Ang mga pamaagi sa pag-detect sa molekula adunay abilidad sa paghimo og daghang gidaghanon sa nucleic acid pinaagi sa pagpadako sa gamay nga kantidad nga makita sa mga sample. Samtang kini mapuslanon alang sa pagpahimo sa sensitibo nga pag-detect, kini usab nagpaila sa posibilidad sa kontaminasyon pinaagi sa pagkaylap sa mga amplification aerosols sa palibot sa laboratoryo. Kung nagpahigayon og mga eksperimento, ang mga lakang mahimong buhaton aron malikayan ang kontaminasyon sa mga reagent, kagamitan sa laboratoryo ug espasyo sa bench, tungod kay ang ingon nga kontaminasyon mahimong makamugna og sayop nga positibo (o sayop nga negatibo) nga mga resulta.
Aron makatabang sa pagpakunhod sa posibilidad sa kontaminasyon, ang Good Laboratory Practice kinahanglan nga ipatuman sa tanang panahon. Sa piho, ang mga pag-amping kinahanglan nga himoon mahitungod sa mosunod nga mga punto:
1. Pagdumala sa mga reagent
2. Organisasyon sa workspace ug kagamitan
3. Tambag sa paggamit ug paglimpyo para sa gitudlo nga molekular nga wanang
4. Kinatibuk-ang tambag sa molekular nga biyolohiya
5. Mga internal nga kontrol
6. Bibliograpiya
1. Pagdumala sa mga reagent
I-centrifuge sa makadiyot ang mga tubo sa reagent sa dili pa ablihan aron malikayan ang pagmugna og mga aerosol. I-alhaquot ang mga reagent aron malikayan ang daghang freeze-thaws ug ang kontaminasyon sa mga master stock. Klaroha nga butangan og label ug petsa ang tanang tubo sa reagent ug reaction ug ipadayon ang mga log sa reagent lot ug batch numbers nga gigamit sa tanang eksperimento. I-pipette ang tanang reagent ug sample gamit ang filter tips. Sa dili pa mopalit, mas maayo nga kumpirmahon sa tiggama nga ang mga filter tips mohaom sa brand sa pipette nga gamiton.
2. Organisasyon sa workspace ug kagamitan
Kinahanglan nga organisado ang workspace aron masiguro nga ang dagan sa trabaho mahitabo sa usa ka direksyon, gikan sa limpyo nga mga lugar (pre-PCR) ngadto sa hugaw nga mga lugar (post-PCR). Ang mosunod nga kinatibuk-ang mga pag-amping makatabang sa pagpakunhod sa posibilidad sa kontaminasyon. Pagbaton og gilain nga gitudlo nga mga kwarto, o labing menos pisikal nga gilain nga mga lugar, alang sa: pag-andam sa mastermix, pagkuha sa nucleic acid ug pagdugang sa DNA template, pagpadako ug pagdumala sa gipadako nga produkto, ug pag-analisar sa produkto, pananglitan gel electrophoresis.
Sa pipila ka mga sitwasyon, lisod ang pagbaton og 4 ka managlahing kwarto. Usa ka posible apan dili kaayo maayong kapilian mao ang paghimo sa mastermix preparation sa usa ka containment area, pananglitan usa ka laminar flow cabinet. Sa kaso sa nested PCR amplification, ang pag-andam sa mastermix para sa ikaduhang hugna sa reaksyon kinahanglan nga andamon sa 'limpyo' nga lugar para sa mastermix preparation, apan ang inoculation gamit ang primary PCR product kinahanglan nga buhaton sa amplification room, ug kon mahimo sa usa ka dedicated containment area (pananglitan usa ka laminar flow cabinet).
Ang matag kwarto/lugar nagkinahanglan og lahi nga hugpong sa klarong gimarkahan nga mga pipette, filter tips, tube racks, vortexes, centrifuges (kon naa), mga bolpen, generic lab reagents, lab coats ug mga kahon sa gwantes nga magpabilin sa ilang tagsa-tagsa ka workstation. Kinahanglan hugasan ang mga kamot ug ilisan ang mga gwantes ug lab coat kon mobalhin-balhin tali sa gitudlo nga mga lugar. Ang mga reagent ug kagamitan dili angay ibalhin gikan sa hugaw nga lugar ngadto sa limpyo nga lugar. Kon adunay grabeng kaso nga motumaw diin ang usa ka reagent o kagamitan kinahanglan nga ibalhin paatras, kinahanglan una kini nga disimpektahan gamit ang 10% sodium hypochlorite, sundan sa pagpahid gamit ang sterile nga tubig.
Mubo nga sulat
Ang 10% sodium hypochlorite solution kinahanglan nga himoon nga presko kada adlaw. Kung gamiton para sa dekontaminasyon, kinahanglan nga sundon ang labing menos 10 ka minuto nga oras sa pagkontak.
Sa laing bahin, ang mga produktong mabaligya sa komersyo nga napamatud-an nga mga DNA-destroying surface decontaminants mahimong gamiton kon ang lokal nga mga rekomendasyon sa kaluwasan dili motugot sa paggamit sa sodium hypochlorite o kon ang sodium hypochlorite dili angay alang sa pag-decontaminate sa metallic nga mga bahin sa kagamitan.
Sa sulundon nga paagi, ang mga kawani kinahanglan nga mosunod sa unidirectional work flow ethos ug dili mobalik gikan sa hugaw nga mga lugar (post-PCR) balik sa limpyo nga mga lugar (pre-PCR) sa samang adlaw. Bisan pa, adunay mga higayon nga dili kini malikayan. Kung motumaw ang ingon nga okasyon, ang mga kawani kinahanglan nga mag-amping sa paghugas sa mga kamot pag-ayo, pag-ilis sa gwantes, paggamit sa gitudlo nga lab coat ug dili magdala pag-usab sa bisan unsang kagamitan nga gusto nilang dad-on sa gawas sa kwarto, sama sa mga libro sa laboratoryo. Ang ingon nga mga lakang sa pagkontrol kinahanglan nga ipasiugda sa pagbansay sa mga kawani sa mga pamaagi sa molekula.
Human magamit, ang mga lingkuranan kinahanglan limpyohan gamit ang 10% sodium hypochlorite (sundan sa sterile nga tubig aron makuha ang nahabilin nga bleach), 70% ethanol, o usa ka balido nga komersyal nga mapalit nga DNA-destroying decontaminant. Sa sulundon nga paagi, ang mga ultra-violet (UV) nga lampara kinahanglan ibutang aron mapadali ang pag-decontamination pinaagi sa irradiation. Bisan pa, ang paggamit sa mga UV lamp kinahanglan nga limitahan sa sirado nga mga lugar nga gitrabahuan, pananglitan mga safety cabinet, aron limitahan ang pagkaladlad sa UV sa mga kawani sa laboratoryo. Palihug sunda ang mga instruksyon sa tiggama alang sa pag-atiman sa UV lamp, bentilasyon ug pagpanglimpyo aron masiguro nga ang mga lampara magpabilin nga epektibo.
Kon mogamit og 70% ethanol imbes nga sodium hypochlorite, gikinahanglan ang pag-irradiate gamit ang UV light aron makompleto ang dekontaminasyon.
Ayaw limpyohi ang vortex ug centrifuge gamit ang sodium hypochlorite; hinoon, pahiran kini gamit ang 70% nga ethanol ug ibutyag sa UV light, o gamita ang komersyal nga DNA-destroying decontaminant. Alang sa mga natapon, susiha ang tiggama alang sa dugang nga tambag sa pagpanglimpyo. Kung gitugot sa mga instruksyon sa tiggama, ang mga pipette kinahanglan nga regular nga isterilisahon gamit ang autoclave. Kung ang mga pipette dili ma-autoclave, igo na ang paglimpyo niini gamit ang 10% nga sodium hypochlorite (sundan sa hingpit nga pagpahid gamit ang sterile nga tubig) o gamit ang komersyal nga DNA-destroying decontaminant nga gisundan sa UV exposure.
Ang pagpanglimpyo gamit ang taas nga porsyento sa sodium hypochlorite sa ngadto-ngadto mahimong makadaot sa mga plastik ug metal sa pipette kon buhaton kanunay; susiha una ang mga rekomendasyon gikan sa tiggama. Ang tanang kagamitan kinahanglan nga i-calibrate kanunay sumala sa iskedyul nga girekomenda sa tiggama. Usa ka gitudlo nga tawo ang kinahanglan nga maoy mangulo sa pagsiguro nga ang iskedyul sa kalibrasyon gisunod, ang detalyado nga mga talaan gimentinar, ug ang mga label sa serbisyo klaro nga gipakita sa kagamitan.
3. Tambag sa paggamit ug paglimpyo para sa gitudlo nga molekular nga wanang
Pre-PCR: Pag-aliquote sa reagent / pag-andam sa mastermix: Kini kinahanglan nga mao ang pinakalimpyo sa tanang espasyo nga gigamit alang sa pag-andam sa mga eksperimento sa molekula ug labing maayo nga kini usa ka gitudlo nga laminar flow cabinet nga adunay UV light. Ang mga sample, nakuha nga nucleic acid ug gipadako nga mga produkto sa PCR dili angay dumalahon niining dapita. Ang mga amplification reagent kinahanglan ibutang sa freezer (o refrigerator, sumala sa rekomendasyon sa tiggama) sa parehas nga gitudlo nga espasyo, labing maayo nga tupad sa laminar flow cabinet o pre-PCR area. Ang mga gwantes kinahanglan nga ilisan matag higayon nga mosulod sa pre-PCR area o laminar flow cabinet.
Ang pre-PCR area o laminar flow cabinet kinahanglan limpyohan sa dili pa ug human gamiton sama sa mosunod: Pahiran ang tanang butang sa cabinet, sama sa pipette, tip box, vortex, centrifuge, tube racks, pen, ug uban pa gamit ang 70% ethanol o usa ka komersyal nga DNA-destroying decontaminant, ug pasagdi nga mamala. Sa kaso sa sirado nga working area, sama sa laminar flow cabinet, ibutyag ang hood sa UV light sulod sa 30 minutos.
Mubo nga sulat
Ayaw ibutyag ang mga reagent sa UV light; ibalhin lang kini sa kabinet kung kini limpyo na. Kung maghimo og reverse transcription PCR, makatabang usab ang pagpahid sa mga nawong ug kagamitan gamit ang solusyon nga makaguba sa mga RNase sa pagkontak. Makatabang kini aron malikayan ang mga sayop nga negatibo nga resulta gikan sa pagkadaot sa enzyme sa RNA. Human sa dekontaminasyon ug sa dili pa andamon ang mastermix, kinahanglan nga ilisan pag-usab ang mga gwantes, ug dayon andam na gamiton ang kabinet.
Pre-PCR: Pagkuha sa nucleic acid/pagdugang sa template:
Kinahanglan nga kuhaon ug dumalahon ang nucleic acid sa ikaduhang gitudlo nga lugar, gamit ang lahi nga set sa mga pipette, filter tip, tube racks, bag-ong gwantes, lab coat ug uban pang kagamitan. Kini nga lugar alang usab sa pagdugang sa template, controls ug trendlines sa mga mastermix tubes o plates. Aron malikayan ang kontaminasyon sa nakuha nga mga sample sa nucleic acid nga gi-analisar, girekomenda nga ilisan ang gwantes sa dili pa dumalahon ang mga positibo nga kontrol o standard ug mogamit og lahi nga set sa mga pipette. Ang mga PCR reagents ug amplified products dili angay nga i-pipette niining lugara. Ang mga sample kinahanglan nga tipigan sa gitudlo nga mga refrigerator o freezer sa parehas nga lugar. Ang sample workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sama sa mastermix space.
Post-PCR: Pagpadako ug pagdumala sa gipadako nga produkto
Kining gitagana nga luna alang sa mga proseso sa post-amplification ug kinahanglan nga pisikal nga gilain gikan sa mga lugar nga pre-PCR. Kasagaran kini adunay mga thermocycler ug real-time platform, ug sa sulundon nga paagi kinahanglan adunay laminar flow cabinet para sa pagdugang sa round 1 PCR product sa round 2 reaction, kung gihimo ang nested PCR. Ang mga PCR reagents ug extracted nucleic acid dili angay dumalahon niining lugara tungod kay taas ang risgo sa kontaminasyon. Kini nga lugar kinahanglan adunay lahi nga set sa gwantes, lab coats, plate ug tube racks, pipette, filter tip, bins ug uban pang kagamitan. Ang mga tubo kinahanglan nga i-centrifuge sa dili pa ablihan. Ang sample workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sama sa mastermix space.
Post-PCR: Pag-analisar sa produkto
Kini nga kwarto para sa mga kagamitan sa pag-ila sa produkto, pananglitan mga tangke sa gel electrophoresis, mga power pack, UV transilluminator ug ang sistema sa dokumentasyon sa gel. Kini nga lugar kinahanglan adunay gilain nga mga set sa gwantes, lab coat, plate ug tube racks, pipette, filter tip, bin ug uban pang kagamitan. Walay ubang mga reagent nga mahimong dad-on niining lugar, gawas sa loading dye, molecular marker ug agarose gel, ug mga buffer component. Ang sample workspace kinahanglan nga limpyohan sa parehas nga paagi sama sa mastermix space.
Importante nga nota
Sa labing maayo, ang mga pre-PCR room dili angay sudlon sa samang adlaw kon ang trabaho nahimo na sa mga post-PCR room. Kon dili gyud kini malikayan, siguroha nga ang mga kamot hugasan una og maayo ug nga adunay espesipikong mga lab coat nga isul-ob sa mga kwarto. Ang mga libro sa laboratoryo ug mga papeles dili angay dad-on sa mga pre-PCR room kon kini gigamit na sa mga post-PCR room; kon gikinahanglan, pagkuha og mga duplicate nga print-out sa mga protocol/sample ID, ug uban pa.
4. Kinatibuk-ang tambag sa molekular nga biyolohiya
Gamita ang gwantes nga walay pulbos aron malikayan ang pagpugong sa pag-assay. Ang hustong teknik sa pag-pipet hinungdanon kaayo sa pagpakunhod sa kontaminasyon. Ang sayop nga pag-pipet mahimong moresulta sa pagsabwag sa tubig sa pag-dispensa sa mga likido ug paghimo og mga aerosol. Ang maayong praktis alang sa hustong pag-pipet makita sa mosunod nga mga link: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes sa dili pa ablihan, ug ablihi kini pag-ayo aron malikayan ang pagsabwag. Sirad-i dayon ang mga tubo human gamiton aron malikayan ang pagsulod sa mga kontaminante.
Kon mohimo og daghang reaksyon, pag-andam og usa ka mastermix nga adunay komon nga mga reagent (pananglitan tubig, dNTPs, buffer, primers ug enzyme) aron maminusan ang gidaghanon sa pagbalhin sa reagent ug makunhuran ang hulga sa kontaminasyon. Girekomenda nga ibutang ang mastermix sa yelo o usa ka cold block. Ang paggamit og Hot Start enzyme makatabang sa pagpakunhod sa produksiyon sa mga dili espesipikong produkto. Panalipdi ang mga reagent nga adunay fluorescent probes gikan sa kahayag aron malikayan ang pagkadaot.
5. Mga internal nga kontrol
Ilakip ang maayo nga pagka-ila ug nakumpirma nga positibo ug negatibo nga mga kontrol, uban sa usa ka walay-template nga kontrol sa tanang reaksyon, ug usa ka multi-point titrated trendline para sa quantitative nga mga reaksyon. Ang positibo nga kontrol dili angay nga kusog kaayo nga makahatag og risgo sa kontaminasyon. Ilakip ang positibo ug negatibo nga mga kontrol sa pagkuha kon maghimo og nucleic acid extraction.
Girekomenda nga magbutang og klaro nga mga instruksyon sa matag lugar aron ang mga tiggamit mahibalo sa mga lagda sa pamatasan. Ang mga diagnostic lab nga nakamatikod sa ubos kaayo nga lebel sa DNA o RNA sa mga klinikal nga sample mahimong mosagop sa dugang nga lakang sa seguridad sa pagbaton og gilain nga mga sistema sa pagdumala sa hangin nga adunay gamay nga positibo nga presyur sa hangin sa mga kwarto sa pre-PCR ug gamay nga negatibo nga presyur sa hangin sa mga kwarto sa post-PCR.
Sa katapusan, makatabang ang paghimo og plano sa quality assurance (QA). Ang maong plano kinahanglan maglakip sa mga lista sa mga reagent master stock ug working stock, mga lagda sa pagtipig sa mga kit ug reagent, pagreport sa mga resulta sa pagkontrol, mga programa sa pagbansay sa kawani, mga algorithm sa pag-troubleshoot, ug mga aksyon sa pag-ayo kung gikinahanglan.
6. Bibliograpiya
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitulo 3: Pagtukod og qPCR laboratory. Usa ka giya nga dokumento alang sa pagsulay sa mga katubigan sa kalingawan gamit ang USEPA qPCR nga pamaagi 1611. Lansing- Michigan State University.
Public Health England, NHS. Mga sumbanan sa UK para sa mga imbestigasyon sa microbiology: Maayong Pamaagi sa Laboratoryo kon magpahigayon og mga molecular amplification assay). Giya sa Kalidad. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Pagtukod og laboratoryo sa PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinang pagmentinar sa mga centrifuge: paglimpyo, pagmentinar ug pagdis-impekta sa mga centrifuge, rotor ug adapter (White paper No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Maayong Klinikal nga Praktis sa Laboratoryo (GCLP) para sa mga pagsulay nga gibase sa molekula nga gigamit sa mga laboratoryo sa pagdayagnos, Sa: Akyar I, editor. Wide spectra sa pagkontrol sa kalidad. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Oras sa pag-post: Hulyo 16, 2020
