分子検出法は、試料中に存在する微量の核酸を増幅することで、大量の核酸を生成する能力を持つ。これは高感度な検出を可能にする上で有益である一方、増幅エアロゾルが実験室内に拡散することで汚染が生じる可能性も伴う。実験を行う際には、試薬、実験器具、実験台の汚染を避けるための対策を講じる必要がある。なぜなら、このような汚染は偽陽性（または偽陰性）の結果を生み出す可能性があるからである。
汚染の可能性を低減するためには、常に優良実験室規範（GLP）を遵守する必要があります。具体的には、以下の点について予防措置を講じる必要があります。
1. 試薬の取り扱い
2. 作業スペースと機器の配置
3. 指定された分子空間での使用および清掃に関するアドバイス
4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス
5. 内部統制
6. 参考文献
1. 試薬の取り扱い
試薬チューブを開封する前に、エアロゾルの発生を防ぐため、軽く遠心分離してください。試薬は分注して、凍結融解の繰り返しや原液の汚染を防いでください。すべての試薬チューブと反応チューブには、ラベルを貼って日付を記入し、すべての実験で使用した試薬のロット番号とバッチ番号を記録してください。すべての試薬とサンプルは、フィルターチップを使用してピペットで分注してください。購入前に、フィルターチップが使用するピペットのブランドに適合するかどうかを製造元に確認することをお勧めします。
2. 作業スペースと機器の配置
作業スペースは、クリーンエリア（PCR前）からダーティーエリア（PCR後）へと作業の流れが一方向になるように整理する必要があります。以下の一般的な予防措置は、汚染の可能性を低減するのに役立ちます。マスターミックスの調製、核酸抽出とDNAテンプレートの添加、増幅と増幅産物の取り扱い、およびゲル電気泳動などの産物分析のために、それぞれ専用の部屋、または少なくとも物理的に分離されたエリアを用意してください。
環境によっては、4つの独立した部屋を用意することが難しい場合があります。可能ではあるものの、あまり望ましくない選択肢として、マスターミックスの調製をクリーンルームなどの封じ込めエリアで行う方法があります。ネステッドPCR増幅の場合、2回目の反応用のマスターミックスの調製は、マスターミックス調製用の「クリーン」エリアで行う必要がありますが、一次PCR産物の接種は増幅室で行い、可能であれば専用の封じ込めエリア（クリーンルームなど）で行う必要があります。
各部屋/エリアには、それぞれの作業台に常備する、ラベルが明確に貼られたピペット、フィルターチップ、試験管立て、ボルテックスミキサー、遠心分離機（該当する場合）、ペン、汎用試薬、白衣、手袋の箱をそれぞれ用意する必要があります。指定されたエリア間を移動する際は、必ず手を洗い、手袋と白衣を交換してください。試薬や機器を汚染エリアから清潔エリアに移動させてはいけません。試薬や機器を逆方向に移動させる必要がある場合は、まず10%次亜塩素酸ナトリウムで除染し、その後滅菌水で拭き取ってください。
注記
10％次亜塩素酸ナトリウム溶液は毎日新たに調製しなければならない。除染に使用する場合は、最低10分間の接触時間を確保する必要がある。
あるいは、地域の安全勧告で次亜塩素酸ナトリウムの使用が認められていない場合、または次亜塩素酸ナトリウムが機器の金属部分の除染に適していない場合は、DNAを破壊する表面除染剤として検証済みの市販製品を使用することもできます。
理想的には、スタッフは一方向の作業フローの原則を遵守し、汚染区域（PCR後）から清潔区域（PCR前）へ同日中に移動しないようにすべきです。しかし、やむを得ない場合もあります。そのような場合は、スタッフは十分に手を洗い、手袋を交換し、指定された実験用白衣を着用し、実験ノートなど、部屋から持ち出す予定の機器を持ち込まないように注意する必要があります。このような管理措置は、分子生物学的手法に関するスタッフ研修において強調されるべきです。
使用後は、実験台を10%次亜塩素酸ナトリウム（残留漂白剤を除去するために滅菌水で洗浄）、70%エタノール、または検証済みの市販のDNA破壊除染剤で洗浄してください。理想的には、紫外線（UV）ランプを設置し、照射による除染を行うようにしてください。ただし、実験室スタッフの紫外線被曝を最小限に抑えるため、UVランプの使用は安全キャビネットなどの密閉された作業エリアに限定してください。ランプの有効性を維持するため、UVランプの手入れ、換気、洗浄については、製造元の指示に従ってください。
次亜塩素酸ナトリウムの代わりに70％エタノールを使用する場合は、除染を完了するために紫外線照射が必要になります。
ボルテックスミキサーと遠心分離機は次亜塩素酸ナトリウムで洗浄しないでください。代わりに、70%エタノールで拭き取り、紫外線に当てるか、市販のDNA破壊除染剤を使用してください。こぼれた場合は、製造元に連絡して洗浄方法について確認してください。製造元の指示で許可されている場合は、ピペットは定期的にオートクレーブで滅菌してください。ピペットをオートクレーブで滅菌できない場合は、10%次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し（その後、滅菌水で十分に拭き取る）、または市販のDNA破壊除染剤で洗浄した後、紫外線に当てれば十分です。
高濃度の次亜塩素酸ナトリウムで定期的に洗浄すると、ピペットのプラスチックや金属が損傷する可能性があります。必ず製造元の推奨事項を確認してください。すべての機器は、製造元が推奨するスケジュールに従って定期的に校正する必要があります。校正スケジュールが遵守され、詳細な記録が保管され、サービスラベルが機器に明確に表示されていることを確認する担当者を指名してください。
3. 指定された分子空間での使用および清掃に関するアドバイス
PCR前処理：試薬の分注／マスターミックスの調製：この場所は、分子実験の準備に使用するすべてのスペースの中で最も清潔な場所であるべきであり、理想的にはUVライトを備えた専用のクリーンルームであるべきです。サンプル、抽出された核酸、および増幅されたPCR産物は、このエリアで取り扱ってはなりません。増幅試薬は、同じ指定スペースの冷凍庫（またはメーカーの推奨に従って冷蔵庫）に保管し、理想的にはクリーンルームまたはPCR前処理エリアの隣に保管してください。PCR前処理エリアまたはクリーンルームに入るたびに手袋を交換してください。
PCR前処理エリアまたはクリーンベンチは、使用前後に以下の手順で清掃してください。ピペット、チップボックス、ボルテックスミキサー、遠心分離機、チューブホルダー、ペンなど、キャビネット内のすべての物品を70%エタノールまたは市販のDNA破壊除染剤で拭き、乾燥させてください。クリーンベンチなどの密閉された作業エリアの場合は、フードを30分間紫外線に照射してください。
注記
試薬を紫外線にさらさないでください。キャビネットが清掃されてから試薬をキャビネットに移してください。逆転写PCRを行う場合は、接触したRNaseを分解する溶液で表面や機器を拭き取ると効果的です。これにより、RNAの酵素分解による偽陰性結果を防ぐことができます。除染後、マスターミックスを調製する前に、手袋をもう一度交換してください。その後、キャビネットは使用可能になります。
PCR前処理：核酸抽出／テンプレート添加：
核酸の抽出と取り扱いは、別の指定区域で行い、別のピペット、フィルターチップ、チューブホルダー、新しい手袋、白衣、その他の器具を使用してください。この区域は、マスターミックスチューブまたはプレートにテンプレート、コントロール、トレンドラインを追加する場所でもあります。分析中の抽出核酸サンプルの汚染を避けるため、陽性コントロールまたは標準物質を扱う前に手袋を交換し、別のピペットセットを使用することをお勧めします。PCR試薬および増幅産物は、この区域でピペット操作しないでください。サンプルは、同じ区域内の指定された冷蔵庫または冷凍庫に保管してください。サンプル作業スペースは、マスターミックス作業スペースと同様の方法で清掃してください。
PCR後：増幅および増幅産物の取り扱い
この指定スペースは増幅後の処理用であり、PCR前処理エリアとは物理的に分離されている必要があります。通常、サーマルサイクラーとリアルタイムプラットフォームが設置されており、ネステッドPCRを行う場合は、ラウンド1のPCR産物をラウンド2の反応に添加するためのクリーンベンチが理想的です。汚染のリスクが高いため、PCR試薬や抽出した核酸はこのエリアでは取り扱ってはいけません。このエリアには、手袋、白衣、プレートおよびチューブ用ラック、ピペット、フィルターチップ、容器、その他の機器をそれぞれ別に用意する必要があります。チューブは開封前に遠心分離する必要があります。サンプル作業スペースは、マスターミックス作業スペースと同様の方法で清掃する必要があります。
PCR後：生成物分析
この部屋は、ゲル電気泳動槽、電源装置、UVトランスイルミネーター、ゲル画像記録システムなどの製品検出装置を設置するための部屋です。このエリアには、手袋、白衣、プレート・チューブ用ラック、ピペット、フィルターチップ、容器、その他の機器をそれぞれ別に用意してください。ローディング色素、分子量マーカー、アガロースゲル、緩衝液成分を除き、他の試薬をこのエリアに持ち込むことはできません。サンプル作業スペースは、マスターミックス作業スペースと同様の方法で清掃してください。
重要な注意事項
理想的には、PCR後処理室で作業を行った日は、PCR前処理室には入室しないでください。どうしても入室せざるを得ない場合は、まず手を十分に洗い、専用の実験用白衣を着用してください。PCR後処理室で使用した実験ノートや書類は、PCR前処理室に持ち込まないでください。必要な場合は、プロトコルやサンプルIDなどの複製を持参してください。
4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス
アッセイ阻害を避けるため、パウダーフリーの手袋を使用してください。汚染を減らすには、正しいピペット操作が非常に重要です。ピペット操作が不適切だと、液体を分注する際に飛沫が発生したり、エアロゾルが発生したりする恐れがあります。正しいピペット操作の手順については、以下のリンクを参照してください。ギルソン社のピペット操作ガイド、アナケム社のピペット操作テクニック動画、遠心分離管は開封前に遠心分離し、飛沫が入らないように注意深く開封してください。汚染物質の混入を防ぐため、使用後はすぐにチューブを閉じてください。
複数の反応を行う場合は、試薬の移し替え回数を最小限に抑え、汚染のリスクを軽減するために、共通の試薬（水、dNTP、バッファー、プライマー、酵素など）を含むマスターミックスを1つ用意してください。マスターミックスは氷または冷却ブロック上で調製することをお勧めします。ホットスタート酵素を使用すると、非特異的な生成物の生成を抑えることができます。蛍光プローブを含む試薬は、劣化を防ぐため光から保護してください。
5. 内部統制
すべての反応において、特性が十分に確認された陽性および陰性コントロール、ならびにテンプレートなしコントロールを含め、定量反応には多点滴定トレンドラインを含めること。陽性コントロールは、汚染リスクとなるほど強力であってはならない。核酸抽出を行う際には、陽性および陰性の抽出コントロールを含めること。
利用者が行動規範を認識できるよう、各エリアに明確な指示を掲示することをお勧めします。臨床検体中の非常に微量のDNAまたはRNAを検出する診断検査室では、PCR前室にわずかに正圧、PCR後室にわずかに負圧となるように、独立した空調システムを導入するという追加のセキュリティ対策を採用することを検討すると良いでしょう。
最後に、品質保証（QA）計画を策定することが有効です。このような計画には、試薬のマスターストックと作業用ストックのリスト、キットと試薬の保管規則、コントロール結果の報告、スタッフ研修プログラム、トラブルシューティングアルゴリズム、および必要に応じた是正措置を含めるべきです。
6. 参考文献
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英国公衆衛生庁、NHS。微生物検査に関する英国基準：分子増幅アッセイ実施時の優良検査室基準）。品質ガイダンス。2013;4(4):1–15。
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Schroeder S 2013. 遠心分離機の定期メンテナンス：遠心分離機、ローター、アダプターの洗浄、メンテナンス、消毒（ホワイトペーパーNo.14）。ハンブルク：エッペンドルフ；2013年。
Viana RV、Wallis CL。診断検査室で使用される分子ベースの検査のための優良臨床検査室実施基準（GCLP）、Akyar I 編著。品質管理の幅広いスペクトル。クロアチア、リエカ：Intech; 2011: 29–52。
投稿日時：2020年7月16日
