Kaedah pengesanan molekul mempunyai keupayaan untuk menghasilkan sejumlah besar asid nukleik melalui penguatan kuantiti surih yang terdapat dalam sampel. Walaupun ini bermanfaat untuk membolehkan pengesanan sensitif, ia juga memperkenalkan kemungkinan pencemaran melalui penyebaran aerosol penguatan dalam persekitaran makmal. Semasa menjalankan eksperimen, langkah-langkah boleh diambil untuk mengelakkan pencemaran reagen, peralatan makmal dan ruang bangku, kerana pencemaran sedemikian boleh menghasilkan keputusan positif palsu (atau negatif palsu).
Untuk membantu mengurangkan kemungkinan pencemaran, Amalan Makmal Baik harus diamalkan sepanjang masa. Secara khususnya, langkah berjaga-jaga harus diambil mengenai perkara-perkara berikut:
1. Mengendalikan reagen
2. Pengaturan ruang kerja dan peralatan
3. Nasihat penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditetapkan
4. Nasihat biologi molekul am
5. Kawalan dalaman
6. Bibliografi
1. Mengendalikan reagen
Emparkan tiub reagen secara ringkas sebelum dibuka untuk mengelakkan penghasilan aerosol. Alikuot reagen untuk mengelakkan pencairan beku berganda dan pencemaran stok induk. Labelkan dan tarikhkan semua tiub reagen dan tindak balas dengan jelas dan simpan log nombor lot dan kelompok reagen yang digunakan dalam semua eksperimen. Pipet semua reagen dan sampel menggunakan hujung penapis. Sebelum membeli, adalah dinasihatkan untuk mengesahkan dengan pengilang bahawa hujung penapis sesuai dengan jenama pipet yang akan digunakan.
2. Pengaturan ruang kerja dan peralatan
Ruang kerja perlu disusun atur bagi memastikan aliran kerja berlaku dalam satu arah, dari kawasan bersih (pra-PCR) ke kawasan kotor (pasca-PCR). Langkah berjaga-jaga umum berikut akan membantu mengurangkan kemungkinan pencemaran. Sediakan bilik yang berasingan, atau sekurang-kurangnya kawasan yang berasingan secara fizikal, untuk: penyediaan campuran induk, pengekstrakan asid nukleik dan penambahan templat DNA, amplifikasi dan pengendalian produk yang dikuatkan, dan analisis produk, contohnya elektroforesis gel.
Dalam sesetengah keadaan, mempunyai 4 bilik berasingan adalah sukar. Pilihan yang mungkin tetapi kurang diingini adalah melakukan penyediaan mastermix di kawasan pembendungan, contohnya kabinet aliran laminar. Dalam kes amplifikasi PCR bersarang, penyediaan mastermix untuk tindak balas pusingan kedua harus disediakan di kawasan 'bersih' untuk penyediaan mastermix, tetapi inokulasi dengan produk PCR primer harus dilakukan di bilik amplifikasi, dan jika boleh di kawasan pembendungan khusus (contohnya kabinet aliran laminar).
Setiap bilik/kawasan memerlukan set pipet, hujung penapis, rak tiub, vorteks, emparan (jika berkaitan), pen, reagen makmal generik, kot makmal dan kotak sarung tangan yang berasingan yang akan ditinggalkan di stesen kerja masing-masing. Tangan mesti dibasuh dan sarung tangan serta kot makmal ditukar semasa bergerak di antara kawasan yang ditetapkan. Reagen dan peralatan tidak boleh dipindahkan dari kawasan kotor ke kawasan yang bersih. Sekiranya berlaku kes ekstrem di mana reagen atau peralatan perlu digerakkan ke belakang, ia mesti dinyahcemar terlebih dahulu dengan 10% natrium hipoklorit, diikuti dengan lap dengan air steril.
Nota
Larutan natrium hipoklorit 10% mesti disediakan segar setiap hari. Apabila digunakan untuk penyahkontaminasi, masa sentuhan minimum selama 10 minit harus dipatuhi.
Secara alternatif, produk yang tersedia secara komersial yang disahkan sebagai penyahcemar permukaan pemusnah DNA boleh digunakan jika cadangan keselamatan tempatan tidak membenarkan penggunaan natrium hipoklorit atau jika natrium hipoklorit tidak sesuai untuk menyahcemar bahagian logam peralatan.
Sebaik-baiknya, kakitangan harus mematuhi etos aliran kerja sehala dan tidak kembali dari kawasan kotor (pasca-PCR) ke kawasan bersih (pra-PCR) pada hari yang sama. Walau bagaimanapun, mungkin terdapat keadaan di mana perkara ini tidak dapat dielakkan. Apabila keadaan sedemikian timbul, kakitangan mesti berhati-hati untuk mencuci tangan dengan teliti, menukar sarung tangan, menggunakan kot makmal yang ditetapkan dan tidak memperkenalkan sebarang peralatan yang mereka ingin bawa keluar dari bilik lagi, seperti buku makmal. Langkah kawalan sedemikian harus ditekankan dalam latihan kakitangan tentang kaedah molekul.
Selepas digunakan, ruang bangku hendaklah dibersihkan dengan 10% natrium hipoklorit (diikuti dengan air steril untuk membuang sisa peluntur), 70% etanol, atau dekontaminasi pemusnah DNA yang telah disahkan dan tersedia secara komersial. Sebaik-baiknya, lampu ultraungu (UV) hendaklah dipasang untuk membolehkan penyahcemaran melalui penyinaran. Walau bagaimanapun, penggunaan lampu UV hendaklah dihadkan kepada kawasan kerja tertutup, contohnya kabinet keselamatan, untuk mengehadkan pendedahan UV kakitangan makmal. Sila patuhi arahan pengilang untuk penjagaan, pengudaraan dan pembersihan lampu UV bagi memastikan lampu kekal berkesan.
Jika menggunakan 70% etanol dan bukannya natrium hipoklorit, penyinaran dengan cahaya UV diperlukan untuk melengkapkan penyahkontaminasi.
Jangan bersihkan vorteks dan emparan dengan natrium hipoklorit; sebaliknya, lap dengan 70% etanol dan dedahkan kepada cahaya UV, atau gunakan dekontaminasi pemusnah DNA komersial. Untuk tumpahan, semak dengan pengilang untuk nasihat pembersihan lanjut. Jika arahan pengilang membenarkannya, pipet hendaklah disterilkan secara rutin menggunakan autoklaf. Jika pipet tidak boleh diautoklaf, ia memadai untuk membersihkannya dengan 10% natrium hipoklorit (diikuti dengan lap menyeluruh dengan air steril) atau dengan dekontaminasi pemusnah DNA komersial diikuti dengan pendedahan UV.
Pembersihan dengan natrium hipoklorit peratusan tinggi akhirnya boleh merosakkan plastik dan logam pipet jika dilakukan secara berkala; semak cadangan daripada pengilang terlebih dahulu. Semua peralatan perlu dikalibrasi secara berkala mengikut jadual yang disyorkan oleh pengilang. Orang yang ditetapkan harus bertanggungjawab untuk memastikan jadual kalibrasi dipatuhi, log terperinci diselenggara, dan label servis dipaparkan dengan jelas pada peralatan.
3. Nasihat penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditetapkan
Pra-PCR: Penyediaan pengaliquotan reagen / mastermix: Ruang ini haruslah yang paling bersih daripada semua ruang yang digunakan untuk penyediaan eksperimen molekul dan idealnya adalah kabinet aliran laminar yang ditetapkan yang dilengkapi dengan cahaya UV. Sampel, asid nukleik yang diekstrak dan produk PCR yang diperkuat tidak boleh dikendalikan di kawasan ini. Reagen amplifikasi harus disimpan di dalam peti sejuk beku (atau peti sejuk, seperti yang disyorkan oleh pengilang) di ruang yang sama yang ditetapkan, idealnya di sebelah kabinet aliran laminar atau kawasan pra-PCR. Sarung tangan harus ditukar setiap kali memasuki kawasan pra-PCR atau kabinet aliran laminar.
Kawasan pra-PCR atau kabinet aliran laminar hendaklah dibersihkan sebelum dan selepas digunakan seperti berikut: Lap semua barang di dalam kabinet, contohnya pipet, kotak hujung, vorteks, emparan, rak tiub, pen, dsb. dengan etanol 70% atau dekontaminasi pemusnah DNA komersial, dan biarkan kering. Sekiranya kawasan kerja tertutup, contohnya kabinet aliran laminar, dedahkan hud kepada cahaya UV selama 30 minit.
Nota
Jangan dedahkan reagen kepada cahaya UV; hanya pindahkannya ke dalam kabinet setelah ia bersih. Jika melakukan PCR transkripsi terbalik, adalah lebih baik untuk mengelap permukaan dan peralatan dengan larutan yang menguraikan RNase semasa bersentuhan. Ini boleh membantu mengelakkan keputusan negatif palsu daripada degradasi enzim RNA. Selepas penyahkontaminasi dan sebelum menyediakan mastermix, sarung tangan hendaklah ditukar sekali lagi, dan kemudian kabinet sedia untuk digunakan.
Pra-PCR: Pengekstrakan asid nukleik/penambahan templat:
Asid nukleik mesti diekstrak dan dikendalikan di kawasan kedua yang ditetapkan, menggunakan set pipet, hujung penapis, rak tiub, sarung tangan baharu, kot makmal dan peralatan lain yang berasingan. Kawasan ini juga untuk penambahan templat, kawalan dan garis trend pada tiub atau plat mastermix. Untuk mengelakkan pencemaran sampel asid nukleik yang diekstrak yang sedang dianalisis, adalah disyorkan untuk menukar sarung tangan sebelum mengendalikan kawalan positif atau piawaian dan menggunakan set pipet yang berasingan. Reagen PCR dan produk yang diperkuat tidak boleh dipipet di kawasan ini. Sampel hendaklah disimpan di dalam peti sejuk atau peti sejuk beku yang ditetapkan di kawasan yang sama. Ruang kerja sampel hendaklah dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Amplifikasi dan pengendalian produk yang dikuatkan
Ruang yang ditetapkan ini adalah untuk proses pasca-amplifikasi dan harus terpisah secara fizikal dari kawasan pra-PCR. Ia biasanya mengandungi termokitar dan platform masa nyata, dan idealnya harus mempunyai kabinet aliran laminar untuk menambahkan produk PCR pusingan 1 ke reaksi pusingan 2, jika PCR bersarang sedang dilakukan. Reagen PCR dan asid nukleik yang diekstrak tidak boleh dikendalikan di kawasan ini kerana risiko pencemaran adalah tinggi. Kawasan ini harus mempunyai set sarung tangan, kot makmal, rak plat dan tiub, pipet, hujung penapis, tong sampah dan peralatan lain yang berasingan. Tiub mesti disentrifugasi sebelum dibuka. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Analisis produk
Bilik ini adalah untuk peralatan pengesanan produk, contohnya tangki elektroforesis gel, pek kuasa, transiluminator UV dan sistem dokumentasi gel. Kawasan ini hendaklah mempunyai set sarung tangan, kot makmal, rak plat dan tiub, pipet, hujung penapis, tong dan peralatan lain yang berasingan. Tiada reagen lain boleh dibawa masuk ke kawasan ini, kecuali pewarna pemuatan, penanda molekul dan gel agarose, serta komponen penimbal. Ruang kerja sampel hendaklah dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Nota penting
Sebaik-baiknya, bilik pra-PCR tidak boleh dimasuki pada hari yang sama jika kerja telah dilakukan di bilik pasca-PCR. Jika ini tidak dapat dielakkan sama sekali, pastikan tangan dibasuh dengan teliti terlebih dahulu dan kot makmal khusus dipakai di dalam bilik. Buku makmal dan kertas kerja tidak boleh dibawa masuk ke bilik pra-PCR jika ia telah digunakan di bilik pasca-PCR; jika perlu, ambil cetakan pendua protokol/ID sampel, dsb.
4. Nasihat biologi molekul am
Gunakan sarung tangan bebas serbuk untuk mengelakkan perencatan ujian. Teknik pipet yang betul adalah penting untuk mengurangkan pencemaran. Pipet yang salah boleh mengakibatkan percikan semasa mengeluarkan cecair dan penghasilan aerosol. Amalan yang baik untuk pipet yang betul boleh didapati di pautan berikut: Panduan Gilson untuk pipet, video teknik pipet Anachem, Tiub emparan sebelum dibuka, dan buka dengan berhati-hati untuk mengelakkan percikan. Tutup tiub dengan segera selepas digunakan untuk mengelakkan kemasukan bahan cemar.
Apabila melakukan pelbagai tindak balas, sediakan satu campuran induk yang mengandungi reagen biasa (contohnya air, dNTP, penimbal, primer dan enzim) untuk meminimumkan bilangan pemindahan reagen dan mengurangkan ancaman pencemaran. Adalah disyorkan untuk menyediakan campuran induk di atas ais atau blok sejuk. Penggunaan enzim Permulaan Panas boleh membantu mengurangkan penghasilan produk yang tidak spesifik. Lindungi reagen yang mengandungi prob pendarfluor daripada cahaya untuk mengelakkan degradasi.
5. Kawalan dalaman
Sertakan kawalan positif dan negatif yang dicirikan dengan baik dan disahkan, berserta kawalan tanpa templat dalam semua tindak balas, dan garis arah aliran titrasi berbilang titik untuk tindak balas kuantitatif. Kawalan positif tidak boleh terlalu kuat sehingga menimbulkan risiko pencemaran. Sertakan kawalan pengekstrakan positif dan negatif semasa melakukan pengekstrakan asid nukleik.
Adalah disyorkan agar arahan yang jelas dipaparkan di setiap kawasan supaya pengguna mengetahui peraturan tatatertib. Makmal diagnostik yang mengesan tahap DNA atau RNA yang sangat rendah dalam sampel klinikal mungkin ingin menggunakan langkah keselamatan tambahan dengan mempunyai sistem pengendalian udara berasingan dengan tekanan udara yang sedikit positif di bilik pra-PCR dan tekanan udara yang sedikit negatif di bilik pasca-PCR.
Akhir sekali, membangunkan pelan jaminan kualiti (QA) adalah berguna. Pelan sedemikian harus merangkumi senarai stok induk reagen dan stok kerja, peraturan untuk menyimpan kit dan reagen, pelaporan keputusan kawalan, program latihan kakitangan, algoritma penyelesaian masalah dan tindakan pemulihan apabila diperlukan.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Menyediakan makmal qPCR. Dokumen panduan untuk menguji perairan rekreasi menggunakan kaedah qPCR USEPA 1611. Lansing- Universiti Negeri Michigan.
Kesihatan Awam England, NHS. Piawaian UK untuk penyiasatan mikrobiologi: Amalan Makmal Baik semasa menjalankan ujian amplifikasi molekul). Panduan Kualiti. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Menubuhkan makmal PCR. Protokol Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Penyelenggaraan rutin emparan: pembersihan, penyelenggaraan dan pembasmian kuman emparan, rotor dan penyesuai (Kertas putih No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Amalan Makmal Klinikal yang Baik (GCLP) untuk ujian berasaskan molekul yang digunakan dalam makmal diagnostik, Dalam: Akyar I, editor. Spektrum kawalan kualiti yang luas. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Masa siaran: 16 Julai 2020
