sy tahiry miasa ny drafitra toy izany, fitsipika momba ny fitahirizana kitapo sy reagents, tatitra momba ny valin'ny fanaraha-maso, fandaharam-piofanana ho an'ny mpiasa, algorithm famahana olana, ary hetsika fanarenana rehefa ilaina izany.
6. Bibliôgrafia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Toko faha-3: Fametrahana laboratoara qPCR. Antontan-taratasy torolalana ho an'ny fitiliana rano fialamboly mampiasa ny fomba USEPA qPCR 1611. Lansing- Oniversiten'i Michigan State.
Fahasalamam-bahoaka Angletera, NHS. Fenitra UK ho an'ny fanadihadiana momba ny mikrôbiolojia: Fomba fanao tsara ao amin'ny laboratoara rehefa manao fanadihadiana momba ny fanamafisana molekiola). Torolàlana momba ny kalitao. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Fametrahana laboratoara PCR. Protokolin'ny Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Fikojakojana tsy tapaka ny centrifuge: fanadiovana, fikojakojana ary famonoana otrikaretina ny centrifuge, rotors ary adaptatera (Taratasy fotsy No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Fomba fanao tsara ao amin'ny laboratoara klinika (GCLP) ho an'ny fitsapana mifototra amin'ny molekiola ampiasaina amin'ny laboratoara diagnostika, Ao amin'ny: Akyar I, tonian-dahatsoratra. Spektra midadasika amin'ny fanaraha-maso ny kalitao. Rijeka, Kroasia: Intech; 2011: 29–52.
Fotoana fandefasana: 16 Jolay 2020
