Usoro nchọpụta molekul nwere ike imepụta nnukwu olu nke nucleic acid site na mmụba nke ọnụọgụ ihe ndị dị na sample. Ọ bụ ezie na nke a bara uru maka ime ka nchọpụta dị nro, ọ na-ewebatakwa ohere nke mmetọ site na mgbasa nke aerosols amplification na gburugburu ụlọ nyocha. Mgbe a na-eme nnwale, enwere ike ime ihe iji zere mmetọ nke reagents, akụrụngwa ụlọ nyocha na oghere bench, n'ihi na mmetọ dị otú ahụ nwere ike ịkpata nsonaazụ ụgha-positive (ma ọ bụ ụgha-negative).
Iji belata ohere nke mmetọ, a ga-eme ihe omume Good Laboratory Practice oge niile. Karịsịa, a ga-akpachara anya gbasara ihe ndị a:
1. Ijikwa ihe ndị na-eme ihe
2. Nhazi nke ebe ọrụ na akụrụngwa
3. Ndụmọdụ maka ojiji na nhicha maka oghere molekul akọwapụtara
4. Ndụmọdụ gbasara bayoloji nke molekụla izugbe
5. Njikwa dị n'ime
6. Ndekọ Akwụkwọ
1. Ijikwa ihe ndị na-eme ihe
Jiri obere centrifuge tụnye ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya tupu e mepee ya iji zere imepụta ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya ghara ịpụta ìhè. Hazie ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya iji zere ọtụtụ ihe ndị na-eme ka ọ gbazee ma mee ka ihe ndị dị n'ime ya ghara ịdị mma. Dee akara na tube ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya na ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya dị ọcha ma debe ndekọ nke ọnụọgụ ihe ndị e ji mee ihe na nnwale niile. Pipette niile ihe ndị na-eme ka ihe dị n'ime ya na ihe nlele ya na-eji ntụ ntụ nzacha. Tupu ịzụta ya, ọ dị mma ka ị gwa onye nrụpụta na ntụ ntụ nzacha ahụ na-adabara ụdị pipette a ga-eji.
2. Nhazi nke ebe ọrụ na akụrụngwa
A ga-ahazi ebe ọrụ iji hụ na usoro ọrụ ahụ na-aga n'otu ụzọ, site na ebe dị ọcha (tupu PCR) ruo ebe ruru unyi (mgbe PCR gasịrị). Ihe ndị a ga-enyere aka belata ohere nke mmetọ. Nwee ụlọ dị iche iche, ma ọ bụ ma ọ dịkarịa ala ebe dị iche iche, maka: nkwadebe mastermix, mwepụta nucleic acid na itinye template DNA, mmụba na njikwa nke ngwaahịa agbakwunyere, na nyocha ngwaahịa, dịka ọmụmaatụ gel electrophoresis.
N'ebe ụfọdụ, ọ na-esiri ike inwe ụlọ anọ dị iche iche. Nhọrọ o kwere omume mana nke na-adịghị mma bụ ime nkwadebe mastermix n'ebe a na-echekwa ihe, dịka ọmụmaatụ kabinet laminar flow. N'ihe gbasara mmụba PCR a kpọchiri akpọchi, nkwadebe nke mastermix maka mmeghachi omume agba nke abụọ kwesịrị ịdị n'ebe dị ọcha maka nkwadebe mastermix, mana a ga-etinye ọgwụ PCR mbụ n'ime ụlọ mmụba ihe, ọ bụrụkwa na o kwere omume n'ebe a na-echekwa ihe (dịka ọmụmaatụ kabinet laminar flow).
Ụlọ/ebe ọ bụla chọrọ otu ngwugwu dị iche iche nke pipettes e dere nke ọma, ntụ ntụ nzacha, racks tube, vortexes, centrifuges (ọ bụrụ na ọ dị mkpa), pen, ihe ndị na-eme nyocha ụlọ nyocha, mkpuchi ụlọ nyocha na igbe uwe aka nke ga-anọgide n'ebe ọrụ ha dị iche iche. A ga-asa aka ma gbanwee uwe aka na mkpuchi ụlọ nyocha mgbe a na-agagharị n'etiti ebe a họpụtara. Ekwesighi ibugharị ihe ndị na-eme ka ihe dị nro na akụrụngwa site na ebe ruru unyi gaa ebe dị ọcha. Ọ bụrụ na ikpe dị oke njọ ebilite ebe a chọrọ ibugharị ihe ma ọ bụ ngwa azụ, a ga-ebu ụzọ kpochapụ ya na 10% sodium hypochlorite, wee jiri mmiri dị ọcha hichaa ya.
Ihe ndetu
A ga-emerịrị ihe ngwọta sodium hypochlorite nke 10% dị ọhụrụ kwa ụbọchị. Mgbe ejiri ya mee ihe maka iwepụ ihe ndị na-emerụ ahụ, a ga-agbaso oge kacha nta nke nkeji iri.
N'aka nke ọzọ, enwere ike iji ngwaahịa ndị a na-ere ahịa nke a kwadoro dị ka ihe na-ebibi ihe ndị na-ebibi DNA ma ọ bụrụ na ndụmọdụ nchekwa mpaghara anaghị ekwe ka e jiri sodium hypochlorite ma ọ bụ ọ bụrụ na sodium hypochlorite adịghị mma maka iwepụ akụkụ ígwè nke akụrụngwa.
N'ụzọ kwesịrị ekwesị, ndị ọrụ kwesịrị ịgbaso ụkpụrụ ọrụ otu ụzọ ma ghara isi n'ebe ruru unyi (mgbe PCR gasịrị) laghachi ebe dị ọcha (tupu PCR) n'otu ụbọchị ahụ. Agbanyeghị, enwere ike inwe oge mgbe nke a agaghị ekwe omume. Mgbe ihe dị otú ahụ mere, ndị ọrụ ga-akpachara anya ịsa aka nke ọma, gbanwee uwe aka, jiri uwe ụlọ nyocha akọwapụtara ma ghara itinye ngwa ọ bụla ha ga-achọ iwepụ n'ime ụlọ ọzọ, dị ka akwụkwọ ụlọ nyocha. A ga-emesi usoro njikwa dị otú ahụ ike n'ọzụzụ ndị ọrụ na usoro molekul.
Mgbe ejiri ya, a ga-eji 10% sodium hypochlorite hichaa oghere oche (site na mmiri dị ọcha iji wepụ ihe fọdụrụ), ethanol 70%, ma ọ bụ ihe na-ebibi ihe nke na-ebibi DNA nke dị n'ahịa. Ọ kacha mma, a ga-etinye oriọna ultraviolet (UV) iji mee ka ọ dị ọcha site na radieshon. Agbanyeghị, ojiji nke oriọna UV kwesịrị ịbụ naanị ebe ọrụ mechiri emechi, dịka ọmụmaatụ kabọd nchekwa, iji belata ikpughe UV nke ndị ọrụ ụlọ nyocha. Biko soro ntuziaka ndị nrụpụta maka nlekọta oriọna UV, ikuku na nhicha iji hụ na oriọna ahụ ka dị irè.
Ọ bụrụ na ị na-eji ethanol 70% kama sodium hypochlorite, ọ ga-adị mkpa ka e jiri ìhè UV mee ka ọ dị ọcha.
Ejila sodium hypochlorite hichaa vortex na centrifuge ahụ; kama, jiri ethanol 70% hichaa ya ma kpughee ya na ọkụ UV, ma ọ bụ jiri ihe na-ebibi DNA azụmaahịa. Maka ihe ndị na-awụfu, gakwuru onye nrụpụta maka ndụmọdụ ọzọ gbasara nhicha. Ọ bụrụ na ntuziaka onye nrụpụta kwere ya, a ga-eji autoclave na-eme ka pipettes dị ọcha mgbe niile. Ọ bụrụ na enweghị ike ịgbapụ pipettes, o zuru ezu iji sodium hypochlorite 10% hichaa ha (site na iji mmiri dị ọcha tee ha) ma ọ bụ jiri ihe na-ebibi DNA azụmaahịa tee ha wee kpughee ha na UV.
Nhicha site na iji sodium hypochlorite dị elu nwere ike imebi plastik na ọla pipette ma ọ bụrụ na eme ya mgbe niile; lelee ndụmọdụ sitere n'aka onye nrụpụta mbụ. A ga-enwerịrị nhazi akụrụngwa niile mgbe niile dịka usoro nhazi nke onye nrụpụta kwadoro si dị. Onye a họpụtara kwesịrị ịbụ onye na-ahụ maka ịhụ na a na-agbaso usoro nhazi ahụ, na-edobe ndekọ zuru ezu, na-egosikwa akara ọrụ nke ọma na akụrụngwa ahụ.
3. Ndụmọdụ maka ojiji na nhicha maka oghere molekul akọwapụtara
Tupu PCR: Nhazi nke reagent/mastermix: Nke a kwesịrị ịbụ ebe kachasị ọcha n'ime oghere niile eji eme nkwadebe nke nnwale molekul, ọ ga-abụkwa kabinet laminar nke e kenyere akara nke nwere ọkụ UV. A gaghị ejikwa ihe nlele, nucleic acid ewepụtara na ngwaahịa PCR agbakwunyere n'ebe a. A ga-edebe ihe ndị na-eme ka a ...
A ga-ehicha ebe PCR ma ọ bụ kabọd mmiri laminar dị tupu e jiri ya na mgbe e jiri ya dịka ndị a: Hichaa ihe niile dị na kabọd ahụ, dịka ọmụmaatụ pipettes, igbe dị n'akụkụ, vortex, centrifuge, racks tube, pen, wdg. na 70% ethanol ma ọ bụ ihe na-emebi ihe DNA nke azụmahịa, ma hapụ ya ka ọ kpọọ nkụ. Ọ bụrụ na ebe ọrụ mechiri emechi, dịka ọmụmaatụ kabọd mmiri laminar, tinye mkpuchi ahụ na ọkụ UV maka nkeji iri atọ.
Ihe ndetu
Ekpughela ihe ndị na-emepụta ihe na-enye ọkụ UV; naanị bufee ha n'ime kabinet ozugbo ọ dị ọcha. Ọ bụrụ na ị na-eme PCR ntụgharị azụ, ọ nwekwara ike ịba uru iji ihe ngwọta nke na-agbaji RNAse mgbe ọ bụla e metụrụ aka hichaa elu na akụrụngwa. Nke a nwere ike inyere aka izere nsonaazụ ụgha na-adịghị mma site na mmebi enzyme nke RNA. Mgbe e mechara nhicha ahụ na tupu ịkwadebe mastermix, a ga-agbanwe uwe aka ọzọ, wee dị njikere iji kabinet ahụ.
Tupu PCR: Mwepụta/mgbakwunye ndebiri Nucleic acid:
A ga-ewepụta ma jikwaa Nucleic acid n'ebe nke abụọ a họpụtara, site na iji otu pipette dị iche, ntụ ntụ nzacha, ihe nchekwa tube, uwe aka ọhụrụ, uwe nyocha na ngwa ndị ọzọ. Ebe a bụkwa maka ịgbakwunye template, njikwa na usoro na tube mastermix ma ọ bụ efere. Iji zere mmetọ nke ihe nlele nucleic acid ewepụtara nke a na-enyocha, a na-atụ aro ka ị gbanwee uwe aka tupu ijikwa njikwa ma ọ bụ ụkpụrụ dị mma ma jiri otu pipette dị iche. Ekwesighi itinye ihe ndị na-emepụta PCR na ngwaahịa ndị a na-eme ka ha dịkwuo mma n'ebe a. A ga-echekwa ihe nlele na friji ma ọ bụ friza akọwapụtara n'otu ebe ahụ. A ga-ehicha ebe ọrụ nlele ahụ n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.
Post-PCR: Mmụba na njikwa nke ngwaahịa a mụbara
Ebe a kapịrị ọnụ bụ maka usoro mgbe emechara PCR, ọ kwesịkwara ịdị iche na mpaghara tupu PCR. Ọ na-enwekarị thermocyclers na ikpo okwu oge, ọ kacha mma inwe kabinet mmiri laminar maka itinye ngwaahịa PCR gburugburu 1 na mmeghachi omume gburugburu 2, ọ bụrụ na a na-eme PCR a kpọkọtara ọnụ. Agaghị ejikwa ihe ndị na-emepụta PCR na nucleic acid ewepụtara n'ebe a ebe ọ bụ na ihe egwu nke mmetọ dị elu. Ebe a kwesịrị inwe uwe aka dị iche iche, mkpuchi ụlọ nyocha, efere na racks tube, pipettes, ntụ ntụ nzacha, bins na ngwa ndị ọzọ. A ga-etinye centrifuge na tubes tupu emepee. A ga-ehicha ebe ọrụ nlele ahụ n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.
Mgbe PCR gasịrị: Nyocha ngwaahịa
Ụlọ a bụ maka ngwa nchọpụta ngwaahịa, dịka ọmụmaatụ tankị electrophoresis gel, ngwugwu ike, transilluminator UV na sistemụ akwụkwọ gel. Ebe a kwesịrị inwe uwe aka dị iche iche, mkpuchi ụlọ nyocha, ihe nchekwa efere na tube, pipettes, ntụ ntụ nzacha, ihe nchekwa na ngwa ndị ọzọ. Enweghị ike ibubata ihe ndị ọzọ na-eme ka ihe dị n'ime ya bata n'ebe a, ewezuga agba agba, ihe nrịbama molekul na gel agarose, na ihe ndị na-echekwa ihe. A ga-ehicha ebe ọrụ nlele ahụ n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.
Ihe dị mkpa dị mkpa
N'ụzọ kacha mma, ekwesighi ịbanye n'ime ụlọ tupu PCR n'otu ụbọchị ahụ ma ọ bụrụ na arụọla ọrụ n'ime ụlọ mgbe PCR gasịrị. Ọ bụrụ na nke a bụ ihe a na-apụghị izere ezere, hụ na e buru ụzọ saa aka nke ọma ma yikwasịkwa uwe nyocha pụrụ iche n'ime ụlọ ndị ahụ. Agaghị eburu akwụkwọ nyocha na akwụkwọ n'ime ụlọ ndị tupu PCR gasịrị ma ọ bụrụ na ejiri ha mee ihe n'ime ụlọ ndị mgbe PCR gasịrị; ọ bụrụ na ọ dị mkpa, were mbipụta abụọ nke protocols/sample ID, wdg.
4. Ndụmọdụ gbasara bayoloji nke molekụla izugbe
Jiri uwe aka na-enweghị ntụ ntụ iji zere mgbochi nnwale. Usoro ziri ezi nke ọkpọkọ dị oke mkpa iji belata mmetọ. Ịkpọkọ ọkpọkọ na-ezighi ezi nwere ike ibute ịgbasa mmiri mgbe a na-enye mmiri na imepụta aerosols. Enwere ike ịchọta ezigbo omume maka ọkpọkọ ziri ezi na njikọ ndị a: Ntuziaka Gilson maka ọkpọkọ, vidiyo usoro ọkpọkọ Anachem, ọkpọkọ Centrifuge tupu emepee, ma mepee ha nke ọma iji zere ịgbasa. Mechie ọkpọkọ ozugbo ejiri ya iji zere itinye ihe ndị na-emerụ ahụ.
Mgbe ị na-eme ọtụtụ mmeghachi omume, kwadebe otu mastermix nwere ihe ndị a na-ahụkarị (dịka mmiri, dNTPs, buffer, primers na enzyme) iji belata ọnụọgụ nke nnyefe ihe ndị a na-agbanwe ma belata iyi egwu nke mmetọ. A na-atụ aro ka etinye mastermix na ice ma ọ bụ ngọngọ oyi. Iji enzyme Hot Start nwere ike inye aka belata mmepụta nke ngwaahịa ndị na-abụghị nke akọwapụtara. Chebe ihe ndị nwere ihe ndị na-eme fluorescent site na ìhè iji zere mmebi.
5. Njikwa dị n'ime
Gụnye njikwa dị mma na nke na-adịghị mma nke a na-ahụ nke ọma, nke a kwadoro nke ọma, yana njikwa enweghị ndebiri na mmeghachi omume niile, yana usoro nhazi ọtụtụ isi maka mmeghachi omume ọnụọgụgụ. Njikwa dị mma ekwesịghị ịdị ike nke na ọ na-eweta ihe egwu mmetọ. Gụnye njikwa mwepụ dị mma na nke na-adịghị mma mgbe ị na-eme mwepụta nucleic acid.
A na-atụ aro ka e tinye ntuziaka doro anya n'akụkụ nke ọ bụla ka ndị ọrụ wee mara iwu omume. Ụlọ nyocha nchọpụta nke na-achọpụta obere ọkwa DNA ma ọ bụ RNA na ihe nlele ahụike nwere ike ịchọ iji usoro nchekwa ọzọ nke inwe sistemụ njikwa ikuku dị iche iche nwere obere nrụgide ikuku dị mma n'ime ụlọ tupu PCR na obere nrụgide ikuku na-adịghị mma n'ime ụlọ mgbe PCR gasịrị.
N'ikpeazụ, imepụta atụmatụ nkwenye mma (QA) bara uru. Atụmatụ dị otu a kwesịrị ịgụnye ndepụta nke ngwaahịa ndị bụ isi nke reagent na ngwaahịa ndị a na-arụ ọrụ, iwu maka ịchekwa ngwa na reagent, ịkọ akụkọ nsonaazụ njikwa, mmemme ọzụzụ ndị ọrụ, algọridim nsogbu, na ihe ndị a ga-eme mgbe ọ dị mkpa.
6. Ndekọ Akwụkwọ
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Isi nke 3: Ịtọlite ụlọ nyocha qPCR. Akwụkwọ ntuziaka maka ịnwale mmiri ntụrụndụ site na iji usoro USEPA qPCR 1611. Lansing- Mahadum Steeti Michigan.
Ahụike Ọha na Eze England, NHS. Ụkpụrụ UK maka nyocha microbiology: Ezigbo Omume Ụlọ Nyocha mgbe a na-eme nnwale mmụba molekul). Nduzi Ogo. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Ịtọlite ụlọ nyocha PCR. Usoro Cold Spring Harb. 2007;7.
Schroeder S 2013. Ndozi oge niile nke centrifuges: nhicha, mmezi na nhicha nke centrifuges, rotors na ihe nkwụnye ọkụ (Akwụkwọ ọcha Nke 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Ezi Ọgwụ Ụlọ Nyocha Ọgwụ (GCLP) maka ule dabere na molekul nke ejiri mee ihe na ụlọ nyocha nchọpụta ọrịa, Na: Akyar I, onye nchịkọta akụkọ. Ọdịdị sara mbara nke njikwa mma. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Oge ozi: Julaị-16-2020
