Molekulyar aniqlash usullari namunalarda topilgan iz miqdorini kuchaytirish orqali katta hajmdagi nuklein kislotasini ishlab chiqarish qobiliyatiga ega. Bu sezgir aniqlashni ta'minlash uchun foydali bo'lsa-da, laboratoriya muhitida kuchaytirish aerozollarining tarqalishi orqali ifloslanish ehtimolini ham keltirib chiqaradi. Tajribalar o'tkazishda reaktivlar, laboratoriya uskunalari va skameykalarning ifloslanishining oldini olish choralarini ko'rish mumkin, chunki bunday ifloslanish noto'g'ri ijobiy (yoki noto'g'ri salbiy) natijalarga olib kelishi mumkin.
Kontaminatsiya ehtimolini kamaytirishga yordam berish uchun har doim yaxshi laboratoriya amaliyotidan foydalanish kerak. Xususan, quyidagi jihatlarga oid ehtiyot choralarini ko'rish kerak:
1. Reaktivlar bilan ishlash
2. Ish joyi va jihozlarini tashkil qilish
3. Belgilangan molekulyar makon uchun foydalanish va tozalash bo'yicha tavsiyalar
4. Umumiy molekulyar biologiya bo'yicha maslahatlar
5. Ichki nazorat
6. Bibliografiya
1. Reaktivlar bilan ishlash
Aerozollarning paydo bo'lishining oldini olish uchun reagent naychalarini ochishdan oldin qisqa vaqt ichida santrifuga qiling. Bir necha marta muzlatish-eritish va asosiy zaxiralarning ifloslanishining oldini olish uchun reagentlar sonini aniqlang. Barcha reagent va reaksiya naychalarini aniq belgilang va sanasini yozing hamda barcha tajribalarda ishlatilgan reagent partiyasi va partiya raqamlarini jurnallarda saqlang. Barcha reagentlar va namunalarni filtr uchlari yordamida pipetka bilan tozalang. Sotib olishdan oldin, ishlab chiqaruvchi bilan filtr uchlari ishlatiladigan pipetka markasiga mos kelishini tasdiqlash tavsiya etiladi.
2. Ish joyi va jihozlarini tashkil qilish
Ish maydoni ish oqimi bir yo'nalishda, toza joylardan (PCR dan oldin) iflos joylarga (PCR dan keyin) o'tishi uchun tashkil etilishi kerak. Quyidagi umumiy ehtiyot choralari ifloslanish ehtimolini kamaytirishga yordam beradi. Alohida ajratilgan xonalarga yoki hech bo'lmaganda jismonan alohida joylarga ega bo'ling: mastermiks tayyorlash, nuklein kislotasini ekstraktsiya qilish va DNK shablonini qo'shish, kuchaytirilgan mahsulotni kuchaytirish va qayta ishlash hamda mahsulotni tahlil qilish, masalan, gel elektroforez.
Ba'zi sharoitlarda 4 ta alohida xonaga ega bo'lish qiyin. Mumkin bo'lgan, ammo unchalik istalmagan variant - mastermix tayyorlashni saqlash zonasida, masalan, laminar oqim shkafida bajarish. Ichki PZR kuchaytirish holatida, ikkinchi bosqich reaksiyasi uchun mastermixni tayyorlash mastermix tayyorlash uchun "toza" joyda tayyorlanishi kerak, ammo asosiy PZR mahsuloti bilan emlash kuchaytirish xonasida va iloji bo'lsa, maxsus saqlash zonasida (masalan, laminar oqim shkafi) amalga oshirilishi kerak.
Har bir xona/hudud uchun alohida aniq yorliqlangan pipetkalar, filtr uchlari, naycha tokchalari, vortekslar, santrifugalar (agar kerak bo'lsa), ruchkalar, umumiy laboratoriya reaktivlari, laboratoriya xalatlari va qo'lqop qutilari kerak bo'ladi, ular tegishli ish joylarida qoladi. Belgilangan joylar orasida harakatlanayotganda qo'llar yuvilishi va qo'lqoplar va laboratoriya xalatlari almashtirilishi kerak. Reaktivlar va jihozlar iflos joydan toza joyga ko'chirilmasligi kerak. Agar reagent yoki uskunani orqaga ko'chirish zarur bo'lgan o'ta og'ir holat yuzaga kelsa, u avval 10% natriy gipoxlorit bilan zararsizlantirilishi, so'ngra steril suv bilan artib tashlanishi kerak.
Eslatma
10% li natriy gipoxlorit eritmasi har kuni yangi tayyorlanishi kerak. Dekontaminatsiya uchun ishlatilganda, kamida 10 daqiqa aloqa qilish vaqtiga rioya qilish kerak.
Shu bilan bir qatorda, agar mahalliy xavfsizlik tavsiyalari natriy gipoxloritdan foydalanishga yo'l qo'ymasa yoki natriy gipoxlorit uskunaning metall qismlarini zararsizlantirish uchun mos kelmasa, DNKni yo'q qiluvchi sirt dekontaminantlari sifatida tasdiqlangan tijoratda mavjud bo'lgan mahsulotlardan foydalanish mumkin.
Ideal holda, xodimlar bir tomonlama ish oqimi qoidalariga rioya qilishlari va o'sha kuni iflos joylardan (PCRdan keyin) toza joylarga (PCRdan oldin) qaytmasliklari kerak. Biroq, buning iloji bo'lmagan holatlar ham bo'lishi mumkin. Bunday holatlarda xodimlar qo'llarini yaxshilab yuvishlari, qo'lqoplarini almashtirishlari, maxsus laboratoriya xalatidan foydalanishlari va laboratoriya daftarlari kabi xonadan olib chiqmoqchi bo'lgan boshqa jihozlarni olib chiqmasliklari kerak. Bunday nazorat choralariga xodimlarni molekulyar usullar bo'yicha o'qitishda alohida e'tibor qaratish kerak.
Ishlatilgandan so'ng, skameykalar uchun joylar 10% natriy gipoxlorit (qoldiq oqartirgichni olib tashlash uchun steril suv), 70% etanol yoki tijoratda mavjud bo'lgan DNKni yo'q qiluvchi dekontaminant bilan tozalanishi kerak. Ideal holda, nurlanish orqali dekontaminatsiyani ta'minlash uchun ultrabinafsha (UB) lampalar o'rnatilishi kerak. Biroq, laboratoriya xodimlarining UB nurlariga ta'sirini cheklash uchun UB lampalaridan foydalanish yopiq ish joylarida, masalan, xavfsizlik shkaflarida cheklangan bo'lishi kerak. Lampalar samarali bo'lib qolishiga ishonch hosil qilish uchun UB lampalariga g'amxo'rlik qilish, shamollatish va tozalash bo'yicha ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga amal qiling.
Agar natriy gipoxlorit o'rniga 70% etanol ishlatilsa, dekontaminatsiyani yakunlash uchun ultrabinafsha nurlari bilan nurlantirish kerak bo'ladi.
Vorteks va santrifugani natriy gipoxlorit bilan tozalamang; buning o'rniga 70% etanol bilan artib, ultrabinafsha nurlariga qo'ying yoki tijorat maqsadlarida DNKni yo'q qiluvchi dekontaminantdan foydalaning. To'kilgan narsalar uchun qo'shimcha tozalash bo'yicha maslahat olish uchun ishlab chiqaruvchiga murojaat qiling. Agar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalari ruxsat bersa, pipetkalar muntazam ravishda avtoklav bilan sterilizatsiya qilinishi kerak. Agar pipetkalarni avtoklav bilan tozalashning iloji bo'lmasa, ularni 10% natriy gipoxlorit bilan tozalash (keyin steril suv bilan yaxshilab artib olish) yoki tijorat maqsadlarida DNKni yo'q qiluvchi dekontaminant bilan, keyin esa ultrabinafsha nurlariga ta'sir qilish kifoya.
Yuqori foizli natriy gipoxlorit bilan tozalash muntazam ravishda amalga oshirilsa, oxir-oqibat pipetka plastmassalari va metallariga zarar yetkazishi mumkin; avval ishlab chiqaruvchining tavsiyalarini tekshiring. Barcha jihozlar ishlab chiqaruvchi tomonidan tavsiya etilgan jadvalga muvofiq muntazam ravishda kalibrlanishi kerak. Kalibrlash jadvaliga rioya qilinishini, batafsil jurnallar yuritilishini va jihozlarda xizmat ko'rsatish yorliqlari aniq ko'rsatilishini ta'minlash uchun mas'ul shaxs javobgar bo'lishi kerak.
3. Belgilangan molekulyar makon uchun foydalanish va tozalash bo'yicha tavsiyalar
PZRdan oldingi: Reagentlarni alikotlash / mastermiks tayyorlash: Bu molekulyar tajribalarni tayyorlash uchun ishlatiladigan barcha joylar ichida eng tozasi bo'lishi va ideal holda ultrabinafsha nuri bilan jihozlangan maxsus laminar oqim shkafi bo'lishi kerak. Namunalar, ekstraksiya qilingan nuklein kislota va kuchaytirilgan PZR mahsulotlari bu hududda ishlatilmasligi kerak. Kuchaytirish reagentlari muzlatgichda (yoki ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga muvofiq muzlatgichda) xuddi shu maxsus joyda, ideal holda laminar oqim shkafi yoki PZRdan oldingi maydon yonida saqlanishi kerak. PZRdan oldingi maydonga yoki laminar oqim shkafiga kirishda har safar qo'lqoplarni almashtirish kerak.
PZRgacha bo'lgan maydon yoki laminar oqim shkafi foydalanishdan oldin va keyin quyidagicha tozalanishi kerak: Shkafdagi barcha narsalarni, masalan, pipetkalar, uchlik qutilari, vorteks, santrifuga, naycha tokchalari, ruchkalar va boshqalarni 70% etanol yoki tijorat DNKni yo'q qiluvchi dekontaminant bilan artib oling va quriting. Yopiq ish maydoni, masalan, laminar oqim shkafi holatida, kapotni 30 daqiqa davomida UB nurlariga qo'ying.
Eslatma
Reagentlarni ultrabinafsha nurlariga duchor qilmang; ularni faqat tozalangandan keyingina shkafga joylashtiring. Agar teskari transkripsiya PZR amalga oshirilsa, yuzalar va uskunalarni kontaktda RNazalarni parchalaydigan eritma bilan artib olish ham foydali bo'lishi mumkin. Bu RNKning fermentlar parchalanishidan kelib chiqadigan noto'g'ri salbiy natijalarning oldini olishga yordam beradi. Dekontaminatsiyadan so'ng va mastermiksni tayyorlashdan oldin qo'lqoplarni yana bir bor almashtirish kerak, shundan so'ng shkaf foydalanishga tayyor bo'ladi.
Pre-PCR: Nuklein kislotasini ekstraktsiya qilish/shablon qo'shish:
Nuklein kislotasi alohida pipetkalar, filtr uchlari, naycha tokchalari, yangi qo'lqoplar, laboratoriya xalatlari va boshqa jihozlar yordamida ikkinchi belgilangan joyda ekstraksiya qilinishi va ishlov berilishi kerak. Bu maydon shuningdek, mastermix naychalari yoki plastinkalariga shablon, boshqaruv elementlari va trend chiziqlarini qo'shish uchun ham mo'ljallangan. Tahlil qilinayotgan ekstraksiya qilingan nuklein kislotasi namunalarining ifloslanishini oldini olish uchun musbat nazorat yoki standartlar bilan ishlashdan oldin qo'lqoplarni almashtirish va alohida pipetkalar to'plamidan foydalanish tavsiya etiladi. PCR reagentlari va kuchaytirilgan mahsulotlar bu hududda pipetka bilan ishlatilmasligi kerak. Namunalar bir xil hududdagi maxsus muzlatgichlarda yoki muzlatgichlarda saqlanishi kerak. Namuna ish maydoni mastermix maydoni bilan bir xil tarzda tozalanishi kerak.
PCRdan keyingi: Kuchaytirilgan mahsulotni kuchaytirish va qayta ishlash
Bu ajratilgan joy amplifikatsiyadan keyingi jarayonlar uchun mo'ljallangan va PCRdan oldingi zonalardan jismonan alohida bo'lishi kerak. Odatda u termosiklatorlar va real vaqt platformalarini o'z ichiga oladi va ideal holda, agar ichki PCR bajarilsa, 1-raundli PCR mahsulotini 2-raundli reaksiyaga qo'shish uchun laminar oqim shkafiga ega bo'lishi kerak. PCR reagentlari va ekstraksiya qilingan nuklein kislotasi bu zonada ishlatilmasligi kerak, chunki ifloslanish xavfi yuqori. Bu zonada alohida qo'lqoplar, laboratoriya xalatlar, plastinka va naychalar uchun tokchalar, pipetkalar, filtr uchlari, idishlar va boshqa uskunalar bo'lishi kerak. Naychalar ochilishdan oldin santrifuga qilinishi kerak. Namuna ish maydoni mastermix maydoni kabi tozalanishi kerak.
PCR dan keyingi: Mahsulot tahlili
Bu xona mahsulotni aniqlash uskunalari, masalan, gel elektroforez baklari, quvvat bloklari, UV transilyuminatori va gel hujjatlashtirish tizimi uchun mo'ljallangan. Bu hududda alohida qo'lqoplar, laboratoriya xalatlar, plastinka va naycha tokchalari, pipetkalar, filtr uchlari, idishlar va boshqa uskunalar bo'lishi kerak. Bu hududga yuklash bo'yog'i, molekulyar marker va agaroza geli va bufer komponentlaridan tashqari boshqa hech qanday reaktivlarni olib kirish mumkin emas. Namuna ish maydoni mastermix maydoni kabi tozalanishi kerak.
Muhim eslatma
Ideal holda, agar PCRdan keyingi xonalarda ish allaqachon bajarilgan bo'lsa, PCRdan oldingi xonalarga o'sha kuni kirmaslik kerak. Agar buning iloji bo'lmasa, avval qo'llarni yaxshilab yuvib tashlang va xonalarga maxsus laboratoriya xalatlari kiying. Agar laboratoriya daftarlari va hujjatlar PCRdan keyingi xonalarda ishlatilgan bo'lsa, ularni PCRdan oldingi xonalarga olib kirmaslik kerak; agar kerak bo'lsa, protokollar/namunaviy guvohnomalar va boshqalarning nusxalarini oling.
4. Umumiy molekulyar biologiya bo'yicha maslahatlar
Sinov jarayonining oldini olish uchun kukunsiz qo'lqoplardan foydalaning. To'g'ri pipetka usuli ifloslanishni kamaytirish uchun juda muhimdir. Noto'g'ri pipetka suyuqliklarni tarqatishda sachrashga va aerozollarning paydo bo'lishiga olib kelishi mumkin. To'g'ri pipetka usulining yaxshi amaliyotini quyidagi havolalarda topish mumkin: Gilson pipetka qo'llanmasi, Anachem pipetka usuli videolari, Naychalarni ochishdan oldin santrifuga qiling va sachrashining oldini olish uchun ehtiyotkorlik bilan oching. Ifloslantiruvchi moddalarning kirib kelishini oldini olish uchun naychalarni ishlatgandan so'ng darhol yoping.
Bir nechta reaksiyalarni amalga oshirayotganda, reagent o'tkazmalari sonini minimallashtirish va ifloslanish xavfini kamaytirish uchun umumiy reagentlar (masalan, suv, dNTPlar, bufer, primerlar va ferment) ni o'z ichiga olgan bitta mastermiks tayyorlang. Mastermiksni muz yoki sovuq blokda o'rnatish tavsiya etiladi. Issiq start fermentidan foydalanish o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlar ishlab chiqarishni kamaytirishga yordam beradi. Parchalanishning oldini olish uchun lyuminestsent zondlarni o'z ichiga olgan reagentlarni yorug'likdan saqlang.
5. Ichki nazorat
Yaxshi tavsiflangan, tasdiqlangan musbat va manfiy nazoratlarni, shuningdek, barcha reaksiyalarda shablonsiz nazoratni va miqdoriy reaksiyalar uchun ko'p nuqtali titrlangan trend chizig'ini kiriting. Ijobiy nazorat ifloslanish xavfini tug'diradigan darajada kuchli bo'lmasligi kerak. Nuklein kislotasini ekstraksiya qilishda musbat va manfiy ekstraksiya nazoratlarini kiriting.
Foydalanuvchilar xulq-atvor qoidalaridan xabardor bo'lishlari uchun har bir sohaga aniq ko'rsatmalar osib qo'yish tavsiya etiladi. Klinik namunalarda juda past darajadagi DNK yoki RNKni aniqlaydigan diagnostika laboratoriyalari PCRdan oldingi xonalarda biroz musbat havo bosimi va PCRdan keyingi xonalarda biroz manfiy havo bosimi bo'lgan alohida havo bilan ishlash tizimlariga ega bo'lish kabi qo'shimcha xavfsizlik choralarini ko'rishni xohlashlari mumkin.
Nihoyat, sifatni ta'minlash (QA) rejasini ishlab chiqish foydalidir. Bunday reja reagentlarning asosiy va ishchi zaxiralari ro'yxatini, to'plamlar va reagentlarni saqlash qoidalarini, nazorat natijalari to'g'risida hisobot berishni, xodimlarni o'qitish dasturlarini, muammolarni bartaraf etish algoritmlarini va kerak bo'lganda tuzatish choralarini o'z ichiga olishi kerak.
6. Bibliografiya
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3-bob: QPCR laboratoriyasini tashkil etish. USEPA qPCR usuli yordamida dam olish suvlarini sinash bo'yicha qo'llanma hujjati 1611. Lansing - Michigan shtati universiteti.
Angliya sog'liqni saqlash xizmati, NHS. Buyuk Britaniyaning mikrobiologiya tadqiqotlari uchun standartlari: Molekulyar amplifikatsiya tahlillarini o'tkazishda yaxshi laboratoriya amaliyoti). Sifat bo'yicha qo'llanma. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PZR laboratoriyasini tashkil etish. Cold Spring Harb protokoli. 2007;7.
Schroeder S 2013. Santrifugalarga muntazam texnik xizmat ko'rsatish: santrifugalar, rotorlar va adapterlarni tozalash, texnik xizmat ko'rsatish va dezinfeksiya qilish (Oq qog'oz № 14). Gamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Diagnostika laboratoriyalarida qo'llaniladigan molekulyar asosli testlar uchun yaxshi klinik laboratoriya amaliyoti (GCLP), In: Akyar I, muharrir. Sifat nazoratining keng spektrlari. Rijeka, Xorvatiya: Intech; 2011: 29–52.
Nashr vaqti: 2020-yil 16-iyul
