ข้อควรปฏิบัติและข้อห้ามสำหรับการตรวจทางโมเลกุล

วิธีการตรวจจับระดับโมเลกุลมีความสามารถในการสร้างกรดนิวคลีอิกปริมาณมากโดยการขยายปริมาณสารที่พบในตัวอย่างเพียงเล็กน้อย แม้ว่าวิธีนี้จะเป็นประโยชน์ในการช่วยให้ตรวจจับได้อย่างแม่นยำ แต่ก็อาจทำให้เกิดการปนเปื้อนจากการแพร่กระจายของละอองลอยจากการขยายปริมาณสารในสภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการ ในการทำการทดลอง ควรมีการดำเนินการเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของสารเคมี อุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ และพื้นที่ทำงาน เนื่องจากอาจทำให้เกิดผลบวกเท็จ (หรือผลลบเท็จ) ได้

เพื่อช่วยลดโอกาสการปนเปื้อน ควรปฏิบัติตามหลักปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการอยู่เสมอ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ควรระมัดระวังในประเด็นต่อไปนี้:

1. การจัดการสารเคมี
2. การจัดระเบียบพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์
3. คำแนะนำการใช้งานและการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด
4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล
5. การควบคุมภายใน
6. บรรณานุกรม

1. การจัดการสารเคมี

ปั่นเหวี่ยงหลอดบรรจุสารเคมีสักครู่ก่อนเปิด เพื่อป้องกันการเกิดละอองลอย แบ่งสารเคมีออกเป็นส่วนย่อยๆ เพื่อป้องกันการแช่แข็งและละลายซ้ำหลายครั้ง และการปนเปื้อนของสารละลายตั้งต้น ติดฉลากและระบุวันที่บนหลอดบรรจุสารเคมีและหลอดปฏิกิริยาทุกหลอดอย่างชัดเจน และบันทึกหมายเลขล็อตและหมายเลขชุดการผลิตของสารเคมีที่ใช้ในการทดลองทั้งหมด ใช้ปิเปตที่มีตัวกรองในการดูดสารเคมีและตัวอย่าง ก่อนซื้อ ควรตรวจสอบกับผู้ผลิตว่าตัวกรองนั้นเหมาะสมกับยี่ห้อของปิเปตที่จะใช้หรือไม่

2. การจัดระเบียบพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์

ควรจัดพื้นที่ทำงานให้เป็นระเบียบเพื่อให้การทำงานเป็นไปในทิศทางเดียว คือจากพื้นที่สะอาด (ก่อนทำ PCR) ไปยังพื้นที่สกปรก (หลังทำ PCR) ข้อควรระวังทั่วไปต่อไปนี้จะช่วยลดโอกาสการปนเปื้อนได้ ควรจัดห้องแยกต่างหาก หรืออย่างน้อยที่สุดก็จัดพื้นที่แยกกันสำหรับ: การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ การสกัดกรดนิวคลีอิกและการเติมแม่แบบ DNA การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยายแล้ว และการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ เช่น เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส

ในบางสถานการณ์ การมีห้องแยกกัน 4 ห้องอาจทำได้ยาก ทางเลือกที่เป็นไปได้แต่ไม่เป็นที่พึงประสงค์นักคือการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ในพื้นที่ควบคุม เช่น ตู้ไหลเวียนอากาศแบบลามินาร์ ในกรณีของการขยายดีเอ็นเอแบบเนสเต็ด PCR การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์สำหรับปฏิกิริยารอบที่สองควรทำในพื้นที่ "สะอาด" สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ แต่การใส่ผลิตภัณฑ์ PCR รอบแรกควรทำในห้องขยายดีเอ็นเอ และถ้าเป็นไปได้ควรทำในพื้นที่ควบคุมเฉพาะ (เช่น ตู้ไหลเวียนอากาศแบบลามินาร์)

แต่ละห้อง/พื้นที่จำเป็นต้องมีชุดอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการที่ติดป้ายกำกับอย่างชัดเจน ได้แก่ ปิเปต ปลายกรอง ที่วางหลอดทดลอง เครื่องปั่นเหวี่ยง (ถ้าจำเป็น) ปากกา สารเคมีทั่วไป เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และกล่องถุงมือ ซึ่งจะต้องวางไว้ที่โต๊ะทำงานของตนเอง ต้องล้างมือและเปลี่ยนถุงมือและเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการทุกครั้งที่เคลื่อนย้ายระหว่างพื้นที่ที่กำหนด ห้ามเคลื่อนย้ายสารเคมีและอุปกรณ์จากพื้นที่สกปรกไปยังพื้นที่สะอาด หากเกิดกรณีฉุกเฉินที่ต้องเคลื่อนย้ายสารเคมีหรืออุปกรณ์กลับไป จะต้องทำการฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ก่อน แล้วจึงเช็ดทำความสะอาดด้วยน้ำปราศจากเชื้อ

บันทึก

สารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ต้องเตรียมใหม่ทุกวัน เมื่อใช้ในการฆ่าเชื้อ ควรเว้นระยะเวลาสัมผัสอย่างน้อย 10 นาที
อีกทางเลือกหนึ่งคือ สามารถใช้ผลิตภัณฑ์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ซึ่งได้รับการรับรองว่าเป็นสารฆ่าเชื้อบนพื้นผิวที่ทำลาย DNA ได้ หากข้อแนะนำด้านความปลอดภัยในท้องถิ่นไม่อนุญาตให้ใช้โซเดียมไฮโปคลอไรต์ หรือหากโซเดียมไฮโปคลอไรต์ไม่เหมาะสมสำหรับการฆ่าเชื้อชิ้นส่วนโลหะของอุปกรณ์

โดยหลักการแล้ว บุคลากรควรปฏิบัติตามหลักการทำงานแบบทิศทางเดียว และไม่ควรเดินจากพื้นที่สกปรก (หลังการทำ PCR) กลับไปยังพื้นที่สะอาด (ก่อนการทำ PCR) ในวันเดียวกัน อย่างไรก็ตาม อาจมีบางกรณีที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ เมื่อเกิดกรณีเช่นนั้น บุคลากรต้องระมัดระวังในการล้างมือให้สะอาด เปลี่ยนถุงมือ สวมเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการที่กำหนด และไม่นำอุปกรณ์ใดๆ ที่ต้องการนำออกจากห้องอีก เช่น สมุดบันทึกห้องปฏิบัติการ มาตรการควบคุมดังกล่าวควรเน้นย้ำในการฝึกอบรมบุคลากรเกี่ยวกับวิธีการทางโมเลกุล

หลังการใช้งาน ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานด้วยสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยน้ำปราศจากเชื้อเพื่อขจัดสารฟอกขาวที่ตกค้าง) เอทานอล 70% หรือสารฆ่าเชื้อที่ทำลายดีเอ็นเอที่ได้รับการรับรองจากผู้ผลิต โดยควรติดตั้งหลอดอัลตราไวโอเลต (UV) เพื่อใช้ในการฆ่าเชื้อด้วยการฉายรังสี อย่างไรก็ตาม ควรจำกัดการใช้หลอด UV เฉพาะในพื้นที่ทำงานปิด เช่น ตู้ความปลอดภัย เพื่อจำกัดการสัมผัสรังสี UV ของบุคลากรในห้องปฏิบัติการ โปรดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตเกี่ยวกับการดูแลรักษา การระบายอากาศ และการทำความสะอาดหลอด UV เพื่อให้มั่นใจว่าหลอดไฟยังคงมีประสิทธิภาพ

หากใช้เอทานอล 70% แทนโซเดียมไฮโปคลอไรต์ จะต้องฉายรังสี UV เพื่อให้กระบวนการฆ่าเชื้อเสร็จสมบูรณ์
ห้ามทำความสะอาดเครื่องปั่นเหวี่ยงและเครื่องปั่นแยกสารด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ ให้เช็ดทำความสะอาดด้วยเอทานอล 70% แล้วนำไปตากแดดหรือใช้สารฆ่าเชื้อที่ทำลายดีเอ็นเอสำหรับใช้ในเชิงพาณิชย์ สำหรับกรณีที่สารหก ให้ตรวจสอบกับผู้ผลิตเพื่อขอคำแนะนำเพิ่มเติมเกี่ยวกับการทำความสะอาด หากคำแนะนำของผู้ผลิตอนุญาต ควรฆ่าเชื้อปิเปตด้วยเครื่องนึ่งฆ่าเชื้อเป็นประจำ หากไม่สามารถนึ่งฆ่าเชื้อปิเปตได้ การทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยการเช็ดทำความสะอาดอย่างทั่วถึงด้วยน้ำปราศจากเชื้อ) หรือด้วยสารฆ่าเชื้อที่ทำลายดีเอ็นเอสำหรับใช้ในเชิงพาณิชย์แล้วนำไปตากแดดก็เพียงพอแล้ว

การทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ที่มีความเข้มข้นสูงอาจทำให้พลาสติกและโลหะของปิเปตเสียหายได้หากทำเป็นประจำ ควรตรวจสอบคำแนะนำจากผู้ผลิตก่อน อุปกรณ์ทุกชิ้นต้องได้รับการสอบเทียบอย่างสม่ำเสมอตามตารางเวลาที่ผู้ผลิตแนะนำ ควรมีผู้รับผิดชอบที่ได้รับมอบหมายให้ดูแลให้มีการปฏิบัติตามตารางการสอบเทียบ บันทึกรายละเอียดอย่างครบถ้วน และติดฉลากบริการไว้บนอุปกรณ์อย่างชัดเจน

3. คำแนะนำการใช้งานและการทำความสะอาดสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด

ขั้นตอนก่อน PCR: การแบ่งส่วนรีเอเจนต์ / การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์: บริเวณนี้ควรเป็นบริเวณที่สะอาดที่สุดในบรรดาพื้นที่ทั้งหมดที่ใช้ในการเตรียมการทดลองทางโมเลกุล และควรเป็นตู้ปลอดเชื้อ (laminar flow cabinet) ที่ติดตั้งไฟ UV ห้ามสัมผัสตัวอย่าง สารนิวคลีอิกที่สกัดแล้ว และผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยายแล้วในบริเวณนี้ ควรเก็บรีเอเจนต์สำหรับการขยายไว้ในช่องแช่แข็ง (หรือตู้เย็น ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ในพื้นที่ที่กำหนดไว้เดียวกัน โดยควรอยู่ติดกับตู้ปลอดเชื้อหรือบริเวณก่อน PCR ควรเปลี่ยนถุงมือทุกครั้งเมื่อเข้าบริเวณก่อน PCR หรือตู้ปลอดเชื้อ

ควรทำความสะอาดบริเวณเตรียม PCR หรือตู้ปลอดเชื้อก่อนและหลังการใช้งานดังนี้: เช็ดทำความสะอาดอุปกรณ์ทั้งหมดในตู้ เช่น ปิเปต กล่องใส่ปลายปิเปต เครื่องปั่นเหวี่ยง กระบอกใส่หลอดทดลอง ปากกา ฯลฯ ด้วยเอทานอล 70% หรือน้ำยาฆ่าเชื้อที่ทำลาย DNA ได้ และปล่อยให้แห้ง ในกรณีที่เป็นพื้นที่ทำงานแบบปิด เช่น ตู้ปลอดเชื้อ ให้ฉายแสง UV เข้าไปในตู้เป็นเวลา 30 นาที

บันทึก

อย่าให้สารเคมีสัมผัสกับแสงยูวีโดยตรง ควรนำสารเคมีเข้าไปในตู้ก็ต่อเมื่อทำความสะอาดตู้เรียบร้อยแล้วเท่านั้น หากทำปฏิกิริยา PCR แบบย้อนกลับ (reverse transcription PCR) อาจเป็นประโยชน์ที่จะเช็ดทำความสะอาดพื้นผิวและอุปกรณ์ด้วยสารละลายที่สามารถย่อยสลายเอนไซม์ RNase ได้ทันที ซึ่งอาจช่วยหลีกเลี่ยงผลลบเท็จจากการย่อยสลาย RNA โดยเอนไซม์ หลังจากทำความสะอาดและก่อนเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ ควรเปลี่ยนถุงมืออีกครั้ง จากนั้นตู้ก็พร้อมใช้งาน

ขั้นตอนก่อน PCR: การสกัดกรดนิวคลีอิก/การเติมแม่แบบ:

ต้องทำการสกัดและจัดการกรดนิวคลีอิกในพื้นที่ที่กำหนดไว้เป็นอีกพื้นที่หนึ่ง โดยใช้ชุดปิเปต ตัวกรองปลายปิเปต ชั้นวางหลอดทดลอง ถุงมือใหม่ เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และอุปกรณ์อื่นๆ ที่แยกต่างหาก พื้นที่นี้ยังใช้สำหรับเติมแม่แบบ ตัวควบคุม และเส้นแนวโน้มลงในหลอดหรือเพลทมาสเตอร์มิกซ์ด้วย เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของตัวอย่างกรดนิวคลีอิกที่สกัดแล้วซึ่งกำลังได้รับการวิเคราะห์ ขอแนะนำให้เปลี่ยนถุงมือก่อนจัดการกับตัวควบคุมเชิงบวกหรือมาตรฐาน และใช้ชุดปิเปตที่แยกต่างหาก ห้ามใช้ปิเปตในการดูดสารเคมี PCR และผลิตภัณฑ์ที่ขยายแล้วในพื้นที่นี้ ควรเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นหรือตู้แช่แข็งที่กำหนดไว้ในพื้นที่เดียวกัน พื้นที่ทำงานตัวอย่างควรทำความสะอาดในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

หลังการทำ PCR: การขยายจำนวนและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยายจำนวนแล้ว

พื้นที่ที่กำหนดไว้นี้ใช้สำหรับกระบวนการหลังการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม และควรแยกออกจากพื้นที่ก่อนทำ PCR อย่างชัดเจน โดยปกติจะมีเครื่องเทอร์โมไซเคิลและแพลตฟอร์มแบบเรียลไทม์ และควรมีตู้ปลอดเชื้อ (laminar flow cabinet) สำหรับเติมผลิตภัณฑ์ PCR รอบที่ 1 ลงในปฏิกิริยารอบที่ 2 หากทำการ PCR แบบเนสเต็ด (nested PCR) ห้ามจับต้องสารเคมี PCR และกรดนิวคลีอิกที่สกัดแล้วในบริเวณนี้ เนื่องจากมีความเสี่ยงสูงต่อการปนเปื้อน บริเวณนี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถัง และอุปกรณ์อื่นๆ แยกต่างหาก หลอดทดลองต้องนำไปปั่นเหวี่ยงก่อนเปิด พื้นที่ทำงานตัวอย่างควรทำความสะอาดในลักษณะเดียวกับพื้นที่ผสมสารตั้งต้น (mastermix space)

หลัง PCR: การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์

ห้องนี้ใช้สำหรับอุปกรณ์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ เช่น ถังเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส ชุดจ่ายไฟ เครื่องส่องสว่างยูวี และระบบบันทึกภาพเจล บริเวณนี้ควรมีถุงมือ เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ ชั้นวางจานและหลอดทดลอง ปิเปต ปลายกรอง ถัง และอุปกรณ์อื่นๆ แยกต่างหาก ห้ามนำสารเคมีอื่นๆ เข้ามาในบริเวณนี้ ยกเว้นสีย้อมสำหรับโหลดตัวอย่าง เครื่องหมายโมเลกุล เจลอะกาโรส และส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ พื้นที่ทำงานตัวอย่างควรทำความสะอาดในลักษณะเดียวกับพื้นที่ผสมสารตั้งต้น

หมายเหตุสำคัญ

โดยหลักการแล้ว ไม่ควรเข้าห้องเตรียม PCR ในวันเดียวกันกับที่ได้ทำการตรวจในห้องหลัง PCR ไปแล้ว หากหลีกเลี่ยงไม่ได้จริงๆ ควรล้างมือให้สะอาดก่อน และสวมเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการเฉพาะในห้องนั้นๆ ห้ามนำสมุดบันทึกและเอกสารต่างๆ เข้าไปในห้องเตรียม PCR หากได้ใช้ในห้องหลัง PCR แล้ว หากจำเป็น ให้นำสำเนาเอกสารขั้นตอนการทำงาน/รหัสตัวอย่าง ฯลฯ ไปด้วย

4. คำแนะนำทั่วไปเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล

ใช้ถุงมือที่ปราศจากแป้งเพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งการทดสอบ เทคนิคการใช้ปิเปตที่ถูกต้องมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการลดการปนเปื้อน การใช้ปิเปตที่ไม่ถูกต้องอาจทำให้ของเหลวกระเด็นและเกิดละอองลอยได้ สามารถดูแนวทางปฏิบัติที่ดีสำหรับการใช้ปิเปตอย่างถูกต้องได้จากลิงก์ต่อไปนี้: คู่มือการใช้ปิเปตของ Gilson, วิดีโอเทคนิคการใช้ปิเปตของ Anachem, ปิดหลอดทดลองให้สนิทก่อนเปิด และเปิดอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการกระเด็น ปิดหลอดทดลองทันทีหลังใช้งานเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน

เมื่อทำการทดลองหลายปฏิกิริยา ควรเตรียมมาสเตอร์มิกซ์เดียวที่มีสารเคมีทั่วไป (เช่น น้ำ, dNTPs, บัฟเฟอร์, ไพรเมอร์ และเอนไซม์) เพื่อลดจำนวนการถ่ายโอนสารเคมีและลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน แนะนำให้ตั้งมาสเตอร์มิกซ์บนน้ำแข็งหรือบล็อกทำความเย็น การใช้เอนไซม์ Hot Start อาจช่วยลดการเกิดผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะเจาะจงได้ ป้องกันสารเคมีที่มีสารเรืองแสงจากแสงเพื่อหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพ

5. การควบคุมภายใน

ควรใช้ตัวควบคุมเชิงบวกและเชิงลบที่มีลักษณะเฉพาะและได้รับการยืนยันแล้ว รวมถึงตัวควบคุมที่ไม่มีแม่แบบในทุกปฏิกิริยา และเส้นแนวโน้มการไทเทรตหลายจุดสำหรับปฏิกิริยาเชิงปริมาณ ตัวควบคุมเชิงบวกไม่ควรมีความเข้มข้นสูงเกินไปจนก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อการปนเปื้อน ควรใช้ตัวควบคุมการสกัดเชิงบวกและเชิงลบเมื่อทำการสกัดกรดนิวคลีอิก

ขอแนะนำให้ติดป้ายคำแนะนำที่ชัดเจนในแต่ละพื้นที่ เพื่อให้ผู้ใช้งานทราบถึงกฎระเบียบในการใช้งาน ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยที่ตรวจพบดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอในปริมาณต่ำมากในตัวอย่างทางคลินิก อาจต้องการใช้มาตรการรักษาความปลอดภัยเพิ่มเติม โดยการติดตั้งระบบระบายอากาศแยกต่างหาก โดยให้ห้องก่อนทำ PCR มีแรงดันอากาศเป็นบวกเล็กน้อย และห้องหลังทำ PCR มีแรงดันอากาศเป็นลบเล็กน้อย

สุดท้ายนี้ การจัดทำแผนการประกันคุณภาพ (QA) เป็นสิ่งที่มีประโยชน์ แผนดังกล่าวควรประกอบด้วยรายการสต็อกสารเคมีหลักและสต็อกใช้งาน กฎสำหรับการจัดเก็บชุดทดสอบและสารเคมี การรายงานผลการควบคุม โปรแกรมการฝึกอบรมบุคลากร ขั้นตอนการแก้ไขปัญหา และมาตรการแก้ไขเมื่อจำเป็น

6. บรรณานุกรม

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. บทที่ 3: การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ qPCR เอกสารแนะนำสำหรับการทดสอบน้ำเพื่อการพักผ่อนหย่อนใจโดยใช้วิธี qPCR ของ USEPA วิธีที่ 1611 แลนซิง - มหาวิทยาลัยมิชิแกนสเตท

หน่วยงานสาธารณสุขแห่งอังกฤษ, NHS. มาตรฐานของสหราชอาณาจักรสำหรับการตรวจสอบทางจุลชีววิทยา: แนวปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการเมื่อทำการทดสอบการขยายโมเลกุล) คำแนะนำด้านคุณภาพ 2013;4(4):1–15

Mifflin T. การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

Schroeder S 2013. การบำรุงรักษาเครื่องปั่นเหวี่ยงตามปกติ: การทำความสะอาด การบำรุงรักษา และการฆ่าเชื้อเครื่องปั่นเหวี่ยง โรเตอร์ และอะแดปเตอร์ (เอกสารวิจัยฉบับที่ 14). ฮัมบูร์ก: Eppendorf; 2013.

Viana RV, Wallis CL. หลักปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการทางคลินิก (GCLP) สำหรับการทดสอบทางโมเลกุลที่ใช้ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยโรค ใน: Akyar I, บรรณาธิการ. ขอบเขตการควบคุมคุณภาพที่กว้างขวาง. ริเยกา, โครเอเชีย: Intech; 2011: 29–52.