Moleküler tespit yöntemleri, örneklerde bulunan eser miktardaki nükleik asidin çoğaltılması yoluyla büyük miktarda nükleik asit üretme yeteneğine sahiptir. Bu, hassas tespit için faydalı olsa da, laboratuvar ortamında çoğaltma aerosollerinin yayılması yoluyla kontaminasyon olasılığını da beraberinde getirir. Deneyler yapılırken, reaktiflerin, laboratuvar ekipmanının ve çalışma alanının kontaminasyonunu önlemek için önlemler alınabilir, çünkü bu tür kontaminasyon yanlış pozitif (veya yanlış negatif) sonuçlar doğurabilir.
Kontaminasyon olasılığını azaltmak için her zaman İyi Laboratuvar Uygulamaları uygulanmalıdır. Özellikle aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir:
1. Reaktiflerin kullanımı
2. Çalışma alanının ve ekipmanların düzenlenmesi
3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik önerileri
4. Genel moleküler biyoloji tavsiyeleri
5. İç kontroller
6. Kaynakça
1. Reaktiflerin kullanımı
Aerosol oluşumunu önlemek için reaktif tüplerini açmadan önce kısa süreliğine santrifüjleyin. Çoklu dondurma-çözme işlemlerinden ve ana stokların kirlenmesinden kaçınmak için reaktifleri porsiyonlara ayırın. Tüm reaktif ve reaksiyon tüplerini açıkça etiketleyin ve tarihleyin ve tüm deneylerde kullanılan reaktif lot ve parti numaralarının kaydını tutun. Tüm reaktifleri ve numuneleri filtre uçlu pipetler kullanarak pipetleyin. Satın almadan önce, filtre uçlarının kullanılacak pipet markasına uygun olup olmadığını üreticiyle teyit etmeniz önerilir.
2. Çalışma alanının ve ekipmanların düzenlenmesi
Çalışma alanı, iş akışının tek yönde, temiz alanlardan (PCR öncesi) kirli alanlara (PCR sonrası) doğru gerçekleşmesini sağlayacak şekilde düzenlenmelidir. Aşağıdaki genel önlemler kontaminasyon olasılığını azaltmaya yardımcı olacaktır: Mastermix hazırlama, nükleik asit ekstraksiyonu ve DNA şablonu ekleme, amplifikasyon ve amplifiye edilmiş ürünün işlenmesi ve ürün analizi (örneğin jel elektroforezi) için ayrı odalar veya en azından fiziksel olarak ayrı alanlar bulunmalıdır.
Bazı ortamlarda 4 ayrı odaya sahip olmak zordur. Olası ancak daha az tercih edilen bir seçenek, mastermix hazırlığını bir izolasyon alanında, örneğin laminar akış kabininde yapmaktır. İç içe PCR amplifikasyonu durumunda, ikinci tur reaksiyon için mastermix hazırlığı, mastermix hazırlığı için ayrılmış 'temiz' alanda yapılmalı, ancak birincil PCR ürünü ile aşılama, amplifikasyon odasında ve mümkünse özel bir izolasyon alanında (örneğin laminar akış kabininde) yapılmalıdır.
Her oda/alan için ayrı bir set halinde, açıkça etiketlenmiş pipetler, filtre uçları, tüp rafları, vorteks cihazları, santrifüjler (gerekiyorsa), kalemler, genel laboratuvar reaktifleri, laboratuvar önlükleri ve eldiven kutuları bulundurulmalıdır ve bunlar ilgili çalışma istasyonlarında kalmalıdır. Belirlenen alanlar arasında hareket ederken eller yıkanmalı ve eldivenler ile laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir. Reaktifler ve ekipmanlar kirli bir alandan temiz bir alana taşınmamalıdır. Bir reaktifin veya ekipmanın geriye taşınması gereken istisnai bir durum ortaya çıkarsa, önce %10 sodyum hipoklorit ile dezenfekte edilmeli, ardından steril su ile silinmelidir.
Not
%10'luk sodyum hipoklorit çözeltisi her gün taze olarak hazırlanmalıdır. Dekontaminasyon amacıyla kullanıldığında, en az 10 dakikalık temas süresine uyulmalıdır.
Alternatif olarak, yerel güvenlik önerileri sodyum hipoklorit kullanımına izin vermiyorsa veya sodyum hipoklorit ekipmanın metal parçalarının dekontaminasyonu için uygun değilse, DNA'yı yok eden yüzey dekontaminasyon ürünleri olarak doğrulanmış, piyasada bulunan ticari ürünler kullanılabilir.
İdeal olarak, personel tek yönlü iş akışı ilkesine uymalı ve aynı gün içinde kirli alanlardan (PCR sonrası) temiz alanlara (PCR öncesi) geri dönmemelidir. Ancak, bunun kaçınılmaz olduğu durumlar olabilir. Böyle bir durum ortaya çıktığında, personel ellerini iyice yıkamalı, eldivenlerini değiştirmeli, belirlenmiş laboratuvar önlüğünü giymeli ve laboratuvar defterleri gibi tekrar odadan çıkarmak isteyecekleri herhangi bir ekipmanı içeri sokmamalıdır. Bu tür kontrol önlemleri, moleküler yöntemler konusunda personel eğitiminde vurgulanmalıdır.
Kullanımdan sonra, çalışma yüzeyleri %10 sodyum hipoklorit (artık ağartıcıyı gidermek için steril su ile durulama), %70 etanol veya onaylanmış, piyasada bulunan DNA'yı yok eden bir dezenfektan ile temizlenmelidir. İdeal olarak, ışınlama yoluyla dekontaminasyon sağlamak için ultraviyole (UV) lambalar takılmalıdır. Bununla birlikte, laboratuvar personelinin UV maruziyetini sınırlamak için UV lambalarının kullanımı kapalı çalışma alanlarıyla, örneğin güvenlik kabinleriyle sınırlandırılmalıdır. Lambaların etkili kalmasını sağlamak için lütfen UV lamba bakımı, havalandırma ve temizliği ile ilgili üretici talimatlarına uyun.
Sodyum hipoklorit yerine %70'lik etanol kullanılıyorsa, dekontaminasyonu tamamlamak için UV ışığı ile ışınlama gerekecektir.
Vorteks ve santrifüjü sodyum hipoklorit ile temizlemeyin; bunun yerine %70 etanol ile silin ve UV ışığına maruz bırakın veya ticari bir DNA yok edici dezenfektan kullanın. Dökülmeler için, daha fazla temizlik tavsiyesi için üreticiye danışın. Üretici talimatları izin veriyorsa, pipetler düzenli olarak otoklavda sterilize edilmelidir. Pipetler otoklavda sterilize edilemiyorsa, %10 sodyum hipoklorit ile (ardından steril suyla iyice silinerek) veya ticari bir DNA yok edici dezenfektanla temizlenip ardından UV ışığına maruz bırakılması yeterli olacaktır.
Yüksek oranda sodyum hipoklorit ile temizlik, düzenli olarak yapıldığında pipetlerin plastik ve metal aksamlarına zarar verebilir; öncelikle üreticinin önerilerini kontrol edin. Tüm ekipmanların, üretici tarafından önerilen programa göre düzenli olarak kalibre edilmesi gerekir. Kalibrasyon programına uyulduğundan, ayrıntılı kayıtların tutulduğundan ve servis etiketlerinin ekipman üzerinde açıkça görüldüğünden emin olmak için görevlendirilmiş bir kişi olmalıdır.
3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik önerileri
PCR Öncesi: Reaktiflerin bölümlendirilmesi / mastermix hazırlığı: Bu alan, moleküler deneylerin hazırlanması için kullanılan tüm alanlar arasında en temiz olanı olmalı ve ideal olarak UV ışığı ile donatılmış, özel olarak ayrılmış bir laminar akış kabini olmalıdır. Numuneler, ekstrakte edilmiş nükleik asit ve çoğaltılmış PCR ürünleri bu alanda elleçlenmemelidir. Çoğaltma reaktifleri, aynı özel alanda, ideal olarak laminar akış kabininin veya PCR öncesi alanın yanında, bir dondurucuda (veya üretici tavsiyelerine göre buzdolabında) saklanmalıdır. PCR öncesi alana veya laminar akış kabinine her girildiğinde eldivenler değiştirilmelidir.
PCR öncesi alan veya laminar akış kabini, kullanımdan önce ve sonra aşağıdaki şekilde temizlenmelidir: Kabin içindeki tüm eşyalar (örneğin pipetler, uç kutuları, vorteks cihazı, santrifüj, tüp rafları, kalemler vb.) %70 etanol veya ticari bir DNA yok edici dezenfektan ile silin ve kurumaya bırakın. Kapalı bir çalışma alanı söz konusu olduğunda (örneğin laminar akış kabini), kabin başlığını 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
Not
Reaktifleri UV ışığına maruz bırakmayın; kabin temizlendikten sonra ancak içine yerleştirin. Ters transkripsiyon PCR yapıyorsanız, RNazları temas halinde parçalayan bir solüsyonla yüzeyleri ve ekipmanı silmek de faydalı olabilir. Bu, RNA'nın enzimle parçalanmasından kaynaklanan yanlış negatif sonuçlardan kaçınmaya yardımcı olabilir. Dekontaminasyondan sonra ve mastermix hazırlanmadan önce eldivenler tekrar değiştirilmeli ve ardından kabin kullanıma hazır hale gelmelidir.
PCR öncesi: Nükleik asit ekstraksiyonu/şablon eklenmesi:
Nükleik asit, ayrı bir pipet seti, filtre uçları, tüp rafları, yeni eldivenler, laboratuvar önlükleri ve diğer ekipmanlar kullanılarak, belirlenmiş ikinci bir alanda ekstrakte edilmeli ve işlenmelidir. Bu alan ayrıca, mastermix tüplerine veya plakalarına şablon, kontroller ve trend çizgileri eklemek için de kullanılır. Analiz edilen ekstrakte edilmiş nükleik asit örneklerinin kontaminasyonunu önlemek için, pozitif kontroller veya standartlar kullanılmadan önce eldivenlerin değiştirilmesi ve ayrı bir pipet seti kullanılması önerilir. PCR reaktifleri ve amplifiye edilmiş ürünler bu alanda pipetlenmemelidir. Örnekler, aynı alandaki belirlenmiş buzdolaplarında veya dondurucularda saklanmalıdır. Örnek çalışma alanı, mastermix alanı ile aynı şekilde temizlenmelidir.
PCR Sonrası: Amplifikasyon ve amplifiye edilmiş ürünün işlenmesi
Bu ayrılmış alan, amplifikasyon sonrası işlemler içindir ve PCR öncesi alanlardan fiziksel olarak ayrı olmalıdır. Genellikle termal döngüleyiciler ve gerçek zamanlı platformlar içerir ve ideal olarak, iç içe PCR yapılıyorsa, 1. tur PCR ürününü 2. tur reaksiyonuna eklemek için bir laminar akış kabini bulunmalıdır. PCR reaktifleri ve ekstrakte edilmiş nükleik asit, kontaminasyon riski yüksek olduğundan bu alanda kullanılmamalıdır. Bu alanda ayrı bir eldiven seti, laboratuvar önlüğü, plaka ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, kaplar ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır. Tüpler açılmadan önce santrifüj edilmelidir. Numune çalışma alanı, mastermix alanı ile aynı şekilde temizlenmelidir.
PCR sonrası: Ürün analizi
Bu oda, jel elektroforez tankları, güç üniteleri, UV transilluminatör ve jel dokümantasyon sistemi gibi ürün tespit ekipmanları içindir. Bu alanda ayrı eldiven setleri, laboratuvar önlükleri, plaka ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, kaplar ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır. Yükleme boyası, moleküler işaretleyici ve agaroz jel ile tampon bileşenleri hariç, bu alana başka hiçbir reaktif getirilemez. Numune çalışma alanı, mastermix alanı ile aynı şekilde temizlenmelidir.
Önemli not
İdeal olarak, PCR sonrası odalarda çalışma yapıldıktan sonra aynı gün PCR öncesi odalara girilmemelidir. Bu tamamen kaçınılmaz ise, öncelikle ellerin iyice yıkanması ve odalarda özel laboratuvar önlüklerinin giyilmesi sağlanmalıdır. Laboratuvar defterleri ve evraklar, PCR sonrası odalarda kullanılmışsa PCR öncesi odalara getirilmemelidir; gerekirse, protokollerin/örnek kimliklerinin vb. yedek çıktılarını alın.
4. Genel moleküler biyoloji tavsiyeleri
Deney inhibisyonunu önlemek için pudrasız eldiven kullanın. Kontaminasyonu azaltmak için doğru pipetleme tekniği çok önemlidir. Yanlış pipetleme, sıvıların dağıtılması sırasında sıçramaya ve aerosol oluşumuna neden olabilir. Doğru pipetleme için iyi uygulama yöntemleri aşağıdaki bağlantılarda bulunabilir: Gilson pipetleme kılavuzu, Anachem pipetleme tekniği videoları, açmadan önce santrifüj tüplerini dikkatlice açın ve sıçramayı önleyin. Kontaminantların girmesini önlemek için tüpleri kullanımdan hemen sonra kapatın.
Birden fazla reaksiyon gerçekleştirirken, reaktif transferlerinin sayısını en aza indirmek ve kontaminasyon riskini azaltmak için ortak reaktifleri (örneğin su, dNTP'ler, tampon, primerler ve enzim) içeren tek bir ana karışım hazırlayın. Ana karışımı buz veya soğuk blok üzerinde hazırlamanız önerilir. Sıcak Başlangıç enzimi kullanımı, spesifik olmayan ürünlerin oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir. Floresan problar içeren reaktifleri bozulmayı önlemek için ışıktan koruyun.
5. İç kontroller
Tüm reaksiyonlarda iyi tanımlanmış, doğrulanmış pozitif ve negatif kontrollerin yanı sıra şablon içermeyen bir kontrol ve kantitatif reaksiyonlar için çok noktalı titrasyonlu bir eğilim çizgisi ekleyin. Pozitif kontrol, kontaminasyon riski oluşturacak kadar güçlü olmamalıdır. Nükleik asit ekstraksiyonu yapılırken pozitif ve negatif ekstraksiyon kontrolleri ekleyin.
Kullanıcıların davranış kurallarından haberdar olmaları için her alanda açık talimatların asılması önerilir. Klinik örneklerde çok düşük seviyelerde DNA veya RNA tespit eden tanı laboratuvarları, PCR öncesi odalarda hafif pozitif hava basıncı ve PCR sonrası odalarda hafif negatif hava basıncı sağlayan ayrı havalandırma sistemlerine sahip olma gibi ek bir güvenlik önlemi almayı düşünebilirler.
Son olarak, bir kalite güvence (KG) planı geliştirmek faydalıdır. Bu plan, reaktif ana stokları ve çalışma stoklarının listelerini, kitlerin ve reaktiflerin saklanmasına ilişkin kuralları, kontrol sonuçlarının raporlanmasını, personel eğitim programlarını, sorun giderme algoritmalarını ve gerektiğinde düzeltici eylemleri içermelidir.
6. Kaynakça
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bölüm 3: Bir qPCR laboratuvarının kurulması. USEPA qPCR yöntemi 1611 kullanılarak rekreasyonel suların test edilmesi için bir kılavuz belge. Lansing-Michigan Eyalet Üniversitesi.
İngiltere Halk Sağlığı Kurumu, NHS. Mikrobiyoloji araştırmaları için Birleşik Krallık standartları: Moleküler amplifikasyon testleri yapılırken İyi Laboratuvar Uygulamaları). Kalite Rehberi. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Bir PCR laboratuvarı kurmak. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Santrifüjlerin rutin bakımı: santrifüjlerin, rotorların ve adaptörlerin temizliği, bakımı ve dezenfeksiyonu (Teknik belge No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Tanı laboratuvarlarında kullanılan moleküler tabanlı testler için İyi Klinik Laboratuvar Uygulamaları (GCLP), Akyar I, editör. Geniş kalite kontrol yelpazesi. Rijeka, Hırvatistan: Intech; 2011: 29–52.
Yayın tarihi: 16 Temmuz 2020
