Ang mga pamamaraan ng molekular na pagtuklas ay may kakayahang makagawa ng malaking dami ng nucleic acid sa pamamagitan ng pagpaparami ng mga bakas na dami na matatagpuan sa mga sample. Bagama't kapaki-pakinabang ito para sa pagpapagana ng sensitibong pagtuklas, ipinakikilala rin nito ang posibilidad ng kontaminasyon sa pamamagitan ng pagkalat ng mga amplification aerosols sa kapaligiran ng laboratoryo. Kapag nagsasagawa ng mga eksperimento, maaaring magsagawa ng mga hakbang upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga reagent, kagamitan sa laboratoryo at espasyo sa bench, dahil ang naturang kontaminasyon ay maaaring magdulot ng false-positive (o false-negative) na mga resulta.
Upang makatulong na mabawasan ang posibilidad ng kontaminasyon, dapat isagawa ang Good Laboratory Practice sa lahat ng oras. Partikular na dapat gawin ang mga pag-iingat patungkol sa mga sumusunod na punto:
1. Paghawak ng mga reagent
2. Organisasyon ng lugar ng trabaho at kagamitan
3. Payo sa paggamit at paglilinis para sa itinalagang espasyong molekular
4. Pangkalahatang payo sa molekular na biyolohiya
5. Mga panloob na kontrol
6. Bibliograpiya
1. Paghawak ng mga reagent
I-centrifuge sandali ang mga tubo ng reagent bago buksan upang maiwasan ang pagbuo ng mga aerosol. Paghiwalayin ang mga reagent upang maiwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at kontaminasyon ng mga master stock. Malinaw na lagyan ng label at petsa ang lahat ng reagent at reaction tube at itago ang mga talaan ng mga numero ng reagent lot at batch na ginamit sa lahat ng eksperimento. I-pipette ang lahat ng reagent at sample gamit ang mga filter tip. Bago bumili, ipinapayong kumpirmahin sa tagagawa na ang mga filter tip ay akma sa tatak ng pipette na gagamitin.
2. Organisasyon ng lugar ng trabaho at kagamitan
Dapat isaayos ang lugar ng trabaho upang matiyak na ang daloy ng trabaho ay nagaganap sa isang direksyon lamang, mula sa malinis na lugar (pre-PCR) patungo sa maruruming lugar (post-PCR). Ang mga sumusunod na pangkalahatang pag-iingat ay makakatulong upang mabawasan ang posibilidad ng kontaminasyon. Magkaroon ng magkakahiwalay na itinalagang mga silid, o kahit man lang pisikal na magkakahiwalay na mga lugar, para sa: paghahanda ng mastermix, pagkuha ng nucleic acid at pagdaragdag ng DNA template, pagpapalakas at paghawak ng pinalakas na produkto, at pagsusuri ng produkto, hal. gel electrophoresis.
Sa ilang mga sitwasyon, mahirap magkaroon ng 4 na magkakahiwalay na silid. Ang isang posible ngunit hindi gaanong kanais-nais na opsyon ay ang paggawa ng mastermix preparation sa isang containment area, hal. isang laminar flow cabinet. Sa kaso ng nested PCR amplification, ang paghahanda ng mastermix para sa second round reaction ay dapat ihanda sa 'malinis' na lugar para sa paghahanda ng mastermix, ngunit ang inoculation gamit ang primary PCR product ay dapat gawin sa amplification room, at kung maaari sa isang nakalaang containment area (hal. isang laminar flow cabinet).
Ang bawat silid/lugar ay nangangailangan ng hiwalay na set ng mga pipette, filter tip, tube rack, vortex, centrifuge (kung naaangkop), panulat, generic lab reagents, lab coat at mga kahon ng guwantes na mananatili sa kani-kanilang mga workstation. Dapat hugasan ang mga kamay at palitan ang mga guwantes at lab coat kapag lumilipat sa pagitan ng mga itinalagang lugar. Ang mga reagent at kagamitan ay hindi dapat ilipat mula sa isang maruming lugar patungo sa isang malinis na lugar. Kung sakaling magkaroon ng matinding kaso kung saan kailangang ilipat pabalik ang isang reagent o kagamitan, dapat muna itong disimpektahin gamit ang 10% sodium hypochlorite, na susundan ng pagpahid gamit ang sterile na tubig.
Tala
Ang 10% sodium hypochlorite solution ay dapat na sariwa araw-araw. Kapag ginagamit para sa dekontaminasyon, dapat sundin ang minimum na oras ng pakikipag-ugnayan na 10 minuto.
Bilang alternatibo, maaaring gamitin ang mga produktong mabibili sa komersyo na napatunayang mga pang-alis ng kontaminante sa ibabaw na sumisira ng DNA kung ang mga lokal na rekomendasyon sa kaligtasan ay hindi pinahihintulutan ang paggamit ng sodium hypochlorite o kung ang sodium hypochlorite ay hindi angkop para sa pag-alis ng kontaminado sa mga metal na bahagi ng kagamitan.
Sa isip, dapat sundin ng mga kawani ang unidirectional work flow ethos at hindi na babalik sa malinis na lugar (pre-PCR) sa parehong araw. Gayunpaman, maaaring may mga pagkakataon na hindi ito maiiwasan. Kapag lumitaw ang ganitong pagkakataon, dapat mag-ingat ang mga tauhan na maghugas nang mabuti ng mga kamay, magpalit ng guwantes, gumamit ng itinalagang lab coat at huwag magdala muli ng anumang kagamitan na gugustuhin nilang ilabas sa silid, tulad ng mga lab book. Ang mga ganitong hakbang sa pagkontrol ay dapat bigyang-diin sa pagsasanay ng mga kawani sa mga pamamaraang molekular.
Pagkatapos gamitin, dapat linisin ang mga upuan gamit ang 10% sodium hypochlorite (kasunod ang sterile na tubig upang maalis ang natitirang bleach), 70% ethanol, o isang napatunayang komersyal na mabibiling DNA-destroying decontaminant. Sa isip, dapat maglagay ng mga ultra-violet (UV) lamp upang ma-decontact ang contamination sa pamamagitan ng irradiation. Gayunpaman, ang paggamit ng mga UV lamp ay dapat limitahan sa mga saradong lugar ng trabaho, hal. mga safety cabinet, upang limitahan ang pagkakalantad ng mga kawani ng laboratoryo sa UV. Mangyaring sundin ang mga tagubilin ng tagagawa para sa pangangalaga, bentilasyon, at paglilinis ng mga UV lamp upang matiyak na mananatiling epektibo ang mga lampara.
Kung gagamit ng 70% ethanol sa halip na sodium hypochlorite, kakailanganin ang pag-iilaw gamit ang UV light upang makumpleto ang dekontaminasyon.
Huwag linisin ang vortex at centrifuge gamit ang sodium hypochlorite; sa halip, punasan ito gamit ang 70% ethanol at ilantad sa UV light, o gumamit ng komersyal na DNA-destroying decontaminant. Para sa mga natapon, kumunsulta sa tagagawa para sa karagdagang payo sa paglilinis. Kung pinahihintulutan ng mga tagubilin ng tagagawa, ang mga pipette ay dapat na regular na isterilisahin gamit ang autoclave. Kung ang mga pipette ay hindi maaaring i-autoclave, sapat na ang paglilinis ng mga ito gamit ang 10% sodium hypochlorite (na susundan ng masusing pagpahid gamit ang sterile na tubig) o gamit ang isang komersyal na DNA-destroying decontaminant na susundan ng pagkakalantad sa UV.
Ang paglilinis gamit ang mataas na porsyento ng sodium hypochlorite ay maaaring makapinsala sa mga plastik at metal na pipette kung gagawin nang regular; suriin muna ang mga rekomendasyon mula sa tagagawa. Ang lahat ng kagamitan ay kailangang regular na i-calibrate ayon sa iskedyul na inirerekomenda ng tagagawa. Ang isang itinalagang tao ay dapat na namamahala sa pagtiyak na ang iskedyul ng calibration ay nasusunod, ang mga detalyadong talaan ay pinapanatili, at ang mga label ng serbisyo ay malinaw na nakadispley sa kagamitan.
3. Payo sa paggamit at paglilinis para sa itinalagang espasyong molekular
Pre-PCR: Paghahanda ng reagent aliquoting / mastermix: Ito dapat ang pinakamalinis sa lahat ng espasyong ginagamit para sa paghahanda ng mga eksperimentong molekular at dapat ay isang itinalagang laminar flow cabinet na may UV light. Ang mga sample, kinuhang nucleic acid, at mga produktong pinalakas ng PCR ay hindi dapat hawakan sa lugar na ito. Ang mga amplification reagent ay dapat itago sa isang freezer (o refrigerator, ayon sa rekomendasyon ng tagagawa) sa parehong itinalagang espasyo, mas mainam kung katabi ng laminar flow cabinet o pre-PCR area. Dapat palitan ang mga guwantes sa bawat pagpasok sa pre-PCR area o laminar flow cabinet.
Ang pre-PCR area o laminar flow cabinet ay dapat linisin bago at pagkatapos gamitin gaya ng sumusunod: Punasan ang lahat ng bagay sa cabinet, hal. mga pipette, tip box, vortex, centrifuge, tube racks, pen, atbp. gamit ang 70% ethanol o isang komersyal na DNA-decontaminant na sumisira ng DNA, at hayaang matuyo. Sa kaso ng isang saradong working area, hal. isang laminar flow cabinet, ilantad ang hood sa UV light sa loob ng 30 minuto.
Tala
Huwag ilantad ang mga reagent sa UV light; ilipat lamang ang mga ito sa cabinet kapag malinis na ito. Kung magsasagawa ng reverse transcription PCR, makakatulong din na punasan ang mga ibabaw at kagamitan gamit ang solusyon na sumisira sa mga RNase kapag nadikitan. Makakatulong ito upang maiwasan ang mga maling negatibong resulta mula sa pagkasira ng enzyme ng RNA. Pagkatapos ng dekontaminasyon at bago ihanda ang mastermix, dapat palitan muli ang mga guwantes, at pagkatapos ay handa nang gamitin ang cabinet.
Pre-PCR: Pagkuha ng nucleic acid/pagdaragdag ng template:
Ang nucleic acid ay dapat kunin at hawakan sa pangalawang itinalagang lugar, gamit ang isang hiwalay na set ng mga pipette, filter tip, tube rack, bagong guwantes, lab coat at iba pang kagamitan. Ang lugar na ito ay para rin sa pagdaragdag ng template, mga kontrol at mga trendline sa mga mastermix tube o plate. Upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga nakuha na sample ng nucleic acid na sinusuri, inirerekomenda na palitan ang mga guwantes bago hawakan ang mga positibong kontrol o pamantayan at gumamit ng isang hiwalay na set ng mga pipette. Ang mga PCR reagent at mga amplified product ay hindi dapat ilagay sa pipette sa lugar na ito. Ang mga sample ay dapat iimbak sa mga itinalagang refrigerator o freezer sa parehong lugar. Ang sample workspace ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng mastermix space.
Post-PCR: Pagpaparami at paghawak ng produktong pinarami
Ang itinalagang espasyong ito ay para sa mga proseso pagkatapos ng amplipikasyon at dapat na pisikal na hiwalay mula sa mga lugar na pre-PCR. Karaniwan itong naglalaman ng mga thermocycler at real-time platform, at sa isip ay dapat mayroong laminar flow cabinet para sa pagdaragdag ng round 1 PCR product sa round 2 reaction, kung isinasagawa ang nested PCR. Ang mga PCR reagents at extracted nucleic acid ay hindi dapat hawakan sa lugar na ito dahil mataas ang panganib ng kontaminasyon. Ang lugar na ito ay dapat mayroong hiwalay na set ng mga guwantes, lab coat, plate at tube racks, pipette, filter tip, bin at iba pang kagamitan. Ang mga tubo ay dapat i-centrifuge bago buksan. Ang sample workspace ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng mastermix space.
Post-PCR: Pagsusuri ng produkto
Ang silid na ito ay para sa mga kagamitan sa pagtukoy ng produkto, hal. mga tangke ng gel electrophoresis, mga power pack, UV transilluminator at ang sistema ng dokumentasyon ng gel. Ang lugar na ito ay dapat may magkakahiwalay na set ng guwantes, lab coat, mga rack ng plato at tubo, mga pipette, mga tip sa filter, mga lalagyan at iba pang kagamitan. Walang ibang reagent ang maaaring dalhin sa lugar na ito, maliban sa loading dye, molecular marker at agarose gel, at mga bahagi ng buffer. Ang workspace ng sample ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng espasyo ng mastermix.
Mahalagang tala
Sa isip, ang mga silid na pre-PCR ay hindi dapat pasukin sa parehong araw kung ang trabaho ay naisagawa na sa mga silid na post-PCR. Kung hindi ito maiiwasan, siguraduhing hugasan muna nang mabuti ang mga kamay at magsuot ng mga partikular na lab coat sa mga silid. Ang mga lab book at papeles ay hindi dapat dalhin sa mga silid na pre-PCR kung ginamit na ang mga ito sa mga silid na post-PCR; kung kinakailangan, kumuha ng mga dobleng print-out ng mga protocol/sample ID, atbp.
4. Pangkalahatang payo sa molekular na biyolohiya
Gumamit ng powder-free gloves upang maiwasan ang assay inhibition. Ang wastong pamamaraan ng pipetting ay napakahalaga sa pagbabawas ng kontaminasyon. Ang maling pipetting ay maaaring magresulta sa pagtalsik kapag naglalabas ng mga likido at paglikha ng mga aerosol. Ang mahusay na kasanayan para sa wastong pipetting ay matatagpuan sa mga sumusunod na link: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes bago buksan, at buksan ang mga ito nang maingat upang maiwasan ang pagtalsik. Isara kaagad ang mga tubo pagkatapos gamitin upang maiwasan ang pagpasok ng mga kontaminante.
Kapag nagsasagawa ng maraming reaksyon, maghanda ng isang mastermix na naglalaman ng mga karaniwang reagent (hal. tubig, dNTP, buffer, primer at enzyme) upang mabawasan ang bilang ng mga paglilipat ng reagent at mabawasan ang banta ng kontaminasyon. Inirerekomenda na ilagay ang mastermix sa yelo o isang cold block. Ang paggamit ng Hot Start enzyme ay maaaring makatulong upang mabawasan ang produksyon ng mga hindi tiyak na produkto. Protektahan ang mga reagent na naglalaman ng fluorescent probes mula sa liwanag upang maiwasan ang pagkasira.
5. Mga panloob na kontrol
Isama ang mga mahusay na nailalarawan at nakumpirmang positibo at negatibong kontrol, kasama ang isang walang-template na kontrol sa lahat ng reaksyon, at isang multi-point titrated trendline para sa mga quantitative na reaksyon. Ang positibong kontrol ay hindi dapat maging napakalakas na nagdudulot ng panganib ng kontaminasyon. Isama ang mga positibo at negatibong kontrol sa pagkuha ng nucleic acid kapag nagsasagawa ng pagkuha ng nucleic acid.
Inirerekomenda na maglagay ng malinaw na mga tagubilin sa bawat lugar upang malaman ng mga gumagamit ang mga tuntunin ng pag-uugali. Ang mga diagnostic lab na nakakakita ng napakababang antas ng DNA o RNA sa mga klinikal na sample ay maaaring gumamit ng karagdagang hakbang sa seguridad sa pamamagitan ng pagkakaroon ng magkakahiwalay na sistema ng paghawak ng hangin na may bahagyang positibong presyon ng hangin sa mga silid na pre-PCR at bahagyang negatibong presyon ng hangin sa mga silid na post-PCR.
Panghuli, ang pagbuo ng isang plano ng quality assurance (QA). Dapat kasama sa ganitong plano ang mga listahan ng mga reagent master stock at working stock, mga tuntunin para sa pag-iimbak ng mga kit at reagent, pag-uulat ng mga resulta ng kontrol, mga programa sa pagsasanay ng kawani, mga algorithm sa pag-troubleshoot, at mga aksyong remedial kung kinakailangan.
6. Bibliograpiya
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kabanata 3: Pagtatayo ng isang laboratoryo ng qPCR. Isang dokumentong gabay para sa pagsubok ng mga tubig pang-libangan gamit ang pamamaraang USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.
Public Health England, NHS. Mga pamantayan ng UK para sa mga imbestigasyon sa mikrobiyolohiya: Mabuting Pagsasanay sa Laboratoryo kapag nagsasagawa ng mga assay ng molecular amplification). Gabay sa Kalidad. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Pagtatayo ng laboratoryo ng PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Regular na pagpapanatili ng mga centrifuge: paglilinis, pagpapanatili at pagdidisimpekta ng mga centrifuge, rotor at adapter (White paper No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) para sa mga pagsusuring nakabatay sa molekula na ginagamit sa mga laboratoryong diagnostic, Sa: Akyar I, editor. Malawak na spectra ng kontrol sa kalidad. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Oras ng pag-post: Hulyo 16, 2020
