Молекулалық анықтау әдістері үлгілерде кездесетін іздік мөлшерді күшейту арқылы нуклеин қышқылының көп мөлшерін өндіру мүмкіндігіне ие. Бұл сезімтал анықтауды қамтамасыз ету үшін пайдалы болғанымен, зертханалық ортада күшейту аэрозольдерінің таралуы арқылы ластану мүмкіндігін де тудырады. Тәжірибелер жүргізу кезінде реагенттердің, зертханалық жабдықтардың және стендтік кеңістіктің ластануын болдырмау үшін шаралар қолдануға болады, себебі мұндай ластану жалған оң (немесе жалған теріс) нәтижелер беруі мүмкін.
Ластану ықтималдығын азайту үшін үнемі жақсы зертханалық тәжірибені қолдану керек. Атап айтқанда, келесі мәселелер бойынша сақтық шараларын қолдану қажет:
1. Реагенттерді өңдеу
2. Жұмыс орны мен жабдықтарды ұйымдастыру
3. Белгіленген молекулалық кеңістікті пайдалану және тазалау бойынша кеңестер
4. Жалпы молекулалық биология бойынша кеңестер
5. Ішкі бақылау
6. Библиография
1. Реагенттерді өңдеу
Аэрозольдердің пайда болуын болдырмау үшін реагент түтіктерін ашпас бұрын қысқа уақытқа центрифугалаңыз. Бірнеше рет мұздату-еріту және негізгі қорлардың ластануын болдырмау үшін реагенттердің арақатынасын тексеріңіз. Барлық реагент пен реакция түтіктерінің таңбаларын анық көрсетіп, күнін көрсетіңіз, сондай-ақ барлық тәжірибелерде қолданылған реагент партиясы мен партия нөмірлерінің журналдарын жүргізіңіз. Сүзгі ұштарын пайдаланып, барлық реагенттерді және үлгілерді пипеткамен тазалаңыз. Сатып алмас бұрын, сүзгі ұштарының қолданылатын пипетка брендіне сәйкес келетінін өндірушімен растау ұсынылады.
2. Жұмыс орны мен жабдықтарды ұйымдастыру
Жұмыс орны жұмыс ағыны таза аймақтардан (ПТР алдындағы) лас аймақтарға (ПТР кейін) бір бағытта жүретіндей етіп ұйымдастырылуы керек. Келесі жалпы сақтық шаралары ластану мүмкіндігін азайтуға көмектеседі. Мастермикс дайындау, нуклеин қышқылын алу және ДНҚ шаблонын қосу, күшейтілген өнімді күшейту және өңдеу, сондай-ақ өнімді талдау, мысалы, гель электрофорезі үшін бөлек бөлмелер немесе кем дегенде физикалық тұрғыдан бөлек аймақтар болуы керек.
Кейбір жағдайларда 4 бөлек бөлменің болуы қиын. Мүмкін, бірақ онша қолайлы емес нұсқа - мастер-миксті дайындауды оқшаулау аймағында, мысалы, ламинарлық ағынды шкафта жүргізу. Кіріктірілген ПТР күшейту жағдайында, екінші раунд реакциясына мастер-миксті дайындау мастер-миксті дайындауға арналған «таза» аймақта дайындалуы керек, бірақ бастапқы ПТР өнімімен егу күшейту бөлмесінде және мүмкін болса, арнайы оқшаулау аймағында (мысалы, ламинарлық ағынды шкафта) жүргізілуі керек.
Әрбір бөлме/аймақ үшін анық белгіленген пипеткалардың, сүзгі ұштарының, түтік сөрелерінің, құйындылардың, центрифугалардың (қажет болса), қаламдардың, жалпы зертханалық реагенттер мен зертханалық халаттардың және тиісті жұмыс орындарында қалатын қолғап қораптарының бөлек жиынтығы қажет. Белгіленген аймақтар арасында жылжыған кезде қолды жуу және қолғап пен зертханалық халатты ауыстыру қажет. Реагенттер мен жабдықтарды лас аймақтан таза аймаққа жылжытуға болмайды. Егер реагентті немесе жабдықты артқа жылжыту қажет болатын төтенше жағдай туындаса, оны алдымен 10% натрий гипохлоритімен зарарсыздандыру керек, содан кейін стерильді сумен сүрту керек.
Ескерту
10% натрий гипохлориті ерітіндісін күн сайын жаңадан дайындау керек. Дезинфекциялау үшін қолданған кезде кемінде 10 минут байланыс уақытын сақтау керек.
Балама ретінде, егер жергілікті қауіпсіздік ұсынымдары натрий гипохлоритін пайдалануға рұқсат бермесе немесе натрий гипохлориті жабдықтың металл бөліктерін зарарсыздандыруға жарамсыз болса, ДНҚ-ны бұзатын беттік деконтаминанттар ретінде расталған коммерциялық қолжетімді өнімдерді пайдалануға болады.
Ең дұрысы, қызметкерлер бір бағытты жұмыс ағынының этосын ұстануы және сол күні лас жерлерден (ПТР-дан кейін) таза жерлерге (ПТР алдында) қайтып бармауы керек. Дегенмен, бұл сөзсіз болатын жағдайлар болуы мүмкін. Мұндай жағдай туындаған кезде қызметкерлер қолдарын мұқият жууға, қолғаптарды ауыстыруға, арнайы зертханалық халатты киюге және бөлмеден алып шыққысы келетін кез келген жабдықты, мысалы, зертханалық кітаптарды қолданбауға тырысуы керек. Мұндай бақылау шараларына қызметкерлерді молекулалық әдістер бойынша оқытуда баса назар аудару керек.
Қолданғаннан кейін, үстел үстілерін 10% натрий гипохлоритімен (қалдық ағартқышты кетіру үшін стерильді сумен), 70% этанолмен немесе коммерциялық қолжетімді ДНҚ-ны бұзатын зарарсыздандырғышпен тазалау керек. Сәулелендіру арқылы зарарсыздандыру үшін ультракүлгін (УК) шамдарды орнату керек. Дегенмен, зертхана қызметкерлерінің УК сәулесіне ұшырауын шектеу үшін УК шамдарын жабық жұмыс аймақтарымен, мысалы, қауіпсіздік шкафтарымен шектеу керек. Шамдардың тиімді жұмыс істеуін қамтамасыз ету үшін УК шамына күтім жасау, желдету және тазалау бойынша өндірушінің нұсқауларын орындаңыз.
Егер натрий гипохлоритінің орнына 70% этанол қолданылса, залалсыздандыруды аяқтау үшін ультракүлгін сәулемен сәулелендіру қажет болады.
Құйынды мен центрифуганы натрий гипохлоритімен тазаламаңыз; оның орнына 70% этанолмен сүртіп, ультракүлгін сәулеге ұшыратыңыз немесе коммерциялық ДНҚ-ны бұзатын деконтаминант қолданыңыз. Төгілген заттар үшін тазалау бойынша қосымша кеңес алу үшін өндірушімен хабарласыңыз. Егер өндірушінің нұсқаулары мүмкіндік берсе, пипеткаларды автоклавпен үнемі зарарсыздандыру керек. Егер пипеткаларды автоклавпен тазалау мүмкін болмаса, оларды 10% натрий гипохлоритімен (кейіннен стерильді сумен мұқият сүрту керек) немесе коммерциялық ДНҚ-ны бұзатын деконтаминантпен, содан кейін ультракүлгін сәулеге ұшырату жеткілікті болуы керек.
Жоғары пайыздық натрий гипохлоритімен тазалау үнемі жүргізілсе, пипетка пластмассалары мен металдарын зақымдауы мүмкін; алдымен өндірушінің ұсыныстарын тексеріңіз. Барлық жабдықты өндіруші ұсынған кестеге сәйкес үнемі калибрлеу қажет. Калибрлеу кестесінің сақталуын, егжей-тегжейлі журналдардың жүргізілуін және жабдықта қызмет көрсету белгілерінің анық көрсетілуін қамтамасыз ету үшін тағайындалған тұлға жауапты болуы керек.
3. Белгіленген молекулалық кеңістікті пайдалану және тазалау бойынша кеңестер
ПТР алдындағы зерттеу: Реагенттерді аликвоттау / мастер-микс дайындау: Бұл молекулалық эксперименттерді дайындау үшін қолданылатын барлық кеңістіктердің ішіндегі ең тазасы болуы керек және ультракүлгін сәулемен жабдықталған арнайы ламинарлық ағынды шкаф болуы керек. Үлгілерді, экстракцияланған нуклеин қышқылын және күшейтілген ПТР өнімдерін бұл аймақта ұстауға болмайды. Күшейту реагенттерін мұздатқышта (немесе өндірушінің ұсыныстарына сәйкес тоңазытқышта) сол арнайы кеңістікте, ламинарлық ағынды шкафтың немесе ПТР алдындағы аймақтың жанында сақтау керек. ПТР алдындағы аймаққа немесе ламинарлық ағынды шкафқа кірген сайын қолғаптарды ауыстыру керек.
ПТР алдындағы аймақты немесе ламинарлық ағынды шкафты пайдалану алдында және кейін келесідей тазалау керек: шкафтағы барлық заттарды, мысалы, пипеткаларды, ұштық қораптарды, құйындыларды, центрифугаларды, түтік сөрелерін, қаламдарды және т.б. 70% этанолмен немесе коммерциялық ДНҚ-ны бұзатын деконтаминантпен сүртіп, кептіріңіз. Жабық жұмыс аймағында, мысалы, ламинарлық ағынды шкафта, сорғышты 30 минут бойы ультракүлгін сәулеге ұшыратыңыз.
Ескерту
Реагенттерді ультракүлгін сәулеге ұшыратпаңыз; оларды тек таза болғаннан кейін ғана шкафқа салыңыз. Кері транскрипциялық ПТР жүргізілсе, беттер мен жабдықты жанасқан кезде РНҚ-ны ыдырататын ерітіндімен сүрту пайдалы болуы мүмкін. Бұл РНҚ-ның ферменттік ыдырауынан жалған теріс нәтижелердің алдын алуға көмектеседі. Дезинфекциядан кейін және мастер-миксті дайындамас бұрын қолғаптарды қайтадан ауыстыру керек, содан кейін шкаф пайдалануға дайын болады.
ПТР алдындағы кезең: Нуклеин қышқылын экстракциялау/үлгіні қосу:
Нуклеин қышқылы бөлек пипеткалар жиынтығын, сүзгі ұштарын, түтік сөрелерін, жаңа қолғаптарды, зертханалық халаттарды және басқа да жабдықтарды пайдаланып, екінші белгіленген аймақта алынып, өңделуі керек. Бұл аймақ сонымен қатар мастер-микс түтіктеріне немесе пластиналарына шаблон, басқару элементтері және тренд сызықтарын қосуға арналған. Талданып жатқан алынған нуклеин қышқылы үлгілерінің ластануын болдырмау үшін оң бақылаулармен немесе стандарттармен жұмыс істемес бұрын қолғаптарды ауыстыру және бөлек пипеткалар жиынтығын пайдалану ұсынылады. ПТР реагенттері мен күшейтілген өнімдерді бұл аймақта пипеткалауға болмайды. Үлгілерді сол аймақтағы арнайы тоңазытқыштарда немесе мұздатқыштарда сақтау керек. Үлгінің жұмыс кеңістігі мастер-микс кеңістігі сияқты тазалануы керек.
ПТР-дан кейінгі: күшейтілген өнімді күшейту және өңдеу
Бұл арнайы кеңістік күшейтуден кейінгі процестерге арналған және ПТР алдындағы аймақтардан физикалық тұрғыдан бөлек болуы керек. Әдетте онда термоциклерлер мен нақты уақыт платформалары болады, және егер ішкі ПТР жүргізіліп жатса, 1-ші раундтағы ПТР өнімін 2-ші раундтағы реакцияға қосуға арналған ламинарлық ағындық шкаф болуы керек. ПТР реагенттері мен экстракцияланған нуклеин қышқылы ластану қаупі жоғары болғандықтан, бұл аймақта өңделмеуі керек. Бұл аймақта қолғаптардың, зертханалық халаттардың, пластиналар мен түтік сөрелерінің, пипеткалардың, сүзгі ұштарының, қоқыс жәшіктерінің және басқа жабдықтардың бөлек жиынтығы болуы керек. Түтіктерді ашпас бұрын центрифугалау керек. Үлгінің жұмыс кеңістігі мастер-микс кеңістігі сияқты тазалануы керек.
ПТР-дан кейінгі: өнімді талдау
Бұл бөлме өнімді анықтауға арналған жабдықтарға, мысалы, гель электрофорезіне арналған бактарға, қуат блоктарына, ультракүлгін трансиллюминаторға және гель құжаттама жүйесіне арналған. Бұл аймақта қолғаптардың, зертханалық халаттардың, пластиналар мен түтіктерге арналған сөрелердің, пипеткалардың, сүзгі ұштарының, қоқыс жәшіктерінің және басқа да жабдықтардың бөлек жиынтығы болуы керек. Бұл аймаққа бояуды, молекулалық маркерді және агарозды гелді, сондай-ақ буферлік компоненттерді қоспағанда, басқа реагенттерді әкелуге болмайды. Үлгінің жұмыс кеңістігі мастер-микс кеңістігі сияқты тазалануы керек.
Маңызды ескертпе
Ең дұрысы, егер ПТР-дан кейінгі бөлмелерде жұмыс бұрыннан орындалған болса, ПТР алдындағы бөлмелерге сол күні кірмеу керек. Егер бұл мүлдем мүмкін болмаса, алдымен қолдарды мұқият жуып, бөлмелерде арнайы зертханалық халаттарды киюді қамтамасыз етіңіз. Зертханалық кітаптар мен құжаттар ПТР-дан кейінгі бөлмелерде қолданылған болса, ПТР алдындағы бөлмелерге кіргізілмеуі керек; қажет болған жағдайда хаттамалардың/үлгі куәліктерінің және т.б. көшірмелерін алыңыз.
4. Жалпы молекулалық биология бойынша кеңестер
Сынақ кедергісін болдырмау үшін ұнтақсыз қолғаптарды пайдаланыңыз. Ластануды азайту үшін дұрыс пипеткалау әдісі өте маңызды. Дұрыс пипеткалау сұйықтықтарды берген кезде шашырауға және аэрозольдердің пайда болуына әкелуі мүмкін. Дұрыс пипеткалаудың жақсы тәжірибесін келесі сілтемелерден табуға болады: Гилсон пипеткалау бойынша нұсқаулығы, Анахем пипеткалау техникасы туралы бейнелер, түтіктерді ашпас бұрын центрифугалаңыз және шашырамас үшін абайлап ашыңыз. Ластаушы заттардың енуіне жол бермеу үшін түтіктерді қолданғаннан кейін бірден жабыңыз.
Бірнеше реакцияларды орындаған кезде, реагенттердің берілуі санын азайту және ластану қаупін азайту үшін жалпы реагенттер (мысалы, су, dNTP, буфер, праймерлер және фермент) бар бір мастер-микс дайындаңыз. Master-mix-ті мұзға немесе суық блокқа орнату ұсынылады. Ыстық старт ферментін пайдалану арнайы емес өнімдердің өндірісін азайтуға көмектесуі мүмкін. Флуоресцентті зондтар бар реагенттерді ыдырауды болдырмау үшін жарықтан қорғаңыз.
5. Ішкі бақылау
Барлық реакциялардағы үлгісіз бақылаумен қатар, жақсы сипатталған, расталған оң және теріс бақылауларды және сандық реакциялар үшін көп нүктелі титрленген тренд сызығын қосыңыз. Оң бақылау ластану қаупін тудыратындай күшті болмауы керек. Нуклеин қышқылын экстракциялау кезінде оң және теріс экстракция бақылауларын қосыңыз.
Пайдаланушылар мінез-құлық ережелерін білуі үшін әрбір аймаққа нақты нұсқаулар ілінуі ұсынылады. Клиникалық үлгілерде ДНҚ немесе РНҚ деңгейінің өте төмен екенін анықтайтын диагностикалық зертханалар ПТР алдындағы бөлмелерде ауа қысымы сәл оң және ПТР-дан кейінгі бөлмелерде ауа қысымы сәл теріс болатын бөлек ауа өңдеу жүйелерін орнату сияқты қосымша қауіпсіздік шарасын қабылдауы мүмкін.
Соңында, сапаны қамтамасыз ету (СҚ) жоспарын әзірлеу пайдалы. Мұндай жоспарға реагенттердің негізгі және жұмыс қорларының тізімдері, жинақтар мен реагенттерді сақтау ережелері, бақылау нәтижелері туралы есеп, қызметкерлерді оқыту бағдарламалары, ақаулықтарды жою алгоритмдері және қажет болған жағдайда түзету шаралары кіруі керек.
6. Библиография
Аслан А, Кинзельман Дж, Дреелин Э, Ананьева Т, Лавандер Дж. 3-тарау: Сапалы криптовалюталық транскриптографиялық зертхананы құру. USEPA 1611 сапалы криптовалюталық транскриптографиялық әдісін қолдана отырып, демалыс суларын сынауға арналған нұсқаулық құжат. Лансинг - Мичиган мемлекеттік университеті.
Англияның қоғамдық денсаулық сақтау қызметі, NHS. Микробиологиялық зерттеулерге арналған Ұлыбритания стандарттары: Молекулалық күшейту талдауларын жүргізу кезіндегі жақсы зертханалық тәжірибе). Сапа бойынша нұсқаулық. 2013;4(4):1–15.
Миффлин Т. ПТР зертханасын құру. Cold Spring Harb хаттамасы. 2007;7.
Шредер С 2013. Центрифугаларға күнделікті техникалық қызмет көрсету: центрифугаларды, роторларды және адаптерлерді тазалау, техникалық қызмет көрсету және дезинфекциялау (Ақ қағаз № 14). Гамбург: Эппендорф; 2013.
Виана Р.В., Уоллис К.Л. Диагностикалық зертханаларда қолданылатын молекулалық негіздегі сынақтарға арналған жақсы клиникалық зертханалық тәжірибе (GCLP), Ақяр И., редактор. Сапаны бақылаудың кең спектрлері. Риека, Хорватия: Intech; 2011: 29–52.
Жарияланған уақыты: 16 шілде 2020 ж.
