I metodi di rilevamento molecolare hanno la capacità di produrre un grande volume di acido nucleico attraverso l'amplificazione di tracce presenti nei campioni. Se da un lato questo è vantaggioso per consentire un rilevamento sensibile, dall'altro introduce anche la possibilità di contaminazione a causa della diffusione di aerosol di amplificazione nell'ambiente di laboratorio. Durante gli esperimenti, è possibile adottare misure per evitare la contaminazione di reagenti, apparecchiature di laboratorio e superfici di lavoro, poiché tale contaminazione può generare risultati falsi positivi (o falsi negativi).
Per contribuire a ridurre la probabilità di contaminazione, è necessario attenersi sempre alle Buone Pratiche di Laboratorio. In particolare, occorre prendere precauzioni riguardo ai seguenti punti:
1. Manipolazione dei reagenti
2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature
3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato
4. Consigli generali di biologia molecolare
5. Controlli interni
6. Bibliografia
1. Manipolazione dei reagenti
Prima di aprire le provette dei reagenti, centrifugare brevemente per evitare la formazione di aerosol. Suddividere i reagenti in aliquote per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento e la contaminazione delle soluzioni madri. Etichettare e datare chiaramente tutte le provette dei reagenti e delle reazioni e tenere un registro dei numeri di lotto e di serie dei reagenti utilizzati in tutti gli esperimenti. Pipettare tutti i reagenti e i campioni utilizzando puntali con filtro. Prima dell'acquisto, si consiglia di verificare con il produttore che i puntali con filtro siano compatibili con la marca di pipetta che si intende utilizzare.
2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature
L'area di lavoro deve essere organizzata in modo da garantire che il flusso di lavoro avvenga in un'unica direzione, dalle aree pulite (pre-PCR) alle aree sporche (post-PCR). Le seguenti precauzioni generali contribuiranno a ridurre il rischio di contaminazione. Predisporre stanze separate e designate, o quantomeno aree fisicamente separate, per: la preparazione del mastermix, l'estrazione degli acidi nucleici e l'aggiunta del DNA stampo, l'amplificazione e la manipolazione del prodotto amplificato e l'analisi del prodotto, ad esempio l'elettroforesi su gel.
In alcuni contesti, disporre di 4 stanze separate risulta difficile. Un'opzione possibile, ma meno auspicabile, è quella di preparare il mastermix in un'area di contenimento, ad esempio una cappa a flusso laminare. Nel caso di amplificazione PCR annidata, la preparazione del mastermix per la reazione del secondo ciclo dovrebbe essere effettuata nell'area "pulita" dedicata alla preparazione del mastermix, mentre l'inoculazione con il prodotto della PCR primaria dovrebbe essere eseguita nella stanza di amplificazione e, se possibile, in un'area di contenimento dedicata (ad esempio una cappa a flusso laminare).
Ogni stanza/area deve essere dotata di un set separato di pipette, puntali con filtro, portaprovette, vortex, centrifughe (se presenti), penne, reagenti di laboratorio generici, camici e scatole di guanti chiaramente etichettati, che rimarranno nelle rispettive postazioni di lavoro. Le mani devono essere lavate e i guanti e i camici cambiati quando ci si sposta tra le aree designate. I reagenti e le apparecchiature non devono essere spostati da un'area sporca a un'area pulita. Qualora si verificasse un caso estremo in cui un reagente o un'apparecchiatura dovesse essere spostata nella posizione precedente, deve essere prima decontaminata con ipoclorito di sodio al 10%, seguita da una pulizia con acqua sterile.
Nota
La soluzione di ipoclorito di sodio al 10% deve essere preparata fresca ogni giorno. Quando viene utilizzata per la decontaminazione, è necessario rispettare un tempo di contatto minimo di 10 minuti.
In alternativa, se le raccomandazioni di sicurezza locali non consentono l'uso di ipoclorito di sodio o se quest'ultimo non è adatto alla decontaminazione delle parti metalliche delle apparecchiature, è possibile utilizzare prodotti commerciali validati come decontaminanti superficiali in grado di distruggere il DNA.
Idealmente, il personale dovrebbe attenersi al principio del flusso di lavoro unidirezionale e non passare dalle aree contaminate (post-PCR) alle aree pulite (pre-PCR) nello stesso giorno. Tuttavia, potrebbero esserci occasioni in cui ciò sia inevitabile. In tali circostanze, il personale deve avere cura di lavarsi accuratamente le mani, cambiare i guanti, indossare il camice da laboratorio designato e non introdurre nella stanza alcuna attrezzatura che intenda poi portare fuori, come ad esempio i quaderni di laboratorio. Tali misure di controllo dovrebbero essere enfatizzate nella formazione del personale sulle tecniche di biologia molecolare.
Dopo l'uso, le superfici di lavoro devono essere pulite con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da acqua sterile per rimuovere i residui di candeggina), etanolo al 70% o un decontaminante commerciale validato in grado di distruggere il DNA. Idealmente, si dovrebbero installare lampade a raggi ultravioletti (UV) per consentire la decontaminazione tramite irradiazione. Tuttavia, l'uso di lampade UV dovrebbe essere limitato ad aree di lavoro chiuse, ad esempio cabine di sicurezza, al fine di limitare l'esposizione del personale di laboratorio ai raggi UV. Si prega di attenersi alle istruzioni del produttore per la cura, la ventilazione e la pulizia delle lampade UV al fine di garantirne l'efficacia.
Se si utilizza etanolo al 70% al posto dell'ipoclorito di sodio, sarà necessaria l'irradiazione con luce UV per completare la decontaminazione.
Non pulire il vortex e la centrifuga con ipoclorito di sodio; invece, pulirli con etanolo al 70% ed esporli alla luce UV, oppure utilizzare un decontaminante commerciale che distrugge il DNA. In caso di fuoriuscite, consultare il produttore per ulteriori istruzioni di pulizia. Se le istruzioni del produttore lo consentono, le pipette devono essere regolarmente sterilizzate in autoclave. Se le pipette non possono essere sterilizzate in autoclave, dovrebbe essere sufficiente pulirle con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da un accurato lavaggio con acqua sterile) o con un decontaminante commerciale che distrugge il DNA seguito da esposizione ai raggi UV.
La pulizia con ipoclorito di sodio ad alta concentrazione può danneggiare a lungo andare le plastiche e i metalli delle pipette se effettuata regolarmente; si consiglia di consultare prima le raccomandazioni del produttore. Tutte le apparecchiature devono essere calibrate regolarmente secondo il programma raccomandato dal produttore. Una persona designata deve essere responsabile di garantire il rispetto del programma di calibrazione, la tenuta di registri dettagliati e l'apposizione chiara delle etichette di servizio sulle apparecchiature.
3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato
Pre-PCR: Aliquotazione dei reagenti / preparazione del mastermix: Questa dovrebbe essere l'area più pulita tra tutte quelle utilizzate per la preparazione di esperimenti molecolari e idealmente dovrebbe essere una cappa a flusso laminare dotata di lampada UV. Campioni, acidi nucleici estratti e prodotti di amplificazione PCR non devono essere manipolati in quest'area. I reagenti di amplificazione devono essere conservati in un congelatore (o in frigorifero, secondo le raccomandazioni del produttore) nella stessa area designata, idealmente accanto alla cappa a flusso laminare o all'area pre-PCR. I guanti devono essere cambiati ogni volta che si accede all'area pre-PCR o alla cappa a flusso laminare.
L'area pre-PCR o la cappa a flusso laminare devono essere pulite prima e dopo l'uso come segue: pulire tutti gli oggetti presenti nella cappa, ad esempio pipette, contenitori per puntali, vortex, centrifuga, portaprovette, penne, ecc., con etanolo al 70% o un disinfettante commerciale in grado di distruggere il DNA e lasciare asciugare. Nel caso di un'area di lavoro chiusa, ad esempio una cappa a flusso laminare, esporre la cappa alla luce UV per 30 minuti.
Nota
Non esporre i reagenti alla luce UV; riporli nell'armadio solo dopo averlo pulito. Se si esegue una PCR a trascrizione inversa, può essere utile pulire le superfici e le apparecchiature con una soluzione che degrada le RNasi al contatto. Questo può aiutare a evitare risultati falsi negativi dovuti alla degradazione enzimatica dell'RNA. Dopo la decontaminazione e prima di preparare il mastermix, è necessario cambiare nuovamente i guanti; a quel punto l'armadio è pronto per l'uso.
Pre-PCR: Estrazione degli acidi nucleici/aggiunta del template:
L'acido nucleico deve essere estratto e manipolato in una seconda area designata, utilizzando un set separato di pipette, puntali con filtro, portaprovette, guanti nuovi, camici da laboratorio e altre attrezzature. Quest'area è destinata anche all'aggiunta di template, controlli e linee di tendenza alle provette o alle piastre del mastermix. Per evitare la contaminazione dei campioni di acido nucleico estratti che vengono analizzati, si raccomanda di cambiare i guanti prima di manipolare i controlli positivi o gli standard e di utilizzare un set separato di pipette. I reagenti per PCR e i prodotti amplificati non devono essere pipettati in quest'area. I campioni devono essere conservati in frigoriferi o congelatori dedicati nella stessa area. L'area di lavoro dei campioni deve essere pulita nello stesso modo dell'area del mastermix.
Post-PCR: Amplificazione e manipolazione del prodotto amplificato
Questo spazio designato è destinato ai processi di post-amplificazione e deve essere fisicamente separato dalle aree di pre-PCR. Solitamente contiene termociclatori e piattaforme per PCR in tempo reale e, idealmente, dovrebbe essere dotato di una cappa a flusso laminare per aggiungere il prodotto della PCR del primo ciclo alla reazione del secondo ciclo, qualora si stia eseguendo una PCR annidata. I reagenti per PCR e gli acidi nucleici estratti non devono essere manipolati in quest'area, poiché il rischio di contaminazione è elevato. Quest'area deve essere dotata di un set separato di guanti, camici da laboratorio, portapiastre e portaprovette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature. Le provette devono essere centrifugate prima dell'apertura. L'area di lavoro dei campioni deve essere pulita allo stesso modo dell'area del mastermix.
Post-PCR: Analisi del prodotto
Questa stanza è destinata alle apparecchiature per il rilevamento del prodotto, ad esempio vasche per elettroforesi su gel, alimentatori, transilluminatore UV e sistema di documentazione del gel. Quest'area deve essere dotata di set separati di guanti, camici da laboratorio, portapiastre e portaprovette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature. Non è consentito introdurre in quest'area altri reagenti, ad eccezione del colorante di caricamento, del marcatore molecolare, del gel di agarosio e dei componenti del tampone. L'area di lavoro per i campioni deve essere pulita nello stesso modo dell'area per il mastermix.
Nota importante
Idealmente, non si dovrebbe accedere alle stanze pre-PCR lo stesso giorno in cui si è già lavorato nelle stanze post-PCR. Se ciò è assolutamente inevitabile, assicurarsi di lavarsi accuratamente le mani e di indossare camici da laboratorio specifici all'interno delle stanze. Non portare nelle stanze pre-PCR libri e documenti di laboratorio se sono stati utilizzati nelle stanze post-PCR; se necessario, portare copie stampate di protocolli/identificativi dei campioni, ecc.
4. Consigli generali di biologia molecolare
Utilizzare guanti senza polvere per evitare l'inibizione del test. Una corretta tecnica di pipettaggio è fondamentale per ridurre la contaminazione. Un pipettaggio scorretto può causare schizzi durante l'erogazione di liquidi e la formazione di aerosol. Le buone pratiche per un corretto pipettaggio sono disponibili ai seguenti link: Guida al pipettaggio Gilson, Video sulle tecniche di pipettaggio Anachem. Centrifugare le provette prima dell'apertura e aprirle con cautela per evitare schizzi. Chiudere immediatamente le provette dopo l'uso per evitare l'introduzione di contaminanti.
Quando si eseguono più reazioni, preparare un mastermix contenente i reagenti comuni (ad esempio acqua, dNTP, tampone, primer ed enzima) per ridurre al minimo il numero di trasferimenti di reagenti e il rischio di contaminazione. Si consiglia di preparare il mastermix su ghiaccio o su un blocco refrigerante. L'utilizzo di un enzima Hot Start può contribuire a ridurre la produzione di prodotti non specifici. Proteggere i reagenti contenenti sonde fluorescenti dalla luce per evitare la degradazione.
5. Controlli interni
Includere controlli positivi e negativi ben caratterizzati e confermati, insieme a un controllo senza stampo in tutte le reazioni e una linea di tendenza titolata a più punti per le reazioni quantitative. Il controllo positivo non deve essere così forte da rappresentare un rischio di contaminazione. Includere controlli di estrazione positivi e negativi quando si esegue l'estrazione di acidi nucleici.
Si raccomanda di affiggere istruzioni chiare in ciascuna area in modo che gli utenti siano a conoscenza delle regole di condotta. I laboratori di diagnostica che rilevano livelli molto bassi di DNA o RNA in campioni clinici potrebbero voler adottare l'ulteriore misura di sicurezza di disporre di sistemi di trattamento dell'aria separati con una pressione dell'aria leggermente positiva nelle sale pre-PCR e una pressione dell'aria leggermente negativa nelle sale post-PCR.
Infine, è utile sviluppare un piano di garanzia della qualità (QA). Tale piano dovrebbe includere elenchi delle scorte principali e delle scorte di lavoro dei reagenti, regole per la conservazione dei kit e dei reagenti, la segnalazione dei risultati dei controlli, programmi di formazione del personale, algoritmi per la risoluzione dei problemi e azioni correttive da intraprendere quando necessario.
6. Bibliografia
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Viana RV, Wallis CL. Buone pratiche di laboratorio clinico (GCLP) per i test molecolari utilizzati nei laboratori diagnostici, In: Akyar I, editore. Ampio spettro del controllo di qualità. Rijeka, Croazia: Intech; 2011: 29–52.
Data di pubblicazione: 16 luglio 2020
