Moleculaire detectiemethoden kunnen een grote hoeveelheid nucleïnezuur produceren door de amplificatie van sporenhoeveelheden in monsters. Hoewel dit gunstig is voor een gevoelige detectie, brengt het ook het risico van contaminatie met zich mee door de verspreiding van amplificatie-aerosolen in de laboratoriumomgeving. Bij het uitvoeren van experimenten kunnen maatregelen worden genomen om contaminatie van reagentia, laboratoriumapparatuur en werkruimte te voorkomen, aangezien dergelijke contaminatie kan leiden tot vals-positieve (of vals-negatieve) resultaten.
Om de kans op besmetting te verkleinen, dient te allen tijde de goede laboratoriumpraktijk te worden gevolgd. In het bijzonder dienen de volgende voorzorgsmaatregelen in acht te worden genomen:
1. Omgaan met reagentia
2. Organisatie van de werkruimte en apparatuur
3. Gebruiks- en reinigingsadvies voor de daarvoor bestemde moleculaire ruimte
4. Algemeen advies over moleculaire biologie
5. Interne controles
6. Bibliografie
1. Omgaan met reagentia
Centrifugeer de reageerbuizen kort voordat u ze opent om de vorming van aerosolen te voorkomen. Verdeel de reagentia in porties om herhaaldelijk invriezen en ontdooien en de besmetting van de masterstocks te vermijden. Label en dateer alle reageerbuizen en reactiebuizen duidelijk en houd een logboek bij van de lot- en batchnummers van de gebruikte reagentia in alle experimenten. Pipetteer alle reagentia en monsters met filtertips. Controleer vóór aankoop bij de fabrikant of de filtertips geschikt zijn voor het merk pipet dat u wilt gebruiken.
2. Organisatie van de werkruimte en apparatuur
De werkruimte moet zo worden ingericht dat de werkstroom in één richting verloopt, van schone ruimtes (vóór PCR) naar vuile ruimtes (na PCR). De volgende algemene voorzorgsmaatregelen helpen de kans op besmetting te verkleinen. Zorg voor aparte, aangewezen ruimtes, of op zijn minst fysiek gescheiden zones, voor: het bereiden van de mastermix, het extraheren van nucleïnezuren en het toevoegen van DNA-templates, de amplificatie en verwerking van het geamplificeerde product, en de productanalyse, bijvoorbeeld gelelektroforese.
In sommige situaties is het lastig om vier aparte ruimtes te hebben. Een mogelijke, maar minder wenselijke optie is om de mastermixbereiding in een afgesloten ruimte uit te voeren, bijvoorbeeld een laminaire stromingskast. Bij geneste PCR-amplificatie moet de mastermix voor de tweede reactieronde worden bereid in de 'schone' ruimte voor mastermixbereiding, maar de inoculatie met het primaire PCR-product moet plaatsvinden in de amplificatieruimte, en indien mogelijk in een daarvoor bestemde afgesloten ruimte (bijvoorbeeld een laminaire stromingskast).
Elke ruimte/zone heeft een aparte set duidelijk gelabelde pipetten, filtertips, buisrekken, vortexmixers, centrifuges (indien van toepassing), pennen, algemene laboratoriumreagentia, laboratoriumjassen en dozen handschoenen nodig. Deze moeten op de respectievelijke werkplekken blijven. Handen moeten worden gewassen en handschoenen en laboratoriumjassen moeten worden verwisseld bij het verplaatsen tussen de aangewezen zones. Reagentia en apparatuur mogen niet van een vuile naar een schone zone worden verplaatst. Mocht er zich een extreem geval voordoen waarbij een reagens of apparaat toch moet worden teruggebracht, dan moet het eerst worden ontsmet met 10% natriumhypochloriet, gevolgd door afvegen met steriel water.
Opmerking
De 10% natriumhypochlorietoplossing moet dagelijks vers worden bereid. Bij gebruik voor ontsmetting dient een minimale contacttijd van 10 minuten in acht te worden genomen.
Als alternatief kunnen commercieel verkrijgbare producten die gevalideerd zijn als DNA-vernietigende oppervlakteontsmettingsmiddelen worden gebruikt, indien lokale veiligheidsvoorschriften het gebruik van natriumhypochloriet niet toestaan of indien natriumhypochloriet niet geschikt is voor het ontsmetten van de metalen onderdelen van apparatuur.
Idealiter zouden medewerkers zich moeten houden aan het principe van eenrichtingsverkeer in de werkstroom en niet op dezelfde dag van vuile ruimtes (na PCR) teruggaan naar schone ruimtes (vóór PCR). Er kunnen zich echter situaties voordoen waarin dit onvermijdelijk is. In dergelijke gevallen moeten medewerkers ervoor zorgen dat ze hun handen grondig wassen, handschoenen verwisselen, de daarvoor bestemde laboratoriumjas dragen en geen apparatuur meenemen die ze later weer mee naar buiten willen nemen, zoals laboratoriumboeken. Dergelijke beheersmaatregelen moeten worden benadrukt tijdens de training van medewerkers over moleculaire methoden.
Na gebruik moeten de werkbladen worden gereinigd met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door steriel water om resten bleekmiddel te verwijderen), 70% ethanol of een gevalideerd, commercieel verkrijgbaar DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel. Idealiter moeten ultraviolette (UV) lampen worden geïnstalleerd om ontsmetting door bestraling mogelijk te maken. Het gebruik van UV-lampen moet echter beperkt blijven tot afgesloten werkruimtes, zoals veiligheidskasten, om de blootstelling van het laboratoriumpersoneel aan UV-straling te beperken. Volg de instructies van de fabrikant voor het onderhoud, de ventilatie en de reiniging van de UV-lampen om ervoor te zorgen dat de lampen effectief blijven.
Als 70% ethanol in plaats van natriumhypochloriet wordt gebruikt, is bestraling met UV-licht nodig om de ontsmetting te voltooien.
Reinig de vortex en centrifuge niet met natriumhypochloriet; veeg ze in plaats daarvan af met 70% ethanol en stel ze bloot aan UV-licht, of gebruik een commercieel DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel. Raadpleeg bij morsen de fabrikant voor verder reinigingsadvies. Indien de instructies van de fabrikant dit toestaan, dienen pipetten routinematig te worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Als pipetten niet kunnen worden geautoclaveerd, volstaat het om ze te reinigen met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door grondig afvegen met steriel water) of met een commercieel DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel, gevolgd door blootstelling aan UV-licht.
Reinigen met een hoge concentratie natriumhypochloriet kan, indien regelmatig uitgevoerd, de kunststof en metalen onderdelen van pipetten beschadigen; raadpleeg eerst de aanbevelingen van de fabrikant. Alle apparatuur moet regelmatig worden gekalibreerd volgens het door de fabrikant aanbevolen schema. Een aangewezen persoon moet ervoor zorgen dat het kalibratieschema wordt nageleefd, dat gedetailleerde logboeken worden bijgehouden en dat service-etiketten duidelijk op de apparatuur worden aangebracht.
3. Gebruiks- en reinigingsadvies voor de daarvoor bestemde moleculaire ruimte
Voorbereiding op PCR: Afmeten van reagentia / bereiding van mastermix: Dit moet de schoonste ruimte zijn van alle ruimtes die gebruikt worden voor de voorbereiding van moleculaire experimenten en idealiter een daarvoor bestemde laminaire stromingskast met UV-lamp. Monsters, geëxtraheerd nucleïnezuur en geamplificeerde PCR-producten mogen niet in deze ruimte worden aangeraakt. Amplificatiereagentia moeten in een vriezer (of koelkast, volgens de aanbevelingen van de fabrikant) in dezelfde ruimte worden bewaard, idealiter naast de laminaire stromingskast of de voorbereidingsruimte voor PCR. Handschoenen moeten telkens worden verwisseld bij het betreden van de voorbereidingsruimte voor PCR of de laminaire stromingskast.
De pre-PCR-ruimte of laminaire stromingskast moet vóór en na gebruik als volgt worden gereinigd: Veeg alle items in de kast, zoals pipetten, tipboxen, vortexmixer, centrifuge, buisrekken, pennen, enz., af met 70% ethanol of een commercieel DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel en laat ze drogen. In het geval van een gesloten werkruimte, zoals een laminaire stromingskast, moet de kap gedurende 30 minuten aan UV-licht worden blootgesteld.
Opmerking
Stel reagentia niet bloot aan UV-licht; plaats ze pas in de kast nadat deze is gereinigd. Bij het uitvoeren van reverse transcriptie PCR kan het ook nuttig zijn om oppervlakken en apparatuur af te vegen met een oplossing die RNases bij contact afbreekt. Dit kan helpen om vals-negatieve resultaten door enzymatische afbraak van RNA te voorkomen. Na de ontsmetting en vóór het bereiden van de mastermix moeten de handschoenen nogmaals worden verwisseld, waarna de kast klaar is voor gebruik.
Pre-PCR: Nucleïnezuurextractie/toevoeging van template:
Nucleïnezuur moet worden geëxtraheerd en verwerkt in een aparte, daarvoor bestemde ruimte, met behulp van een aparte set pipetten, filtertips, buisrekken, schone handschoenen, laboratoriumjassen en andere apparatuur. Deze ruimte is ook bedoeld voor het toevoegen van template, controles en trendlijnen aan de mastermixbuizen of -platen. Om besmetting van de geëxtraheerde nucleïnezuurmonsters die worden geanalyseerd te voorkomen, wordt aanbevolen om handschoenen te verwisselen voordat positieve controles of standaarden worden gehanteerd en een aparte set pipetten te gebruiken. PCR-reagentia en geamplificeerde producten mogen niet in deze ruimte worden gepipetteerd. Monsters moeten worden bewaard in daarvoor bestemde koelkasten of vriezers in dezelfde ruimte. De monsterwerkruimte moet op dezelfde manier worden gereinigd als de mastermixruimte.
Na de PCR: Amplificatie en verwerking van het geamplificeerde product
Deze aangewezen ruimte is voor processen na de amplificatie en moet fysiek gescheiden zijn van de ruimtes vóór de PCR. Meestal bevat deze ruimte thermocyclers en real-time platforms, en idealiter een laminaire stromingskast voor het toevoegen van het PCR-product van ronde 1 aan de reactie van ronde 2, indien er geneste PCR wordt uitgevoerd. PCR-reagentia en geëxtraheerd nucleïnezuur mogen niet in deze ruimte worden gehanteerd, aangezien het risico op contaminatie hoog is. Deze ruimte moet beschikken over een aparte set handschoenen, labjassen, plaat- en buisrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur. Buisjes moeten worden gecentrifugeerd voordat ze worden geopend. De monsterwerkruimte moet op dezelfde manier worden gereinigd als de mastermixruimte.
Na de PCR: Productanalyse
Deze ruimte is bestemd voor apparatuur voor productdetectie, zoals gelelektroforese-tanks, voedingseenheden, UV-transilluminator en het geldocumentatiesysteem. In deze ruimte moeten aparte sets handschoenen, labjassen, plaat- en buisrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur aanwezig zijn. Er mogen geen andere reagentia in deze ruimte worden gebracht, met uitzondering van laadkleurstof, moleculaire marker, agarosegel en buffercomponenten. De monsterwerkruimte moet op dezelfde manier worden gereinigd als de mastermixruimte.
Belangrijke mededeling
Idealiter mogen de pre-PCR-ruimtes niet op dezelfde dag betreden worden als er al werkzaamheden in de post-PCR-ruimtes zijn verricht. Als dit absoluut onvermijdelijk is, zorg er dan voor dat de handen grondig gewassen worden en dat er specifieke laboratoriumjassen gedragen worden in de ruimtes. Laboratoriumboeken en -documenten mogen niet meegenomen worden naar de pre-PCR-ruimtes als ze in de post-PCR-ruimtes gebruikt zijn; maak indien nodig kopieën van protocollen/monster-ID's, enz.
4. Algemeen advies over moleculaire biologie
Gebruik poedervrije handschoenen om remming van de analyse te voorkomen. Een correcte pipetteertechniek is essentieel om contaminatie te verminderen. Onjuist pipetteren kan leiden tot spatten bij het doseren van vloeistoffen en de vorming van aerosolen. Goede praktijken voor correct pipetteren zijn te vinden via de volgende links: Gilson-handleiding voor pipetteren, Anachem-video's over pipetteertechnieken. Centrifugeer de buizen vóór het openen en open ze voorzichtig om spatten te voorkomen. Sluit de buizen direct na gebruik om de introductie van contaminanten te voorkomen.
Bij het uitvoeren van meerdere reacties is het raadzaam één mastermix te bereiden met gemeenschappelijke reagentia (bijv. water, dNTP's, buffer, primers en enzym) om het aantal overdrachten van reagentia te minimaliseren en de kans op contaminatie te verkleinen. Het is aan te raden de mastermix op ijs of een koelblok te zetten. Het gebruik van een Hot Start-enzym kan helpen de productie van niet-specifieke producten te verminderen. Bescherm reagentia die fluorescerende probes bevatten tegen licht om afbraak te voorkomen.
5. Interne controles
Voeg goed gekarakteriseerde, bevestigde positieve en negatieve controles toe, samen met een negatieve controle zonder template in alle reacties, en een getitreerde trendlijn met meerdere punten voor kwantitatieve reacties. De positieve controle mag niet zo sterk zijn dat deze een risico op contaminatie vormt. Voeg positieve en negatieve extractiecontroles toe bij het uitvoeren van nucleïnezuurextractie.
Het wordt aanbevolen om in elk van de ruimtes duidelijke instructies op te hangen, zodat gebruikers op de hoogte zijn van de gedragsregels. Diagnostische laboratoria die zeer lage concentraties DNA of RNA in klinische monsters detecteren, kunnen overwegen om als extra veiligheidsmaatregel aparte luchtbehandelingssystemen te gebruiken met een licht positieve luchtdruk in de ruimtes vóór de PCR-analyse en een licht negatieve luchtdruk in de ruimtes na de PCR-analyse.
Ten slotte is het ontwikkelen van een kwaliteitsborgingsplan (QA-plan) nuttig. Zo'n plan moet lijsten bevatten van de hoofdvoorraad en de werkvoorraad van reagentia, regels voor de opslag van kits en reagentia, rapportage van controleresultaten, trainingsprogramma's voor medewerkers, algoritmes voor probleemoplossing en corrigerende maatregelen wanneer nodig.
6. Bibliografie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Hoofdstuk 3: Het opzetten van een qPCR-laboratorium. Een richtlijn voor het testen van recreatiewateren met behulp van de USEPA qPCR-methode 1611. Lansing - Michigan State University.
Public Health England, NHS. Britse normen voor microbiologisch onderzoek: Goede laboratoriumpraktijk bij het uitvoeren van moleculaire amplificatietests. Kwaliteitsrichtlijnen. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Het opzetten van een PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Routinematig onderhoud van centrifuges: reiniging, onderhoud en desinfectie van centrifuges, rotors en adapters (Witboek nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Goede klinische laboratoriumpraktijk (GCLP) voor moleculaire testen die in diagnostische laboratoria worden gebruikt. In: Akyar I, redacteur. Breed spectrum van kwaliteitscontrole. Rijeka, Kroatië: Intech; 2011: 29–52.
Geplaatst op: 16 juli 2020
