ما يجب فعله وما لا يجب فعله في الاختبارات الجزيئية

تتميز طرق الكشف الجزيئي بقدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الأحماض النووية من خلال تضخيم كميات ضئيلة موجودة في العينات. ورغم أن هذا يُسهم في الكشف الحساس، إلا أنه يُعرّض العينات لخطر التلوث عبر انتشار رذاذ التضخيم في بيئة المختبر. لذا، عند إجراء التجارب، يُمكن اتخاذ تدابير لتجنب تلوث الكواشف ومعدات المختبر وسطح العمل، إذ قد يُؤدي هذا التلوث إلى نتائج إيجابية (أو سلبية) خاطئة.

للمساعدة في تقليل احتمالية التلوث، ينبغي تطبيق ممارسات المختبر الجيدة في جميع الأوقات. وعلى وجه التحديد، ينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة فيما يتعلق بالنقاط التالية:

1. التعامل مع الكواشف
2. تنظيم مساحة العمل والمعدات
3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المحددة
4. نصائح عامة في علم الأحياء الجزيئي
5. الضوابط الداخلية
6. قائمة المراجع

1. التعامل مع الكواشف

قم بتدوير أنابيب الكواشف لفترة وجيزة قبل فتحها لتجنب تكوّن الرذاذ. قسّم الكواشف إلى حصص صغيرة لتجنب التجميد والذوبان المتكررين وتلوث المحاليل المركزة. ضع ملصقًا واضحًا وتاريخًا على جميع أنابيب الكواشف والتفاعلات، واحتفظ بسجلات لأرقام دفعات الكواشف المستخدمة في جميع التجارب. استخدم رؤوس ماصة مزودة بمرشحات لسحب جميع الكواشف والعينات. قبل الشراء، يُنصح بالتأكد من الشركة المصنعة من توافق رؤوس الماصة مع نوع الماصة المستخدمة.

2. تنظيم مساحة العمل والمعدات

ينبغي تنظيم مساحة العمل لضمان سير العمل في اتجاه واحد، من المناطق النظيفة (قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق الملوثة (بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل). ستساعد الاحتياطات العامة التالية على تقليل احتمالية التلوث: تخصيص غرف منفصلة، ​​أو على الأقل مناطق منفصلة فعليًا، لما يلي: تحضير المزيج الرئيسي، واستخلاص الأحماض النووية وإضافة قالب الحمض النووي، وتضخيم الحمض النووي ومعالجة المنتج المُضخّم، وتحليل المنتج، مثل الفصل الكهربائي الهلامي.

في بعض الحالات، يصعب توفير أربع غرف منفصلة. ومن الخيارات الممكنة، وإن كانت أقل تفضيلاً، تحضير المزيج الرئيسي في منطقة معزولة، كخزانة التدفق الصفائحي مثلاً. في حالة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل، يُحضّر المزيج الرئيسي للجولة الثانية في المنطقة "النظيفة" المخصصة لتحضير المزيج الرئيسي، بينما يُجرى التلقيح بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي في غرفة التضخيم، وإن أمكن في منطقة معزولة مخصصة (كخزانة التدفق الصفائحي مثلاً).

تحتاج كل غرفة/منطقة إلى مجموعة منفصلة من الماصات، وأطراف الترشيح، وحوامل الأنابيب، وأجهزة الخلط، وأجهزة الطرد المركزي (إن وجدت)، والأقلام، وكواشف المختبر العامة، ومعاطف المختبر، وعلب القفازات، مع وضع ملصقات واضحة عليها، على أن تبقى هذه الأدوات في أماكن عملها المخصصة. يجب غسل اليدين وتغيير القفازات ومعاطف المختبر عند التنقل بين المناطق المخصصة. لا يجوز نقل الكواشف والمعدات من منطقة متسخة إلى منطقة نظيفة. في حال الضرورة القصوى لنقل كاشف أو قطعة من المعدات إلى مكان آخر، يجب أولاً تطهيرها بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10%، ثم مسحها بالماء المعقم.

ملحوظة

يجب تحضير محلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10% طازجًا يوميًا. عند استخدامه للتطهير، يجب الالتزام بفترة تلامس لا تقل عن 10 دقائق.
بدلاً من ذلك، يمكن استخدام المنتجات المتوفرة تجارياً والتي تم التحقق من صحتها كمطهرات سطحية مدمرة للحمض النووي إذا كانت توصيات السلامة المحلية لا تسمح باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم أو إذا كان هيبوكلوريت الصوديوم غير مناسب لتطهير الأجزاء المعدنية من المعدات.

من الأفضل أن يلتزم الموظفون بمبدأ سير العمل أحادي الاتجاه، وأن يتجنبوا الانتقال من المناطق الملوثة (بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق النظيفة (قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل) في اليوم نفسه. مع ذلك، قد تطرأ ظروف تستدعي ذلك. في هذه الحالة، يجب على الموظفين الحرص على غسل أيديهم جيدًا، وتغيير القفازات، وارتداء معطف المختبر المخصص، وعدم إدخال أي معدات يرغبون في إخراجها من الغرفة مرة أخرى، مثل دفاتر المختبر. ينبغي التأكيد على هذه الإجراءات الوقائية في تدريب الموظفين على الطرق الجزيئية.

بعد الاستخدام، يجب تنظيف أسطح العمل بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10% (ثم بالماء المعقم لإزالة أي بقايا مبيض)، أو الإيثانول بتركيز 70%، أو مطهر معتمد متوفر تجاريًا لتدمير الحمض النووي. يُفضل تركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية لتمكين التطهير بالإشعاع. مع ذلك، يجب حصر استخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في أماكن العمل المغلقة، مثل خزائن السلامة، للحد من تعرض العاملين في المختبر للأشعة فوق البنفسجية. يُرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة للعناية بمصابيح الأشعة فوق البنفسجية وتهويتها وتنظيفها لضمان استمرار فعاليتها.

في حالة استخدام الإيثانول بنسبة 70% بدلاً من هيبوكلوريت الصوديوم، ستكون هناك حاجة إلى التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لإكمال عملية التطهير.
لا تنظف جهاز الخلط والطرد المركزي بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم؛ بدلاً من ذلك، امسحهما بمحلول إيثانول بتركيز 70% وعرّضهما للأشعة فوق البنفسجية، أو استخدم مطهرًا تجاريًا مُدمرًا للحمض النووي. في حالة انسكاب أي سائل، راجع الشركة المصنعة لمزيد من نصائح التنظيف. إذا سمحت تعليمات الشركة المصنعة بذلك، يجب تعقيم الماصات بشكل روتيني باستخدام جهاز التعقيم بالبخار (الأوتوكلاف). إذا تعذر تعقيم الماصات بالبخار، يكفي تنظيفها بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10% (متبوعًا بمسحها جيدًا بالماء المعقم) أو باستخدام مطهر تجاري مُدمر للحمض النووي متبوعًا بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية.

قد يؤدي التنظيف بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم عالي التركيز إلى تلف البلاستيك والمعادن المستخدمة في الماصات مع مرور الوقت إذا تم استخدامه بانتظام؛ لذا يُرجى مراجعة توصيات الشركة المصنعة أولاً. يجب معايرة جميع الأجهزة بانتظام وفقًا للجدول الزمني الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ينبغي تعيين شخص مسؤول عن ضمان الالتزام بجدول المعايرة، والاحتفاظ بسجلات مفصلة، ​​وعرض ملصقات الخدمة بوضوح على الأجهزة.

3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المحددة

قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): تحضير مزيج الكواشف/المزيج الرئيسي: يجب أن تكون هذه المنطقة أنظف من بين جميع المناطق المستخدمة لتحضير التجارب الجزيئية، ويُفضل أن تكون خزانة تدفق صفائحي مُخصصة ومجهزة بضوء فوق بنفسجي. يُمنع منعًا باتًا التعامل مع العينات، أو الأحماض النووية المُستخلصة، أو نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المُضخمة في هذه المنطقة. يجب حفظ كواشف التضخيم في مُجمد (أو ثلاجة، وفقًا لتوصيات الشركة المُصنعة) في نفس المكان المُخصص، ويُفضل أن يكون بجوار خزانة التدفق الصفائحي أو منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب تغيير القفازات في كل مرة عند دخول منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو خزانة التدفق الصفائحي.

يجب تنظيف منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو خزانة التدفق الصفائحي قبل الاستخدام وبعده كما يلي: امسح جميع الأدوات داخل الخزانة، مثل الماصات، وعلب رؤوس الماصات، وجهاز الخلط، وجهاز الطرد المركزي، وحوامل الأنابيب، والأقلام، وما إلى ذلك، باستخدام الإيثانول بتركيز 70% أو مطهر تجاري مُدمر للحمض النووي، واتركها تجف. في حالة منطقة العمل المغلقة، مثل خزانة التدفق الصفائحي، عرّض غطاء الخزانة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

ملحوظة

لا تُعرّض الكواشف للأشعة فوق البنفسجية؛ انقلها إلى الخزانة بعد تنظيفها فقط. عند إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل العكسي (RT-PCR)، يُنصح بمسح الأسطح والمعدات بمحلول يُحلل إنزيمات RNase عند ملامستها. قد يُساعد ذلك على تجنب النتائج السلبية الكاذبة الناتجة عن تحلل الحمض النووي الريبي (RNA) بواسطة الإنزيمات. بعد التطهير وقبل تحضير المزيج الرئيسي، يجب تغيير القفازات مرة أخرى، ثم تصبح الخزانة جاهزة للاستخدام.

قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل: استخلاص الحمض النووي/إضافة القالب:

يجب استخلاص الحمض النووي ومعالجته في منطقة مخصصة ثانية، باستخدام مجموعة منفصلة من الماصات، وأطراف الترشيح، وحوامل الأنابيب، وقفازات جديدة، ومعاطف المختبر، وغيرها من المعدات. تُستخدم هذه المنطقة أيضًا لإضافة القوالب، وعناصر التحكم، وخطوط الاتجاه إلى أنابيب أو صفائح المزيج الرئيسي. لتجنب تلوث عينات الحمض النووي المستخلصة التي يتم تحليلها، يُنصح بتغيير القفازات قبل التعامل مع عناصر التحكم الإيجابية أو المعايير، واستخدام مجموعة منفصلة من الماصات. لا يجوز سحب كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمنتجات المُضخّمة في هذه المنطقة. يجب تخزين العينات في ثلاجات أو مجمدات مخصصة في نفس المنطقة. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة المزيج الرئيسي.

ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل: تضخيم المنتج المُضخّم والتعامل معه

هذه المساحة مخصصة لعمليات ما بعد التضخيم، ويجب أن تكون منفصلة تمامًا عن مناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تحتوي عادةً على أجهزة التدوير الحراري ومنصات التفاعل في الوقت الحقيقي، ويُفضل أن تحتوي على خزانة تدفق صفائحي لإضافة ناتج الجولة الأولى من تفاعل PCR إلى الجولة الثانية، في حال إجراء تفاعل PCR متداخل. يُمنع منعًا باتًا التعامل مع كواشف PCR والحمض النووي المستخلص في هذه المنطقة نظرًا لارتفاع خطر التلوث. يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعة منفصلة من القفازات، ومعاطف المختبر، وحوامل الأطباق والأنابيب، والماصات، ورؤوس الترشيح، والصناديق، وغيرها من المعدات. يجب طرد الأنابيب مركزيًا قبل فتحها. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة المزيج الرئيسي.

تحليل المنتج بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل

هذه الغرفة مخصصة لمعدات الكشف عن المنتجات، مثل خزانات الفصل الكهربائي الهلامي، ووحدات الطاقة، وجهاز الإضاءة فوق البنفسجية، ونظام توثيق الهلام. يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعات منفصلة من القفازات، ومعاطف المختبر، وحوامل الأطباق والأنابيب، والماصات، ورؤوس الترشيح، والصناديق، وغيرها من المعدات. لا يُسمح بإدخال أي كواشف أخرى إلى هذه المنطقة، باستثناء صبغة التحميل، والعلامة الجزيئية، وهلام الأغاروز، ومكونات المحلول المنظم. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة المزيج الرئيسي.

ملاحظة هامة

يُفضّل عدم دخول غرف ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في نفس اليوم إذا تمّ العمل مسبقًا في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حال كان ذلك ضروريًا، يجب التأكد من غسل اليدين جيدًا وارتداء معاطف المختبر المخصصة داخل الغرف. يُمنع إدخال دفاتر المختبر والأوراق إلى غرف ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا تمّ استخدامها في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ وفي حال الضرورة، يجب أخذ نسخ مطبوعة إضافية من البروتوكولات/معرفات العينات، وما إلى ذلك.

4. نصائح عامة في علم الأحياء الجزيئي

استخدم قفازات خالية من البودرة لتجنب تثبيط التحليل. تُعدّ تقنية السحب الصحيحة بالماصة أساسية للحدّ من التلوث. قد يؤدي السحب غير الصحيح إلى تناثر السوائل وتكوّن الرذاذ. يمكنك الاطلاع على أفضل الممارسات للسحب الصحيح بالماصة عبر الروابط التالية: دليل جيلسون للسحب بالماصة، وفيديوهات تقنية السحب بالماصة من أناكيم، وأنابيب الطرد المركزي قبل فتحها، وفتحها بحرص لتجنب التناثر. أغلق الأنابيب فور استخدامها لمنع دخول الملوثات.

عند إجراء تفاعلات متعددة، يُنصح بتحضير مزيج رئيسي واحد يحتوي على الكواشف المشتركة (مثل الماء، والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات، والمحلول المنظم، والبادئات، والإنزيم) لتقليل عدد مرات نقل الكواشف والحد من خطر التلوث. يُوصى بتحضير المزيج الرئيسي على الثلج أو على قاعدة تبريد. قد يُساعد استخدام إنزيم بدء التفاعل الساخن في تقليل إنتاج نواتج غير نوعية. يجب حماية الكواشف التي تحتوي على مجسات فلورية من الضوء لتجنب تلفها.

5. الضوابط الداخلية

يجب تضمين ضوابط إيجابية وسلبية موثقة ومحددة جيدًا، بالإضافة إلى ضابطة خالية من القالب في جميع التفاعلات، وخط اتجاه مُعاير متعدد النقاط للتفاعلات الكمية. يجب ألا تكون الضابطة الإيجابية قوية لدرجة تُشكل خطرًا للتلوث. يجب تضمين ضوابط استخلاص إيجابية وسلبية عند إجراء استخلاص الأحماض النووية.

يُوصى بنشر تعليمات واضحة في كل منطقة لضمان إلمام المستخدمين بقواعد السلوك. قد ترغب مختبرات التشخيص التي تكشف عن مستويات منخفضة جدًا من الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) في العينات السريرية في اعتماد إجراء أمني إضافي يتمثل في وجود أنظمة تهوية منفصلة بضغط هواء موجب طفيف في غرف ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وضغط هواء سالب طفيف في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

وأخيرًا، يُعدّ وضع خطة لضمان الجودة أمرًا مفيدًا. يجب أن تتضمن هذه الخطة قوائم بمخزونات الكواشف الرئيسية ومخزونات العمل، وقواعد تخزين الأدوات والكواشف، والإبلاغ عن نتائج المراقبة، وبرامج تدريب الموظفين، وخوارزميات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والإجراءات التصحيحية عند الحاجة.

6. قائمة المراجع

أصلان أ، كينزلمان ج، دريلين إ، أنانيفا ت، لافاندر ج. الفصل 3: إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). وثيقة إرشادية لاختبار المياه الترفيهية باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) رقم 1611 الصادرة عن وكالة حماية البيئة الأمريكية. جامعة ولاية ميشيغان، لانسينغ.

هيئة الصحة العامة في إنجلترا، هيئة الخدمات الصحية الوطنية. معايير المملكة المتحدة للتحقيقات الميكروبيولوجية: الممارسات المختبرية الجيدة عند إجراء فحوصات التضخيم الجزيئي. إرشادات الجودة. 2013؛4(4):1-15.

ميفلين تي. إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بروتوكولات كولد سبرينغ هاربور. 2007؛7.

شرودر إس 2013. الصيانة الدورية لأجهزة الطرد المركزي: تنظيف وصيانة وتطهير أجهزة الطرد المركزي والدوارات والمحولات (ورقة بيضاء رقم 14). هامبورغ: إيبندورف؛ 2013.

فيانا آر في، واليس سي إل. الممارسات المختبرية السريرية الجيدة (GCLP) للاختبارات الجزيئية المستخدمة في مختبرات التشخيص، في: أكيار آي، محرر. أطياف واسعة من مراقبة الجودة. رييكا، كرواتيا: إنتك؛ 2011: 29-52.