Loaʻa i nā ʻano hana ʻike molekala ka hiki ke hana i kahi nui o ka waikawa nucleic ma o ka hoʻonui ʻana i nā nui liʻiliʻi i loaʻa i nā laʻana. ʻOiai he mea maikaʻi kēia no ka hiki ʻana i ka ʻike ʻana i ka ʻike koʻikoʻi, hoʻolauna pū ia i ka hiki ke haumia ma o ka hoʻolaha ʻana o nā aerosol amplification i loko o ke kaiapuni hoʻokolohua. I ka wā e hana ai i nā hoʻokolohua, hiki ke hana ʻia nā hana e pale aku ai i ka haumia o nā reagents, nā lako hoʻokolohua a me kahi noho, no ka mea, hiki i kēlā haumia ke hoʻopuka i nā hopena wahaheʻe-maikaʻi (a i ʻole wahaheʻe-maikaʻi ʻole).
I mea e hōʻemi ai i ka hiki ke haumia, pono e hoʻokō ʻia ka Good Laboratory Practice i nā manawa a pau. ʻO ke kikoʻī, pono e hana ʻia nā hana palekana e pili ana i kēia mau mea:
1. Ka lawelawe ʻana i nā reagents
2. Hoʻonohonoho ʻana o ka wahi hana a me nā lako
3. ʻŌlelo aʻoaʻo no ka hoʻohana ʻana a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻana no ka hakahaka molekala i koho ʻia
4. ʻŌlelo aʻoaʻo no ka biology molekala laulā
5. Nā mana kūloko
6. Papa Kuhikuhi
1. Ka lawelawe ʻana i nā reagents
E centrifuge pōkole i nā paipu reagent ma mua o ka wehe ʻana e pale aku i ka hana ʻana o nā aerosols. E hoʻokaʻawale i nā reagent e pale aku i nā hau-thaws he nui a me ka haumia o nā waihona master. E lepili maopopo a hoʻopaʻa i ka lā i nā paipu reagent a me nā reaction a mālama i nā log o ka reagent lot a me nā helu batch i hoʻohana ʻia i nā hoʻokolohua āpau. E hoʻopili i nā reagent a me nā laʻana a pau me ka hoʻohana ʻana i nā kānana. Ma mua o ke kūʻai ʻana, he mea kūpono e hōʻoia me ka mea hana ua kūpono nā kānana i ka brand o ka pipette e hoʻohana ʻia.
2. Hoʻonohonoho ʻana o ka wahi hana a me nā lako
Pono e hoʻonohonoho ʻia kahi hana e hōʻoia i ke kahe ʻana o ka hana ma kekahi ʻaoʻao, mai nā wahi maʻemaʻe (pre-PCR) a i nā wahi lepo (post-PCR). E kōkua kēia mau hana palekana laulā i ka hōʻemi ʻana i ka hiki ke haumia. E loaʻa nā lumi i hoʻokaʻawale ʻia, a i ʻole ma ka liʻiliʻi he mau wahi i hoʻokaʻawale ʻia, no: ka hoʻomākaukau ʻana o ka mastermix, ka unuhi ʻana o ka nucleic acid a me ka hoʻohui ʻana i ka DNA template, ka hoʻonui ʻana a me ka lawelawe ʻana i ka huahana i hoʻonui ʻia, a me ka nānā ʻana i ka huahana, e laʻa me ka gel electrophoresis.
I kekahi mau hoʻonohonoho, he mea paʻakikī ka loaʻa ʻana o 4 mau lumi kaʻawale. ʻO kahi koho hiki akā ʻaʻole makemake nui ʻia, ʻo ia ka hana ʻana i ka hoʻomākaukau ʻana o ka mastermix ma kahi hoʻopaʻa ʻana, e laʻa me kahi keʻena kahe laminar. I ke ʻano o ka hoʻonui ʻana o ka PCR nested, pono e hoʻomākaukau ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka mastermix no ka hopena puni ʻelua ma kahi 'maʻemaʻe' no ka hoʻomākaukau ʻana o ka mastermix, akā pono e hana ʻia ka inoculation me ka huahana PCR mua ma ka lumi hoʻonui, a inā hiki ma kahi hoʻopaʻa i hoʻolaʻa ʻia (e laʻa me kahi keʻena kahe laminar).
Pono kēlā me kēia lumi/wahi i kahi hoʻonohonoho ʻokoʻa o nā pipettes i lepili maopopo ʻia, nā wēlau kānana, nā ʻūpā paipu, nā vortexes, nā centrifuges (inā pili), nā peni, nā reagents lab generic, nā ʻaʻahu lab a me nā pahu o nā mīkina lima e waiho ʻia ma kā lākou mau wahi hana. Pono e holoi ʻia nā lima a hoʻololi ʻia nā mīkina lima a me nā ʻaʻahu lab i ka wā e neʻe ai ma waena o nā wahi i koho ʻia. ʻAʻole pono e hoʻoneʻe ʻia nā reagents a me nā lako mai kahi lepo a i kahi maʻemaʻe. Inā kū mai kahi hihia koʻikoʻi kahi e pono ai ke hoʻoneʻe ʻia i hope kahi reagent a i ʻole kahi ʻāpana o nā lako, pono e hoʻomaʻemaʻe mua ʻia me 10% sodium hypochlorite, a ukali ʻia e ka holoi ʻana me ka wai sterile.
Hoʻomaopopo
Pono e hana hou ʻia ka wai hoʻoheheʻe 10% sodium hypochlorite i kēlā me kēia lā. Ke hoʻohana ʻia no ka hoʻomaʻemaʻe ʻana, pono e mālama ʻia ka manawa hoʻopili liʻiliʻi he 10 mau minuke.
ʻOkoʻa, hiki ke hoʻohana ʻia nā huahana i loaʻa ma ke kālepa i hōʻoia ʻia he mau mea hoʻomaʻemaʻe ʻili e luku ana i ka DNA inā ʻae ʻole nā ʻōlelo aʻoaʻo palekana kūloko i ka hoʻohana ʻana i ka sodium hypochlorite a inā ʻaʻole kūpono ka sodium hypochlorite no ka hoʻomaʻemaʻe ʻana i nā ʻāpana metala o nā lako.
ʻO ke kūpono, pono nā limahana e mālama i ke ʻano hana hoʻokahi a ʻaʻole e hele mai nā wahi lepo (post-PCR) a hoʻi i nā wahi maʻemaʻe (pre-PCR) i ka lā hoʻokahi. Eia nō naʻe, aia paha kekahi mau manawa i hiki ʻole ke pale ʻia kēia. Ke kū mai kēlā ʻano hanana, pono nā limahana e makaʻala e holoi pono i nā lima, hoʻololi i nā mīkina lima, hoʻohana i ke kapa komo lab i koho ʻia a ʻaʻole e hoʻokomo i nā lako a lākou e makemake ai e lawe hou i waho o ka lumi, e like me nā puke lab. Pono e hoʻokūpaʻa ʻia kēlā mau hana kaohi i ke aʻo ʻana o nā limahana ma nā ʻano molekala.
Ma hope o ka hoʻohana ʻana, pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia nā wahi noho me 10% sodium hypochlorite (a ukali ʻia e ka wai sterile e wehe i ke koena bleach), 70% ethanol, a i ʻole kahi decontaminant luku DNA i hōʻoia ʻia i loaʻa ma ke kālepa. ʻO ke kūpono, pono e hoʻokomo ʻia nā kukui ultra-violet (UV) e hiki ai ke decontamination ma o ka irradiation. Eia nō naʻe, pono e kaupalena ʻia ka hoʻohana ʻana i nā kukui UV i nā wahi hana pani ʻia, e like me nā cabinets palekana, i mea e kaupalena ai i ka ʻike UV o nā limahana keʻena hoʻokolohua. E ʻoluʻolu e mālama i nā ʻōlelo aʻoaʻo a ka mea hana no ka mālama ʻana i nā kukui UV, ka ea a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻana i mea e hōʻoia ai e mau ana ka maikaʻi o nā kukui.
Inā hoʻohana ʻia ka 70% ethanol ma kahi o ka sodium hypochlorite, pono ka hoʻomālamalama ʻana me ke kukui UV e hoʻopau i ka decontamination.
Mai hoʻomaʻemaʻe i ka vortex a me ka centrifuge me ka sodium hypochlorite; akā, e holoi me ka 70% ethanol a hoʻokuʻu i ka mālamalama UV, a i ʻole e hoʻohana i kahi decontaminant luku DNA kalepa. No nā ninini, e nānā me ka mea hana no nā ʻōlelo aʻoaʻo hoʻomaʻemaʻe hou aku. Inā ʻae nā kuhikuhi a ka mea hana, pono e hoʻomaʻemaʻe mau ʻia nā pipettes e ka autoclave. Inā ʻaʻole hiki ke autoclaved ʻia nā pipettes, pono e lawa ka hoʻomaʻemaʻe ʻana iā lākou me 10% sodium hypochlorite (a ukali ʻia e ka holoi pono ʻana me ka wai sterile) a i ʻole me kahi decontaminant luku DNA kalepa a ukali ʻia e ka hōʻike UV.
ʻO ka hoʻomaʻemaʻe ʻana me ka sodium hypochlorite kiʻekiʻe-pakeneka hiki ke hōʻino i nā plastic pipette a me nā metala inā hana mau ʻia; e nānā mua i nā ʻōlelo paipai mai ka mea hana. Pono e hoʻoponopono mau ʻia nā lako a pau e like me ka papa kuhikuhi i ʻōlelo ʻia e ka mea hana. Pono ke kanaka i koho ʻia e mālama i ka hōʻoia ʻana ua mālama ʻia ka papa kuhikuhi hoʻoponopono, mālama ʻia nā moʻolelo kikoʻī, a hōʻike maopopo ʻia nā lepili lawelawe ma nā lako.
3. ʻŌlelo aʻoaʻo no ka hoʻohana ʻana a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻana no ka hakahaka molekala i koho ʻia
Pre-PCR: Hoʻomākaukau ʻana i ka reagent aliquoting / mastermix: Pono kēia e lilo i wahi maʻemaʻe loa o nā wahi āpau i hoʻohana ʻia no ka hoʻomākaukau ʻana i nā hoʻokolohua molekala a ʻo ke kūpono he keʻena kahe laminar i hoʻolako ʻia me kahi kukui UV. ʻAʻole pono e lawelawe ʻia nā laʻana, ka waikawa nucleic i unuhi ʻia a me nā huahana PCR i hoʻonui ʻia ma kēia wahi. Pono e mālama ʻia nā reagents amplification i loko o ka pahu hau (a i ʻole ka pahu hau, e like me nā ʻōlelo a ka mea hana) ma kahi i koho ʻia, ʻoi aku ka maikaʻi ma ka ʻaoʻao o ke keʻena kahe laminar a i ʻole kahi pre-PCR. Pono e hoʻololi ʻia nā mīkina lima i kēlā me kēia manawa i ke komo ʻana i ka wahi pre-PCR a i ʻole ke keʻena kahe laminar.
Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka wahi pre-PCR a i ʻole ke keʻena kahe laminar ma mua a ma hope o ka hoʻohana ʻana penei: E holoi i nā mea āpau i loko o ke keʻena, e like me nā pipettes, nā pahu tip, vortex, centrifuge, nā ʻūpā tube, nā peni, a pēlā aku me 70% ethanol a i ʻole kahi decontaminant luku DNA kalepa, a e hoʻomaloʻo. I ke ʻano o kahi wahi hana pani ʻia, e like me ke keʻena kahe laminar, e hōʻike i ka uhi i ka mālamalama UV no 30 mau minuke.
Hoʻomaopopo
Mai hōʻike i nā reagents i ka mālamalama UV; e hoʻoneʻe wale iā lākou i loko o ke keʻena ke maʻemaʻe. Inā e hana ana i ka reverse transcription PCR, he mea kōkua paha ka holoi ʻana i nā ʻili a me nā lako me kahi hopena e wāwahi ai i nā RNases i ka wā e pili ai. Hiki i kēia ke kōkua i ka pale ʻana i nā hopena wahaheʻe mai ka hoʻohaʻahaʻa enzyme o RNA. Ma hope o ka decontamination a ma mua o ka hoʻomākaukau ʻana i ka mastermix, pono e hoʻololi hou ʻia nā mīkina lima, a laila mākaukau ka keʻena e hoʻohana.
Pre-PCR: Ka unuhi ʻana o ka waikawa nucleic/hoʻohui template:
Pono e unuhi ʻia a lawelawe ʻia ka waikawa nucleic ma kahi ʻāpana ʻelua i koho ʻia, me ka hoʻohana ʻana i kahi set ʻokoʻa o nā pipettes, nā ʻōlelo kānana, nā ʻūpā paipu, nā mīkina lima hou, nā ʻaʻahu lab a me nā lako ʻē aʻe. ʻO kēia wahi kekahi no ka hoʻohui ʻana i nā template, nā kaohi a me nā trendlines i nā paipu mastermix a i ʻole nā papa. I mea e pale aku ai i ka haumia o nā laʻana waikawa nucleic i unuhi ʻia e kālailai ʻia nei, ua ʻōlelo ʻia e hoʻololi i nā mīkina lima ma mua o ka lawelawe ʻana i nā kaohi maikaʻi a i ʻole nā kūlana a e hoʻohana i kahi set ʻokoʻa o nā pipettes. ʻAʻole pono e pipetted ʻia nā reagents PCR a me nā huahana i hoʻonui ʻia ma kēia wahi. Pono e mālama ʻia nā laʻana i loko o nā friji a i ʻole nā mea hoʻopaʻa hau i koho ʻia ma kahi like. Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka wahi hana laʻana ma ke ʻano like me ka wahi mastermix.
Post-PCR: Hoʻonui a me ka lawelawe ʻana i ka huahana i hoʻonui ʻia
ʻO kēia wahi i hoʻokaʻawale ʻia no nā kaʻina hana ma hope o ka hoʻonui ʻana a pono e hoʻokaʻawale kino ʻia mai nā wahi pre-PCR. Loaʻa pinepine iā ia nā thermocyclers a me nā kahua manawa maoli, a ʻo ke kūpono he keʻena kahe laminar no ka hoʻohui ʻana i ka huahana PCR puni 1 i ka hopena puni 2, inā e hana ʻia ana ka PCR nested. ʻAʻole pono e lawelawe ʻia nā reagents PCR a me ka waikawa nucleic i unuhi ʻia ma kēia wahi no ka mea he kiʻekiʻe ka pilikia o ka haumia. Pono kēia wahi e loaʻa kahi set kaʻawale o nā mīkina lima, nā ʻaʻahu lab, nā papa a me nā ʻūpā, nā pipettes, nā ʻōlelo kānana, nā pahu a me nā lako ʻē aʻe. Pono e centrifuged ʻia nā ʻūpā ma mua o ka wehe ʻana. Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka wahi hana laʻana ma ke ʻano like me ka wahi mastermix.
Ma hope o ka PCR: Ka nānā ʻana i ka huahana
ʻO kēia lumi no nā lako ʻike huahana, e laʻa me nā pahu electrophoresis gel, nā ʻeke mana, ka transilluminator UV a me ka ʻōnaehana palapala gel. Pono kēia wahi e loaʻa nā set kaʻawale o nā mīkina lima, nā ʻaʻahu lab, nā ʻūpā pā a me nā paipu, nā pipettes, nā wēlau kānana, nā pahu a me nā lako ʻē aʻe. ʻAʻole hiki ke lawe ʻia mai nā reagents ʻē aʻe i loko o kēia wahi, koe wale nō ka dye hoʻouka, ka māka molecular a me ka agarose gel, a me nā ʻāpana buffer. Pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia ka wahi hana laʻana ma ke ʻano like me ka wahi mastermix.
Memo koʻikoʻi
ʻO ke kūpono, ʻaʻole pono e komo i nā lumi pre-PCR i ka lā hoʻokahi inā ua hana mua ʻia ka hana ma nā lumi post-PCR. Inā ʻaʻole hiki ke pale ʻia kēia, e hōʻoia i ka holoi mua ʻia ʻana o nā lima a me ke komo ʻana o nā ʻaʻahu lab kikoʻī i loko o nā lumi. ʻAʻole pono e lawe ʻia nā puke lab a me nā pepa i loko o nā lumi pre-PCR inā ua hoʻohana ʻia ma nā lumi post-PCR; inā pono, e lawe i nā paʻi kope o nā protocols/laʻana ID, a pēlā aku.
4. ʻŌlelo aʻoaʻo no ka biology molekala laulā
E hoʻohana i nā mīkina lima ʻaʻohe pauka e pale aku i ka pale ʻana i ka hoʻāʻo ʻana. ʻO ke ʻano hana pipetting kūpono ka mea nui loa no ka hōʻemi ʻana i ka haumia. Hiki i ka pipetting hewa ke hopena i ka pīpī ʻana i ka wā e hāʻawi ana i nā wai a me ka hana ʻana o nā aerosol. Hiki ke loaʻa ka hana maikaʻi no ka pipetting pololei ma nā loulou aʻe: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes ma mua o ka wehe ʻana, a wehe pono iā lākou e pale aku i ka pīpī ʻana. E pani koke i nā ʻōmole ma hope o ka hoʻohana ʻana e pale aku i ka hoʻokomo ʻia ʻana o nā mea haumia.
I ka hana ʻana i nā hopena he nui, e hoʻomākaukau i hoʻokahi mastermix e loaʻa ana nā reagents maʻamau (e laʻa me ka wai, dNTPs, buffer, primers a me ka enzyme) e hōʻemi i ka nui o nā hoʻoili reagent a hōʻemi i ka hoʻoweliweli o ka haumia. Manaʻo ʻia e hoʻonohonoho i ka mastermix ma luna o ka hau a i ʻole kahi poloka anu. ʻO ka hoʻohana ʻana i kahi enzyme Hot Start e kōkua paha i ka hōʻemi ʻana i ka hana ʻana o nā huahana kikoʻī ʻole. E pale i nā reagents e loaʻa ana nā probes fluorescent mai ka mālamalama i mea e pale aku ai i ka hōʻino ʻia.
5. Nā mana kūloko
E hoʻokomo i nā kaohi maikaʻi a me nā kaohi maikaʻi ʻole i hōʻike maikaʻi ʻia, me kahi kaohi ʻaʻohe template i nā hopena āpau, a me kahi laina trend titrated multi-point no nā hopena quantitative. ʻAʻole pono ka kaohi maikaʻi e ikaika loa i hiki ai ke hoʻopilikia i ka haumia. E hoʻokomo i nā kaohi unuhi maikaʻi a maikaʻi ʻole i ka wā e hana ai i ka unuhi waikawa nucleic.
Manaʻo ʻia e kau ʻia nā ʻōlelo aʻoaʻo maopopo ma kēlā me kēia wahi i ʻike ai nā mea hoʻohana i nā lula o ka hana. Makemake paha nā keʻena hoʻokolohua e ʻike ana i nā pae haʻahaʻa loa o ka DNA a i ʻole RNA i nā hāpana lapaʻau e hoʻohana i ke ana palekana hou o ka loaʻa ʻana o nā ʻōnaehana lawelawe ea kaʻawale me ke kaomi ea maikaʻi iki i loko o nā lumi pre-PCR a me ke kaomi ea maikaʻi ʻole iki i loko o nā lumi post-PCR.
ʻO ka mea hope loa, he mea kōkua ka hoʻomohala ʻana i kahi hoʻolālā hōʻoia maikaʻi (QA). Pono e komo pū kekahi ʻano hoʻolālā me nā papa inoa o nā waihona reagent master a me nā waihona hana, nā lula no ka mālama ʻana i nā kime a me nā reagent, ka hōʻike ʻana i nā hopena kaohi, nā papahana hoʻomaʻamaʻa limahana, nā algorithms hoʻoponopono pilikia, a me nā hana hoʻoponopono inā pono.
6. Papa Kuhikuhi
ʻO Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Mokuna 3: Ke hoʻonohonoho ʻana i kahi keʻena hoʻokolohua qPCR. He palapala alakaʻi no ka hoʻāʻo ʻana i nā wai leʻaleʻa me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano qPCR USEPA 1611. Lansing- Ke Kulanui Mokuʻāina ʻo Michigan.
ʻO ke Ola Kino Lehulehu ʻEnelani, NHS. Nā kūlana UK no nā noiʻi microbiology: Hana Hoʻokolohua Maikaʻi i ka wā e hana ana i nā hoʻāʻo hoʻonui molekala). Alakaʻi Kūlana. 2013;4(4):1–15.
ʻO Mifflin T. Ke hoʻonohonoho nei i kahi keʻena hoʻokolohua PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
ʻO Schroeder S 2013. Mālama mau ʻana i nā centrifuges: hoʻomaʻemaʻe, mālama a me ka disinfection o nā centrifuges, rotors a me nā adapters (Pepa keʻokeʻo Helu 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
ʻO Viana RV, Wallis CL. Hoʻomaʻamaʻa Keʻena Lapaʻau Maikaʻi (GCLP) no nā hoʻokolohua e pili ana i ka molekala i hoʻohana ʻia i nā keʻena hoʻokolohua diagnostic, I loko o: Akyar I, mea hoʻoponopono. Nā spectra ākea o ka kaohi maikaʻi. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Ka manawa hoʻouna: Iulai-16-2020
