Metode deteksi molekuler memiliki kemampuan untuk menghasilkan volume asam nukleat yang besar melalui amplifikasi jumlah jejak yang ditemukan dalam sampel. Meskipun hal ini bermanfaat untuk memungkinkan deteksi yang sensitif, hal ini juga menimbulkan kemungkinan kontaminasi melalui penyebaran aerosol amplifikasi di lingkungan laboratorium. Saat melakukan eksperimen, tindakan dapat dilakukan untuk menghindari kontaminasi reagen, peralatan laboratorium, dan ruang kerja, karena kontaminasi tersebut dapat menghasilkan hasil positif palsu (atau negatif palsu).
Untuk membantu mengurangi kemungkinan kontaminasi, Praktik Laboratorium yang Baik harus selalu diterapkan. Secara khusus, tindakan pencegahan harus dilakukan terkait poin-poin berikut:
1. Penanganan reagen
2. Pengorganisasian ruang kerja dan peralatan
3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekuler yang ditentukan
4. Saran umum tentang biologi molekuler
5. Pengendalian internal
6. Daftar Pustaka
1. Penanganan reagen
Sebelum dibuka, sentrifugasi tabung reagen sebentar untuk menghindari pembentukan aerosol. Bagi reagen menjadi beberapa bagian untuk menghindari pembekuan dan pencairan berulang serta kontaminasi stok induk. Beri label dan tanggal dengan jelas pada semua tabung reagen dan reaksi, serta catat nomor lot dan batch reagen yang digunakan dalam semua percobaan. Pipet semua reagen dan sampel menggunakan ujung pipet berfilter. Sebelum membeli, disarankan untuk memastikan dengan produsen bahwa ujung pipet berfilter tersebut sesuai dengan merek pipet yang akan digunakan.
2. Pengorganisasian ruang kerja dan peralatan
Ruang kerja harus diatur sedemikian rupa untuk memastikan alur kerja berjalan searah, dari area bersih (pra-PCR) ke area kotor (pasca-PCR). Tindakan pencegahan umum berikut akan membantu mengurangi kemungkinan kontaminasi. Sediakan ruangan khusus yang terpisah, atau setidaknya area yang terpisah secara fisik, untuk: persiapan mastermix, ekstraksi asam nukleat dan penambahan templat DNA, amplifikasi dan penanganan produk hasil amplifikasi, dan analisis produk, misalnya elektroforesis gel.
Dalam beberapa situasi, memiliki 4 ruangan terpisah cukup sulit. Pilihan yang mungkin, tetapi kurang disarankan, adalah melakukan persiapan mastermix di area tertutup, misalnya lemari aliran laminar. Dalam kasus amplifikasi PCR bertingkat, persiapan mastermix untuk reaksi putaran kedua harus dilakukan di area 'bersih' untuk persiapan mastermix, tetapi inokulasi dengan produk PCR primer harus dilakukan di ruang amplifikasi, dan jika memungkinkan di area tertutup khusus (misalnya lemari aliran laminar).
Setiap ruangan/area membutuhkan seperangkat alat yang diberi label dengan jelas, seperti pipet, ujung filter, rak tabung, vortex, sentrifug (jika diperlukan), pena, reagen laboratorium umum, jas laboratorium, dan kotak sarung tangan, yang akan tetap berada di tempat kerja masing-masing. Tangan harus dicuci dan sarung tangan serta jas laboratorium diganti saat berpindah antar area yang ditentukan. Reagen dan peralatan tidak boleh dipindahkan dari area kotor ke area bersih. Jika terjadi kasus ekstrem di mana reagen atau peralatan perlu dipindahkan ke arah sebaliknya, reagen atau peralatan tersebut harus terlebih dahulu didekontaminasi dengan natrium hipoklorit 10%, kemudian dibersihkan dengan air steril.
Catatan
Larutan natrium hipoklorit 10% harus dibuat baru setiap hari. Saat digunakan untuk dekontaminasi, waktu kontak minimal 10 menit harus dipatuhi.
Sebagai alternatif, produk yang tersedia secara komersial yang telah divalidasi sebagai dekontaminan permukaan yang dapat menghancurkan DNA dapat digunakan jika rekomendasi keselamatan setempat tidak mengizinkan penggunaan natrium hipoklorit atau jika natrium hipoklorit tidak cocok untuk mendekontaminasi bagian logam peralatan.
Idealnya, staf harus mematuhi etos alur kerja searah dan tidak berpindah dari area kotor (pasca-PCR) kembali ke area bersih (pra-PCR) pada hari yang sama. Namun, mungkin ada kalanya hal ini tidak dapat dihindari. Ketika hal tersebut terjadi, personel harus berhati-hati untuk mencuci tangan secara menyeluruh, mengganti sarung tangan, menggunakan jas lab yang telah ditentukan, dan tidak membawa peralatan apa pun yang ingin mereka bawa keluar ruangan lagi, seperti buku lab. Langkah-langkah pengendalian tersebut harus ditekankan dalam pelatihan staf tentang metode molekuler.
Setelah digunakan, area meja kerja harus dibersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (diikuti dengan air steril untuk menghilangkan sisa pemutih), etanol 70%, atau dekontaminan penghancur DNA yang telah teruji dan tersedia secara komersial. Idealnya, lampu ultra-violet (UV) harus dipasang untuk memungkinkan dekontaminasi dengan iradiasi. Namun, penggunaan lampu UV harus dibatasi pada area kerja tertutup, misalnya lemari pengaman, untuk membatasi paparan UV pada staf laboratorium. Harap patuhi petunjuk produsen untuk perawatan, ventilasi, dan pembersihan lampu UV untuk memastikan lampu tetap efektif.
Jika menggunakan etanol 70% sebagai pengganti natrium hipoklorit, iradiasi dengan sinar UV akan diperlukan untuk menyelesaikan dekontaminasi.
Jangan membersihkan vortex dan sentrifugasi dengan natrium hipoklorit; sebagai gantinya, bersihkan dengan etanol 70% dan paparkan pada sinar UV, atau gunakan dekontaminan penghancur DNA komersial. Untuk tumpahan, periksa dengan produsen untuk saran pembersihan lebih lanjut. Jika petunjuk produsen mengizinkannya, pipet harus disterilkan secara rutin dengan autoklaf. Jika pipet tidak dapat diautoklaf, cukup bersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (diikuti dengan pembersihan menyeluruh dengan air steril) atau dengan dekontaminan penghancur DNA komersial diikuti dengan paparan UV.
Pembersihan dengan natrium hipoklorit konsentrasi tinggi dapat merusak plastik dan logam pipet jika dilakukan secara teratur; periksa rekomendasi dari produsen terlebih dahulu. Semua peralatan perlu dikalibrasi secara teratur sesuai dengan jadwal yang direkomendasikan produsen. Seseorang yang ditunjuk harus bertanggung jawab untuk memastikan bahwa jadwal kalibrasi dipatuhi, catatan rinci dipelihara, dan label servis ditampilkan dengan jelas pada peralatan.
3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekuler yang ditentukan
Pra-PCR: Aliquot reagen / persiapan mastermix: Area ini harus menjadi area terbersih dari semua ruang yang digunakan untuk persiapan eksperimen molekuler dan idealnya berupa lemari aliran laminar yang dilengkapi dengan lampu UV. Sampel, asam nukleat yang diekstraksi, dan produk PCR yang diamplifikasi tidak boleh ditangani di area ini. Reagen amplifikasi harus disimpan di dalam freezer (atau lemari es, sesuai rekomendasi produsen) di ruang yang sama, idealnya di sebelah lemari aliran laminar atau area pra-PCR. Sarung tangan harus diganti setiap kali memasuki area pra-PCR atau lemari aliran laminar.
Area pra-PCR atau kabinet aliran laminar harus dibersihkan sebelum dan sesudah digunakan sebagai berikut: Lap semua barang di dalam kabinet, misalnya pipet, kotak tip, vortex, sentrifugasi, rak tabung, pena, dll. dengan etanol 70% atau dekontaminan penghancur DNA komersial, dan biarkan kering. Dalam kasus area kerja tertutup, misalnya kabinet aliran laminar, paparkan sungkup ke sinar UV selama 30 menit.
Catatan
Jangan paparkan reagen ke sinar UV; pindahkan reagen ke dalam kabinet hanya setelah kabinet bersih. Jika melakukan PCR transkripsi balik, membersihkan permukaan dan peralatan dengan larutan yang dapat menguraikan RNase saat kontak juga dapat membantu. Ini dapat membantu menghindari hasil negatif palsu akibat degradasi RNA oleh enzim. Setelah dekontaminasi dan sebelum menyiapkan mastermix, sarung tangan harus diganti sekali lagi, dan kemudian kabinet siap digunakan.
Pra-PCR: Ekstraksi asam nukleat/penambahan templat:
Asam nukleat harus diekstraksi dan ditangani di area khusus kedua, menggunakan seperangkat pipet, ujung filter, rak tabung, sarung tangan baru, jas lab, dan peralatan lainnya yang terpisah. Area ini juga digunakan untuk menambahkan templat, kontrol, dan garis tren ke tabung atau pelat mastermix. Untuk menghindari kontaminasi sampel asam nukleat yang diekstraksi yang sedang dianalisis, disarankan untuk mengganti sarung tangan sebelum menangani kontrol positif atau standar dan menggunakan seperangkat pipet yang terpisah. Reagen PCR dan produk amplifikasi tidak boleh dipipet di area ini. Sampel harus disimpan di lemari es atau freezer khusus di area yang sama. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Amplifikasi dan penanganan produk hasil amplifikasi
Ruang khusus ini diperuntukkan bagi proses pasca-amplifikasi dan harus terpisah secara fisik dari area pra-PCR. Biasanya berisi termocycler dan platform real-time, dan idealnya harus memiliki kabinet aliran laminar untuk menambahkan produk PCR putaran 1 ke reaksi putaran 2, jika PCR bersarang sedang dilakukan. Reagen PCR dan asam nukleat yang diekstraksi tidak boleh ditangani di area ini karena risiko kontaminasinya tinggi. Area ini harus memiliki seperangkat sarung tangan, jas lab, rak pelat dan tabung, pipet, ujung filter, wadah, dan peralatan lainnya yang terpisah. Tabung harus disentrifugasi sebelum dibuka. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Analisis produk
Ruangan ini diperuntukkan bagi peralatan deteksi produk, misalnya tangki elektroforesis gel, unit catu daya, transilluminator UV, dan sistem dokumentasi gel. Area ini harus memiliki perlengkapan terpisah seperti sarung tangan, jas lab, rak pelat dan tabung, pipet, ujung filter, wadah, dan peralatan lainnya. Reagen lain tidak boleh dibawa ke area ini, kecuali pewarna pemuat, penanda molekuler, gel agarosa, dan komponen buffer. Area kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti area mastermix.
Catatan penting
Idealnya, ruang pra-PCR tidak boleh dimasuki pada hari yang sama jika pekerjaan telah dilakukan di ruang pasca-PCR. Jika hal ini benar-benar tidak dapat dihindari, pastikan tangan dicuci bersih terlebih dahulu dan mengenakan jas lab khusus di dalam ruangan. Buku lab dan dokumen tidak boleh dibawa ke ruang pra-PCR jika telah digunakan di ruang pasca-PCR; jika perlu, bawa salinan cetak protokol/ID sampel, dll.
4. Saran umum tentang biologi molekuler
Gunakan sarung tangan bebas bedak untuk menghindari penghambatan pengujian. Teknik pipet yang benar sangat penting untuk mengurangi kontaminasi. Pipet yang salah dapat mengakibatkan percikan saat mengeluarkan cairan dan pembentukan aerosol. Praktik yang baik untuk pipet yang benar dapat ditemukan pada tautan berikut: panduan pipet Gilson, video teknik pipet Anachem, sentrifugasi tabung sebelum dibuka, dan buka dengan hati-hati untuk menghindari percikan. Tutup tabung segera setelah digunakan untuk menghindari masuknya kontaminan.
Saat melakukan beberapa reaksi, siapkan satu mastermix yang berisi reagen umum (misalnya air, dNTP, buffer, primer, dan enzim) untuk meminimalkan jumlah transfer reagen dan mengurangi risiko kontaminasi. Dianjurkan untuk menyiapkan mastermix di atas es atau blok pendingin. Penggunaan enzim Hot Start dapat membantu mengurangi produksi produk non-spesifik. Lindungi reagen yang mengandung probe fluoresen dari cahaya untuk menghindari degradasi.
5. Pengendalian internal
Sertakan kontrol positif dan negatif yang terkarakterisasi dengan baik dan terkonfirmasi, bersama dengan kontrol tanpa templat dalam semua reaksi, dan garis tren titrasi multi-titik untuk reaksi kuantitatif. Kontrol positif tidak boleh terlalu kuat sehingga menimbulkan risiko kontaminasi. Sertakan kontrol ekstraksi positif dan negatif saat melakukan ekstraksi asam nukleat.
Disarankan agar petunjuk yang jelas dipasang di setiap area sehingga pengguna mengetahui aturan perilaku. Laboratorium diagnostik yang mendeteksi kadar DNA atau RNA yang sangat rendah dalam sampel klinis mungkin ingin menerapkan langkah keamanan tambahan berupa sistem penanganan udara terpisah dengan tekanan udara sedikit positif di ruang pra-PCR dan tekanan udara sedikit negatif di ruang pasca-PCR.
Terakhir, mengembangkan rencana jaminan mutu (QA) sangat membantu. Rencana tersebut harus mencakup daftar stok induk reagen dan stok kerja, aturan penyimpanan kit dan reagen, pelaporan hasil kontrol, program pelatihan staf, algoritma pemecahan masalah, dan tindakan perbaikan jika diperlukan.
6. Daftar Pustaka
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Mendirikan laboratorium qPCR. Dokumen panduan untuk pengujian perairan rekreasi menggunakan metode qPCR USEPA 1611. Lansing - Universitas Negeri Michigan.
Badan Kesehatan Masyarakat Inggris, NHS. Standar Inggris untuk investigasi mikrobiologi: Praktik Laboratorium yang Baik saat melakukan pengujian amplifikasi molekuler). Panduan Kualitas. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Mendirikan laboratorium PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Pemeliharaan rutin sentrifugasi: pembersihan, pemeliharaan dan disinfeksi sentrifugasi, rotor dan adaptor (Buku putih No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Praktik Laboratorium Klinis yang Baik (GCLP) untuk tes berbasis molekuler yang digunakan di laboratorium diagnostik, Dalam: Akyar I, editor. Spektrum luas pengendalian mutu. Rijeka, Kroasia: Intech; 2011: 29–52.
Waktu posting: 16 Juli 2020
