Hababka ogaanshaha molecular-ka waxay awood u leeyihiin inay soo saaraan mug weyn oo ah asiidhka nukliyeer iyada oo loo marayo kordhinta tirada raadadka laga helo muunadaha. In kasta oo tani ay faa'iido u leedahay awood u siinta ogaanshaha xasaasiga ah, haddana waxay sidoo kale soo bandhigaysaa suurtagalnimada wasakhowga iyada oo loo marayo faafinta aerosols-ka kor u qaadista jawiga shaybaarka. Marka la sameynayo tijaabooyin, tallaabooyin ayaa la qaadi karaa si looga fogaado wasakhowga walxaha, qalabka shaybaarka iyo booska kursiga keydka, maadaama wasakhowgaasi uu keeni karo natiijooyin been-abuur ah (ama been-diidmo).
Si loo yareeyo suurtagalnimada wasakhowga, waa in la sameeyaa Dhaqanka Shaybaarka Wanaagsan mar walba. Gaar ahaan, taxaddarrada waa in laga qaadaa qodobbada soo socda:
1. Maareynta walxaha firfircoon
2. Abaabulka goobta shaqada iyo qalabka
3. Talada isticmaalka iyo nadiifinta ee booska molecular-ka ee loo qoondeeyay
4. Talada guud ee bayoolajiga molecular-ka
5. Kontaroolada gudaha
6. Buug-gacmeedka
1. Maareynta walxaha firfircoon
Si kooban u dhex geli tuubooyinka falgalka ka hor inta aadan furin si aad uga fogaato soo saarista aerosols-ka. Kala saar falgalka si aad uga fogaato barafowga badan iyo wasakhowga kaydka ugu weyn. Si cad u calaamadee oo taariikhda u qor dhammaan tuubooyinka falgalka iyo falgalka oo ilaali diiwaannada tirada falgalka iyo lambarrada dufcadda ee loo isticmaalay dhammaan tijaabooyinka. Dhammaan falgalka iyo muunadaha Pipette-ka iyadoo la adeegsanayo talooyinka shaandhada. Kahor intaadan iibsan, waxaa lagugula talinayaa inaad la xaqiijiso soo saaraha in talooyinka shaandhada ay ku habboon yihiin nooca pipette-ka la isticmaalayo.
2. Abaabulka goobta shaqada iyo qalabka
Goobaha shaqada waa in la habeeyaa si loo hubiyo in socodka shaqadu uu hal jiho u socdo, laga bilaabo meelaha nadiifka ah (kahor PCR) ilaa meelaha wasakhaysan (kadib PCR). Taxaddarrada guud ee soo socota ayaa kaa caawin doonta yareynta fursadda wasakhaynta. Yeelo qolal gaar ah oo loo qoondeeyay, ama ugu yaraan meelo gaar ah oo jireed, oo loogu talagalay: diyaarinta mastermix, soo saarista aashitada nucleic iyo ku darista shaxanka DNA, kordhinta iyo maaraynta badeecada la xoojiyay, iyo falanqaynta badeecada, tusaale ahaan electrophoresis-ka jel.
Meelaha qaar, helitaanka 4 qol oo kala duwan waa adag tahay. Ikhtiyaar suurtagal ah laakiin aan la jeclayn waa in lagu sameeyo diyaarinta mastermix-ka meel lagu hayo, tusaale ahaan golaha socodka laminar. Haddii ay dhacdo kor u qaadista PCR ee buulka ku jirta, diyaarinta mastermix-ka ee falcelinta wareegga labaad waa in lagu diyaariyaa aagga 'nadiif' si loogu diyaariyo mastermix-ka, laakiin tallaalka badeecada PCR-ka ee aasaasiga ah waa in lagu sameeyaa qolka kor u qaadista, haddii ay suurtogal tahayna meel loogu talagalay meel lagu hayo (tusaale ahaan golaha socodka laminar).
Qol/goob kasta wuxuu u baahan yahay qalab gaar ah oo ah tuubooyin si cad loo calaamadeeyay, talooyinka shaandhada, meelaha tuubooyinka lagu xiro, vortexes, centrifuges (haddii ay khuseyso), qalimaan, walxaha shaybaadhka guud, jaakadaha shaybaadhka iyo sanduuqyada galoofyada oo ku sii jiri doona goobahooda shaqada. Gacmaha waa in la dhaqo oo galoofyada iyo jaakadaha shaybaadhka la beddelo marka loo kala guurayo meelaha loo qoondeeyay. Waxyaabaha shaybaadhka iyo qalabka waa in aan laga qaadin meel wasakh ah una wareejin meel nadiif ah. Haddii ay dhacdo xaalad aad u daran oo ah in qalab ama qalab dib loogu celiyo, marka hore waa in lagu nadiifiyaa 10% sodium hypochlorite, ka dibna lagu tirtiraa biyo nadiif ah.
Fiiro gaar ah
Xalka 10% sodium hypochlorite waa in la sameeyaa maalin kasta cusub. Marka loo isticmaalo nadiifinta sunta, waa in la raaco waqtiga ugu yar ee taabashada oo ah 10 daqiiqo.
Haddii kale, alaabada ganacsiga laga heli karo ee loo xaqiijiyay inay yihiin nadiifiyeyaasha dusha sare ee burburiya DNA-da ayaa la isticmaali karaa haddii talooyinka badbaadada maxalliga ahi aysan oggolaanayn isticmaalka sodium hypochlorite ama haddii sodium hypochlorite aysan ku habboonayn in lagu nadiifiyo qaybaha birta ah ee qalabka.
Sida ugu habboon, shaqaaluhu waa inay raacaan hab-dhaqanka socodka shaqada ee hal-dhinac ah oo aysan ka bixin meelaha wasakhaysan (ka dib PCR) una laaban meelaha nadiifka ah (ka hor PCR) isla maalintaas. Si kastaba ha ahaatee, waxaa jiri kara waqtiyo ay tani tahay mid aan laga fursan karin. Marka ay dhacdo munaasabad noocaas ah, shaqaaluhu waa inay taxaddaraan inay si fiican gacmaha u dhaqaan, beddelaan galoofyada, isticmaalaan jaakadda shaybaarka ee loo qoondeeyay oo aysan soo bandhigin wax qalab ah oo ay rabaan inay mar kale ka saaraan qolka, sida buugaagta shaybaarka. Tallaabooyinka xakamaynta noocaas ah waa in lagu xoojiyaa tababarka shaqaalaha ee hababka molecular-ka.
Ka dib isticmaalka, meelaha fadhiga waa in lagu nadiifiyaa 10% sodium hypochlorite (oo ay ku xigto biyo nadiif ah si looga saaro warankiilada harsan), 70% ethanol, ama sun-saare DNA ah oo ganacsi ahaan la xaqiijiyay. Sida ugu habboon, nalalka UV-violet (UV) waa in lagu rakibaa si loo suuliyo wasakhda iyadoo la adeegsanayo shucaac. Si kastaba ha ahaatee, isticmaalka nalalka UV waa in lagu koobo meelaha shaqada ee xiran, tusaale ahaan armaajooyinka badbaadada, si loo xaddido soo-gaadhista UV ee shaqaalaha shaybaarka. Fadlan raac tilmaamaha soo saaraha ee daryeelka nalalka UV, hawo-qaadista iyo nadiifinta si loo hubiyo in nalalka ay waxtar leeyihiin.
Haddii aad isticmaaleyso 70% ethanol halkii aad ka isticmaali lahayd sodium hypochlorite, waxaa loo baahan doonaa shucaac leh iftiin UV si loo dhammaystiro nadiifinta.
Ha ku nadiifin vortex-ka iyo centrifuge-ka sodium hypochlorite; taa beddelkeeda, ku tirtir 70% ethanol oo u bandhig iftiinka UV, ama isticmaal nadiifiye DNA-da ganacsiga baabi'iya. Wixii daadanaya, la xiriir soo saaraha si aad u hesho talo dheeraad ah oo nadiifin ah. Haddii tilmaamaha soo saaraha ay oggolaadaan, tuubooyinka waa in si joogto ah loogu nadiifiyaa autoclave. Haddii tuubooyinka aan la isku dhejin karin, waa inay ku filan tahay in lagu nadiifiyo 10% sodium hypochlorite (oo ay ku xigto tirtirid dhammaystiran oo biyo nadiif ah) ama nadiifiye DNA-da ganacsiga burburiya oo ay ku xigto soo-gaadhista UV.
Nadiifinta iyadoo la isticmaalayo sodium hypochlorite oo boqolkiiba sare leh waxay ugu dambeyntii dhaawici kartaa balaastikada iyo biraha tuubada haddii si joogto ah loo sameeyo; hubi talooyinka soo saaraha marka hore. Dhammaan qalabka waa in si joogto ah loo hagaajiyaa iyadoo loo eegayo jadwalka uu soo saaraha ku taliyay. Qof loo xilsaaray waa inuu mas'uul ka ahaadaa hubinta in jadwalka cabbiraadda la raaco, la ilaaliyo diiwaanka faahfaahsan, iyo calaamadaha adeegga si cad loogu soo bandhigo qalabka.
3. Talada isticmaalka iyo nadiifinta ee booska molecular-ka ee loo qoondeeyay
PCR-ka Hore: Diyaarinta isku-darka reagent-ka/mastermix-ka: Kani waa inuu noqdaa kan ugu nadiifsan dhammaan meelaha loo isticmaalo diyaarinta tijaabooyinka molecular-ka waana inuu ahaadaa gole loogu talagalay socodka laminar oo ku qalabaysan nalka UV. Muunadaha, asiidhka nucleic-ga ee la soo saaray iyo alaabada PCR ee la ballaariyay waa in aan lagu maamulin aaggan. Waxyaabaha kiciya cod-weynaynta waa in lagu hayaa qaboojiye (ama qaboojiye, sida ku xusan talooyinka soo saaraha) isla meesha loo qoondeeyay, ugu fiican meel u dhow godadka socodka laminar ama aagga PCR-ka kahor. Gacmo-gashiga waa in la beddelaa mar kasta marka la galo aagga PCR-ka kahor ama godadka socodka laminar.
Aagga PCR-ka ka hor ama golaha socodka laminar waa in la nadiifiyaa ka hor iyo ka dib isticmaalka sida soo socota: Ku masax dhammaan walxaha ku jira golaha, tusaale ahaan tuubooyinka, sanduuqyada caarada, vortex, centrifuge, raafka tuubada, qalimaan, iwm. oo leh 70% ethanol ama nadiifiye DNA-da ganacsiga baabi'iya, oo u daa inay qalasho. Haddii ay jirto meel shaqo oo xiran, tusaale ahaan golaha socodka laminar, daboolka u dhig nalka UV muddo 30 daqiiqo ah.
Fiiro gaar ah
Ha u bandhigin walxaha firfircoon iftiinka UV; kaliya ku rid khaanadda marka uu nadiif noqdo. Haddii aad samaynayso PCR-ka dib-u-qorista, waxa kale oo ay waxtar yeelan kartaa in lagu tirtiro dusha sare iyo qalabka xal jebiya RNAse-ka marka ay taabtaan. Tani waxay kaa caawin kartaa inaad ka fogaato natiijooyinka beenta ah ee ka dhasha burburka ensaymka ee RNA. Ka dib marka la nadiifiyo iyo ka hor inta aan la diyaarin isku-darka weyn, galoofyada waa in mar kale la beddelaa, ka dibna khaanadda waa diyaar in la isticmaalo.
PCR-ka Hore: Soo saarista/ku darista shaxanka Nukliyeerka:
Asiidhka Nukliyeerka waa in laga soo saaraa oo lagu maareeyaa meel labaad oo loo qoondeeyay, iyadoo la isticmaalayo tuubooyin gooni ah, talooyin shaandho, raafka tuubooyinka, galoofisyo cusub, jaakado shaybaar iyo qalab kale. Aaggan sidoo kale waxaa loogu talagalay in lagu daro qaab-dhismeedka, kontaroolada iyo khadadka isbeddelka tuubooyinka ama saxannada mastermix. Si looga fogaado wasakheynta muunadaha asiidhka nukliyeerka ee la falanqeynayo, waxaa lagu talinayaa in la beddelo galoofisyada ka hor inta aan la qaban xakamaynta ama heerarka togan iyo in la isticmaalo xirmo gaar ah oo tuubooyin ah. Waxyaabaha PCR-ga iyo alaabada la xoojiyay waa in aan lagu dhejin tuubooyinka aaggan. Muunadaha waa in lagu kaydiyaa qaboojiyeyaal ama qaboojiyeyaal loogu talagalay isla aagga. Goobta shaqada ee muunadda waa in loo nadiifiyaa si la mid ah booska isku-darka mastermix.
PCR-ka Kadib: Ballaarinta iyo maaraynta badeecada la ballaariyay
Meeshan loo qoondeeyay waa mid loogu talagalay hababka ka dambeeya kor u qaadista waana inay si jidh ahaan ah uga go'an tahay meelaha ka horreeya PCR. Badanaa waxay ka kooban tahay thermocyclers iyo goobaha waqtiga-dhabta ah, waana inay lahaataa khaanad socod laminar ah si loogu daro badeecada wareega 1aad ee PCR falcelinta wareega 2aad, haddii PCR-ga la sameeyay. Waxyaabaha PCR-ga iyo asiidhka nucleic-ga ee la soo saaray waa inaan lagu maareyn aaggan maadaama khatarta wasakhowga ay sarreyso. Meeshani waa inay lahaataa galoofisyo gooni ah, jaakado shaybaar, raafka saxanka iyo tuubada, tuubooyinka, talooyinka shaandhada, qashinka iyo qalab kale. Tuubooyinka waa in la simi karaa ka hor inta aan la furin. Goobta shaqada ee muunadda waa in la nadiifiyaa si la mid ah meesha mastermix-ka.
PCR-ka Kadib: Falanqaynta Badeecada
Qolkan waxaa loogu talagalay qalabka ogaanshaha badeecadaha, tusaale ahaan taangiyada jelka electrophoresis, xirmooyinka korontada, transilluminator-ka UV iyo nidaamka dukumeentiga jelka. Aaggani waa inuu lahaadaa galoofisyo gooni ah, jaakado shaybaar, raafka saxanka iyo tuubada, tuubooyinka, talooyinka shaandhada, qashinka iyo qalabka kale. Ma jiraan wax kale oo reagents ah oo la keeni karo aaggan, marka laga reebo rinjiga rarista, calaamadeeyaha molecular iyo gel agarose, iyo qaybaha kaydka. Goobta shaqada ee muunadda waa in loo nadiifiyaa si la mid ah booska mastermix-ka.
Qoraal muhiim ah
Waxaa habboon in qolalka ka horreeya PCR aan la gelin isla maalintaas haddii shaqada hore loogu qabtay qolalka ka dambeeya PCR. Haddii tani ay gebi ahaanba lama huraan tahay, hubi in marka hore gacmaha si fiican loo dhaqo oo jaakadaha shaybaarka gaarka ah lagu xidho qolalka. Buugaagta shaybaarka iyo waraaqaha waa in aan la gelin qolalka ka horreeya PCR haddii loo isticmaalay qolalka ka dambeeya PCR; haddii loo baahdo, qaado daabacaado nuqul ah oo ah borotokoollada/aqoonsiyada muunadda, iwm.
4. Talada guud ee bayoolajiga molecular-ka
Isticmaal galoofisyo aan budada lahayn si aad uga fogaato joojinta tijaabada. Farsamada saxda ah ee tuubooyinka ayaa ugu muhiimsan yareynta wasakhowga. Tuubooyinka khaldan waxay keeni karaan in la daadiyo marka la shubayo dareeraha iyo abuurista aerosols. Dhaqanka wanaagsan ee tuubooyinka saxda ah waxaa laga heli karaa xiriiriyahan soo socda: Tilmaamaha Gilson ee tuubooyinka, fiidiyowyada farsamada tuubooyinka Anachem, tuubooyinka Centrifuge ka hor inta aan la furin, oo si taxaddar leh u fur si looga fogaado in la daadiyo. Xidh tuubooyinka isla markiiba ka dib isticmaalka si looga fogaado soo bandhigida wasakhowga.
Markaad samaynayso falgallo badan, diyaari hal mastermix oo ka kooban reagents caadi ah (tusaale ahaan biyo, dNTPs, buffer, primers iyo enzyme) si loo yareeyo tirada wareejinta reagents-ka loona yareeyo khatarta wasakhowga. Waxaa lagu talinayaa in mastermix-ka lagu rakibo baraf ama baloog qabow. Isticmaalka ensaymka Hot Start wuxuu kaa caawin karaa yareynta soo saarista alaabada aan gaarka ahayn. Ka ilaali reagents-ka ka kooban fluorescent probes iftiinka si looga fogaado burburka.
5. Kontaroolada gudaha
Ku dar kontaroolo si fiican loo yaqaan, oo la xaqiijiyay oo togan iyo kuwa taban, oo ay weheliso xakameyn aan shax lahayn dhammaan falcelinnada, iyo xariiq isbeddel oo leh titrated badan oo loogu talagalay falcelinta tirada. Xakamaynta togan waa inaysan noqon mid aad u xoog badan oo keenta khatar wasakh ah. Ku dar kontaroolada soo saarista togan iyo kuwa taban marka la samaynayo soo saarista aashitada nukliyeer.
Waxaa lagu talinayaa in tilmaamo cad lagu dhejiyo mid kasta oo ka mid ah meelaha si dadka isticmaala ay uga warqabaan xeerarka dhaqanka. Shaybaarrada ogaanshaha ee ogaanaya heerarka aadka u hooseeya ee DNA ama RNA ee muunadaha kiliinikada ayaa laga yaabaa inay rabaan inay qaataan cabbir amni oo dheeraad ah oo ah inay yeeshaan nidaamyo hawo oo kala duwan oo leh cadaadis hawo oo yar oo togan oo ku jira qolalka ka hor PCR iyo cadaadis hawo oo yar oo taban oo ku jira qolalka ka dib PCR.
Ugu dambeyntii, sameynta qorshaha hubinta tayada (QA) waa mid waxtar leh. Qorshaha noocaas ah waa inuu ku jiraa liisaska kaydka ugu weyn ee reagent-ka iyo kaydka shaqada, xeerarka kaydinta qalabka iyo reagent-ka, warbixinta natiijooyinka xakamaynta, barnaamijyada tababarka shaqaalaha, algorithms-ka xallinta dhibaatooyinka, iyo tallaabooyinka hagaajinta marka loo baahdo.
6. Buug-gacmeedka
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Cutubka 3aad: Dejinta shaybaar qPCR ah. Dukumenti hagitaan ah oo loogu talagalay tijaabinta biyaha madadaalada iyadoo la adeegsanayo habka USEPA qPCR 1611. Lansing- Jaamacadda Gobolka Michigan.
Caafimaadka Dadweynaha England, NHS. Heerarka UK ee baaritaannada microbiology: Dhaqanka Shaybaarka Wanaagsan marka la samaynayo tijaabooyinka kor u qaadista molecular-ka). Tilmaamaha Tayada. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Dejinta shaybaarka PCR. Protoc-ga Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Dayactirka joogtada ah ee centrifuges-ka: nadiifinta, dayactirka iyo jeermiska centrifuges-ka, rotor-ka iyo adapter-yada (Warqadda Cad ee Lambarka 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dhaqan Shaybaar oo Caafimaad oo Wanaagsan (GCLP) oo loogu talagalay tijaabooyinka ku salaysan molecular-ka ee loo isticmaalo shaybaarrada ogaanshaha, In: Akyar I, tifaftire. Muuqaal ballaaran oo ku saabsan xakamaynta tayada. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Waqtiga boostada: Luulyo-16-2020
