Metode deteksi molekuler nduweni kemampuan kanggo ngasilake volume asam nukleat sing akeh liwat amplifikasi jumlah jejak sing ditemokake ing sampel. Sanajan iki migunani kanggo ngaktifake deteksi sensitif, iki uga ngenalake kemungkinan kontaminasi liwat panyebaran aerosol amplifikasi ing lingkungan laboratorium. Nalika nindakake eksperimen, langkah-langkah bisa ditindakake kanggo nyegah kontaminasi reagen, peralatan laboratorium, lan ruang kerja, amarga kontaminasi kasebut bisa ngasilake asil positif palsu (utawa negatif palsu).
Kanggo mbantu nyuda kemungkinan kontaminasi, Praktik Laboratorium sing Apik kudu ditindakake saben wektu. Khususé, pancegahan kudu ditindakake babagan poin-poin ing ngisor iki:
1. Nangani reagen
2. Organisasi ruang kerja lan peralatan
3. Saran panggunaan lan pembersihan kanggo ruang molekul sing wis ditemtokake
4. Saran biologi molekuler umum
5. Kontrol internal
6. Bibliografi
1. Nangani reagen
Sentrifugasi tabung reagen sedhela sadurunge dibukak kanggo nyegah pembentukan aerosol. Aliquot reagen kanggo nyegah pembekuan-pencairan kaping pirang-pirang lan kontaminasi stok induk. Label lan tanggal kanthi jelas kabeh tabung reagen lan reaksi lan cathet log nomer lot lan batch reagen sing digunakake ing kabeh eksperimen. Pipet kabeh reagen lan sampel nggunakake ujung filter. Sadurunge tuku, disaranake kanggo ngonfirmasi karo pabrikan manawa ujung filter cocog karo merek pipet sing bakal digunakake.
2. Organisasi ruang kerja lan peralatan
Ruang kerja kudu diatur supaya alur kerjane mung sak arah, saka area sing resik (pra-PCR) menyang area sing reged (pasca-PCR). Pancegahan umum ing ngisor iki bakal mbantu nyuda kemungkinan kontaminasi. Duweni kamar sing wis ditemtokake, utawa paling ora area sing kapisah sacara fisik, kanggo: persiapan mastermix, ekstraksi asam nukleat lan tambahan cithakan DNA, amplifikasi lan penanganan produk sing diamplifikasi, lan analisis produk, contone elektroforesis gel.
Ing sawetara kahanan, duwe 4 kamar sing kapisah iku angel. Pilihan sing bisa ditindakake nanging kurang disenengi yaiku nindakake persiapan mastermix ing area penahanan, contone kabinet aliran laminar. Ing kasus amplifikasi PCR bersarang, persiapan mastermix kanggo reaksi babak kapindho kudu disiapake ing area 'resik' kanggo persiapan mastermix, nanging inokulasi nganggo produk PCR utama kudu ditindakake ing kamar amplifikasi, lan yen bisa ing area penahanan khusus (contone kabinet aliran laminar).
Saben kamar/area mbutuhake seperangkat pipet sing diwenehi label kanthi jelas, pucuk filter, rak tabung, vortex, centrifuge (yen ana), pulpen, reagen lab generik, jas lab, lan kothak sarung tangan sing bakal disimpen ing stasiun kerja masing-masing. Tangan kudu dikumbah lan sarung tangan lan jas lab diganti nalika pindhah antarane area sing wis ditemtokake. Reagen lan peralatan ora kena dipindhah saka area reged menyang area sing resik. Yen ana kasus ekstrem ing ngendi reagen utawa peralatan kudu dipindhah mundur, kudu didekontaminasi dhisik nganggo natrium hipoklorit 10%, banjur diusap nganggo banyu steril.
Cathetan
Larutan natrium hipoklorit 10% kudu digawe seger saben dina. Nalika digunakake kanggo dekontaminasi, wektu kontak minimal 10 menit kudu dipatuhi.
Utawa, produk sing kasedhiya sacara komersial sing wis divalidasi minangka dekontaminasi permukaan sing ngrusak DNA bisa digunakake yen rekomendasi keamanan lokal ora ngidini panggunaan natrium hipoklorit utawa yen natrium hipoklorit ora cocog kanggo dekontaminasi bagean logam saka peralatan.
Saenipun, staf kedah netepi etos alur kerja searah lan boten pindhah saking area reged (pasca-PCR) bali dhateng area resik (pra-PCR) ing dinten ingkang sami. Nanging, wonten wekdal nalika menika boten saged dihindari. Nalika wekdal kados mekaten muncul, personel kedah ngati-ati kangge ngumbah tangan kanthi resik, ngganti sarung tangan, ngginakaken jas lab ingkang sampun dipuntemtokaken lan boten ngenalaken peralatan ingkang badhe dipungawa metu saking ruangan malih, kadosta buku lab. Langkah-langkah kontrol kados mekaten kedah dipuntekanaken ing pelatihan staf babagan metode molekuler.
Sawise digunakake, papan bangku kudu diresiki nganggo 10% natrium hipoklorit (diterusake banyu steril kanggo mbusak pemutih sing isih ana), 70% etanol, utawa dekontaminan pemusnah DNA sing wis divalidasi lan kasedhiya sacara komersial. Idealnya, lampu ultra-violet (UV) kudu dipasang kanggo ngaktifake dekontaminasi kanthi iradiasi. Nanging, panggunaan lampu UV kudu diwatesi ing area kerja sing ditutup, kayata lemari pengaman, kanggo mbatesi paparan UV staf laboratorium. Tututi pandhuan pabrikan kanggo perawatan, ventilasi, lan pembersihan lampu UV kanggo mesthekake yen lampu tetep efektif.
Yen nggunakake etanol 70% tinimbang natrium hipoklorit, iradiasi nganggo cahya UV bakal dibutuhake kanggo ngrampungake dekontaminasi.
Aja ngresiki vortex lan centrifuge nganggo natrium hipoklorit; nanging, usap nganggo etanol 70% lan kena sinar UV, utawa gunakake dekontaminasi pemusnah DNA komersial. Kanggo tumpahan, takon karo pabrikan kanggo saran pembersihan luwih lanjut. Yen pandhuan pabrikan ngidini, pipet kudu disterilisasi kanthi rutin nganggo autoklaf. Yen pipet ora bisa diautoklaf, cukup ngresiki nganggo natrium hipoklorit 10% (diterusake usap nganggo banyu steril) utawa nganggo dekontaminasi pemusnah DNA komersial banjur kena sinar UV.
Ngresiki nganggo natrium hipoklorit persentase dhuwur pungkasane bisa ngrusak plastik lan logam pipet yen ditindakake kanthi rutin; priksa rekomendasi saka pabrikan dhisik. Kabeh peralatan kudu dikalibrasi kanthi rutin miturut jadwal sing disaranake pabrikan. Wong sing ditunjuk kudu tanggung jawab kanggo mesthekake yen jadwal kalibrasi dipatuhi, log rinci dijaga, lan label layanan ditampilake kanthi jelas ing peralatan.
3. Saran panggunaan lan pembersihan kanggo ruang molekul sing wis ditemtokake
Pra-PCR: Persiapan aliquoting reagen / mastermix: Iki kudu dadi papan sing paling resik sing digunakake kanggo persiapan eksperimen molekuler lan idealnya kudu dadi lemari aliran laminar sing ditunjuk sing dilengkapi lampu UV. Sampel, asam nukleat sing diekstrak, lan produk PCR sing diamplifikasi ora kena ditangani ing area iki. Reagen amplifikasi kudu disimpen ing mesin pembeku (utawa kulkas, miturut rekomendasi pabrikan) ing papan sing padha sing ditunjuk, idealnya ing jejere lemari aliran laminar utawa area pra-PCR. Sarung tangan kudu diganti saben mlebu area pra-PCR utawa lemari aliran laminar.
Area pra-PCR utawa kabinet aliran laminar kudu diresiki sadurunge lan sawise digunakake kaya ing ngisor iki: Usap kabeh barang ing kabinet, kayata pipet, kothak tip, vortex, centrifuge, rak tabung, pulpen, lan liya-liyane nganggo etanol 70% utawa dekontaminasi perusak DNA komersial, lan enteni nganti garing. Ing kasus area kerja sing ditutup, kayata kabinet aliran laminar, papakake sungkup ing cahya UV sajrone 30 menit.
Cathetan
Aja nganti reagen kena cahya UV; mung pindhah menyang lemari sawise resik. Yen nindakake PCR transkripsi balik, uga bisa mbantu ngusap permukaan lan peralatan nganggo larutan sing ngrusak RNase nalika kena. Iki bisa mbantu nyegah asil negatif palsu saka degradasi enzim RNA. Sawise dekontaminasi lan sadurunge nyiyapake mastermix, sarung tangan kudu diganti maneh, banjur lemari wis siap digunakake.
Pra-PCR: Ekstraksi asam nukleat/penambahan cithakan:
Asam nukleat kudu diekstrak lan ditangani ing area sing wis ditemtokake kapindho, nggunakake pipet, ujung filter, rak tabung, sarung tangan anyar, jas lab, lan peralatan liyane sing kapisah. Area iki uga kanggo tambahan cithakan, kontrol, lan garis tren menyang tabung utawa piring mastermix. Kanggo nyegah kontaminasi sampel asam nukleat sing diekstrak sing lagi dianalisis, disaranake ngganti sarung tangan sadurunge nangani kontrol utawa standar positif lan nggunakake pipet sing kapisah. Reagen PCR lan produk sing diamplifikasi ora kena dipipet ing area iki. Sampel kudu disimpen ing kulkas utawa freezer sing wis ditemtokake ing area sing padha. Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.
Pasca-PCR: Amplifikasi lan penanganan produk sing diamplifikasi
Ruang sing wis ditemtokake iki kanggo proses pasca-amplifikasi lan kudu kapisah sacara fisik saka area pra-PCR. Biasane ngemot termosikler lan platform wektu nyata, lan idealnya kudu duwe kabinet aliran laminar kanggo nambahake produk PCR babak 1 menyang reaksi babak 2, yen PCR bersarang ditindakake. Reagen PCR lan asam nukleat sing diekstrak ora kena ditangani ing area iki amarga risiko kontaminasi dhuwur. Area iki kudu duwe sarung tangan, jas lab, rak piring lan tabung, pipet, ujung filter, wadhah lan peralatan liyane sing kapisah. Tabung kudu disentrifugasi sadurunge dibukak. Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.
Pasca-PCR: Analisis produk
Kamar iki kanggo peralatan deteksi produk, contone tangki elektroforesis gel, power pack, transilluminator UV lan sistem dokumentasi gel. Area iki kudu duwe set sarung tangan, jas lab, rak piring lan tabung, pipet, ujung filter, wadhah lan peralatan liyane sing kapisah. Ora ana reagen liyane sing bisa digawa menyang area iki, kajaba pewarna pemuatan, penanda molekuler lan gel agarose, lan komponen buffer. Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.
Cathetan penting
Saenipun, kamar pra-PCR boten kedah dipunlebeti ing dina ingkang sami menawi pakaryan sampun dipunlampahi ing kamar pasca-PCR. Menawi menika boten saged dipunsingkiri, priksa manawa tangan sampun dipunkumbah rumiyin kanthi resik lan jas lab khusus dipunagem ing kamar kasebut. Buku lab lan dokumen boten kedah dipunbetahaken dhateng kamar pra-PCR menawi sampun dipunginakaken ing kamar pasca-PCR; menawi prelu, damel cetakan duplikat protokol/ID sampel, lsp.
4. Saran biologi molekuler umum
Gunakake sarung tangan tanpa bubuk kanggo nyegah inhibisi uji coba. Teknik pipetting sing bener iku penting banget kanggo nyuda kontaminasi. Pipetting sing salah bisa nyebabake cipratan nalika ngetokake cairan lan nggawe aerosol. Praktik sing apik kanggo pipetting sing bener bisa ditemokake ing pranala ing ngisor iki: Pandhuan Gilson kanggo pipetting, video teknik pipetting Anachem, Tabung centrifuge sadurunge dibukak, lan bukak kanthi ati-ati supaya ora cipratan. Tutup tabung langsung sawise digunakake kanggo nyegah kontaminan mlebu.
Nalika nindakake pirang-pirang reaksi, siapna siji mastermix sing ngemot reagen umum (kayata banyu, dNTP, buffer, primer lan enzim) kanggo nyuda jumlah transfer reagen lan nyuda ancaman kontaminasi. Disaranake kanggo nyetel mastermix ing es utawa blok adhem. Panggunaan enzim Hot Start bisa mbantu nyuda produksi produk sing ora spesifik. Lindungi reagen sing ngemot probe fluoresen saka cahya supaya ora degradasi.
5. Kontrol internal
Kalebu kontrol positif lan negatif sing wis dikarakterisasi kanthi apik lan dikonfirmasi, bebarengan karo kontrol tanpa templat ing kabeh reaksi, lan garis tren titrasi multi-titik kanggo reaksi kuantitatif. Kontrol positif ora kena kuwat banget nganti nyebabake risiko kontaminasi. Kalebu kontrol ekstraksi positif lan negatif nalika nindakake ekstraksi asam nukleat.
Disaranake supaya pandhuan sing jelas dipasang ing saben area supaya pangguna ngerti aturan tumindak. Laboratorium diagnostik sing ndeteksi tingkat DNA utawa RNA sing sithik banget ing sampel klinis bisa uga pengin ngetrapake langkah keamanan tambahan kanthi duwe sistem penanganan udara sing kapisah kanthi tekanan udara sing rada positif ing kamar pra-PCR lan tekanan udara sing rada negatif ing kamar pasca-PCR.
Pungkasan, ngembangake rencana jaminan kualitas (QA) iku migunani. Rencana kasebut kudu kalebu dhaptar stok master reagen lan stok kerja, aturan kanggo nyimpen kit lan reagen, pelaporan asil kontrol, program pelatihan staf, algoritma pemecahan masalah, lan tindakan perbaikan nalika dibutuhake.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Nyiapake laboratorium qPCR. Dokumen pandhuan kanggo nguji banyu rekreasi nggunakake metode qPCR USEPA 1611. Lansing- Universitas Negeri Michigan.
Kesehatan Masyarakat Inggris, NHS. Standar Inggris kanggo investigasi mikrobiologi: Praktik Laboratorium sing Apik nalika nindakake uji amplifikasi molekuler). Pandhuan Kualitas. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Nyiapake laboratorium PCR. Protokol Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Pangopènan rutin centrifuge: reresik, pangopènan lan disinfeksi centrifuge, rotor lan adaptor (Buku Putih No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Praktik Laboratorium Klinis sing Apik (GCLP) kanggo tes adhedhasar molekuler sing digunakake ing laboratorium diagnostik, Ing: Akyar I, editor. Spektrum kontrol kualitas sing amba. Rijeka, Kroasia: Intech; 2011: 29–52.
Wektu kiriman: 16 Juli 2020
