आण्विक शोध पद्धतींमध्ये नमुन्यांमध्ये आढळणाऱ्या सूक्ष्म प्रमाणांचे प्रवर्धन करून मोठ्या प्रमाणात न्यूक्लिक आम्ल तयार करण्याची क्षमता असते. संवेदनशील शोध सक्षम करण्यासाठी हे फायदेशीर असले तरी, यामुळे प्रयोगशाळेच्या वातावरणात प्रवर्धन एरोसोलच्या प्रसारामुळे दूषित होण्याची शक्यताही निर्माण होते. प्रयोग करताना, अभिकर्मक, प्रयोगशाळेतील उपकरणे आणि बेंचची जागा दूषित होण्यापासून वाचवण्यासाठी उपाययोजना केल्या जाऊ शकतात, कारण अशा दूषिततेमुळे चुकीचे-सकारात्मक (किंवा चुकीचे-नकारात्मक) परिणाम मिळू शकतात.
दूषित होण्याची शक्यता कमी करण्यासाठी, सर्वकाळ उत्तम प्रयोगशाळा पद्धतींचे पालन केले पाहिजे. विशेषतः, खालील मुद्द्यांबाबत खबरदारी घेतली पाहिजे:
१. अभिकर्मकांची हाताळणी
२. कामाच्या जागेची आणि उपकरणांची मांडणी
३. निर्दिष्ट आण्विक जागेसाठी वापर आणि स्वच्छतेविषयी सल्ला
४. सर्वसाधारण आण्विक जीवशास्त्र सल्ला
५. अंतर्गत नियंत्रणे
६. संदर्भसूची
१. अभिकर्मकांची हाताळणी
एरोसोलची निर्मिती टाळण्यासाठी रिएजंट ट्यूब उघडण्यापूर्वी त्यांना थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करा. वारंवार फ्रीझ-थॉ करणे आणि मास्टर स्टॉक्सचे दूषितीकरण टाळण्यासाठी रिएजंट्सचे अलिक्वॉट करा. सर्व रिएजंट आणि रिॲक्शन ट्यूब्सना स्पष्टपणे लेबल लावा आणि तारीख लिहा, तसेच सर्व प्रयोगांमध्ये वापरलेल्या रिएजंट लॉट आणि बॅच क्रमांकांची नोंद ठेवा. फिल्टर टिप्स वापरून सर्व रिएजंट्स आणि नमुने पिपेट करा. खरेदी करण्यापूर्वी, वापरल्या जाणाऱ्या पिपेटच्या ब्रँडला फिल्टर टिप्स योग्य बसतात की नाही, याची निर्मात्याकडून खात्री करून घेणे उचित आहे.
२. कामाच्या जागेची आणि उपकरणांची मांडणी
कामाची जागा अशा प्रकारे आयोजित केली पाहिजे की कामाचा प्रवाह एकाच दिशेने, स्वच्छ भागांपासून (प्री-पीसीआर) अस्वच्छ भागांपर्यंत (पोस्ट-पीसीआर) होईल. खालील सामान्य खबरदारीमुळे संसर्गाची शक्यता कमी होण्यास मदत होईल. मास्टरमिक्स तयार करणे, न्यूक्लिक ऍसिड काढणे आणि डीएनए टेम्पलेट जोडणे, ऍम्प्लिफिकेशन आणि ऍम्प्लिफाइड उत्पादनाची हाताळणी, आणि उत्पादनाचे विश्लेषण, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, यांसाठी स्वतंत्र नियुक्त खोल्या किंवा किमान भौतिकदृष्ट्या वेगळ्या जागा असाव्यात.
काही ठिकाणी, ४ स्वतंत्र खोल्या असणे अवघड असते. एक शक्य पण कमी श्रेयस्कर पर्याय म्हणजे मास्टरमिक्सची तयारी एका कंटेनमेंट एरियामध्ये, उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेटमध्ये करणे. नेस्टेड पीसीआर ॲम्प्लिफिकेशनच्या बाबतीत, दुसऱ्या फेरीच्या रिॲक्शनसाठी मास्टरमिक्सची तयारी मास्टरमिक्स तयार करण्याच्या 'स्वच्छ' भागात केली पाहिजे, परंतु प्राथमिक पीसीआर उत्पादनासह इनॉक्युलेशन ॲम्प्लिफिकेशन रूममध्ये आणि शक्य असल्यास एका समर्पित कंटेनमेंट एरियामध्ये (उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट) केले पाहिजे.
प्रत्येक खोली/जागेसाठी स्पष्टपणे लेबल लावलेल्या पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रॅक्स, व्हॉर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज (लागू असल्यास), पेन, सामान्य प्रयोगशाळा अभिकर्मक, लॅब कोट आणि हातमोज्यांचे बॉक्स यांचा एक स्वतंत्र संच आवश्यक आहे, जो त्या त्या कामाच्या ठिकाणीच राहील. निर्धारित जागांमध्ये फिरताना हात धुतले पाहिजेत आणि हातमोजे व लॅब कोट बदलले पाहिजेत. अभिकर्मक आणि उपकरणे अस्वच्छ जागेवरून स्वच्छ जागेवर हलवू नयेत. एखादे अभिकर्मक किंवा उपकरण मागे हलवण्याची अत्यंत गंभीर गरज भासल्यास, प्रथम ते १०% सोडियम हायपोक्लोराइटने निर्जंतुक केले पाहिजे आणि त्यानंतर निर्जंतुक पाण्याने पुसून स्वच्छ केले पाहिजे.
टीप
१०% सोडियम हायपोक्लोराइट द्रावण दररोज ताजे तयार केले पाहिजे. निर्जंतुकीकरणासाठी वापरताना, किमान १० मिनिटांचा संपर्क कालावधी पाळला पाहिजे.
पर्यायाने, जर स्थानिक सुरक्षा शिफारसींनुसार सोडियम हायपोक्लोराइटच्या वापरास परवानगी नसेल किंवा उपकरणांच्या धातूच्या भागांचे निर्जंतुकीकरण करण्यासाठी सोडियम हायपोक्लोराइट योग्य नसेल, तर डीएनए नष्ट करणारे पृष्ठभाग निर्जंतुकीकरण करणारे म्हणून प्रमाणित असलेली व्यावसायिकरित्या उपलब्ध उत्पादने वापरली जाऊ शकतात.
आदर्श परिस्थितीत, कर्मचाऱ्यांनी एकमार्गी कार्यप्रवाहाच्या तत्त्वाचे पालन केले पाहिजे आणि एकाच दिवशी अस्वच्छ भागातून (पीसीआर-नंतर) स्वच्छ भागात (पीसीआर-पूर्वी) परत जाऊ नये. तथापि, काही वेळा हे टाळणे शक्य नसते. जेव्हा अशी वेळ येते, तेव्हा कर्मचाऱ्यांनी आपले हात पूर्णपणे स्वच्छ धुवावेत, हातमोजे बदलावेत, नेमून दिलेला लॅब कोट वापरावा आणि लॅब बुकसारखी कोणतीही उपकरणे खोलीत आणू नयेत, कारण त्यांना ती पुन्हा खोलीबाहेर घेऊन जाण्याची इच्छा होऊ शकते. आण्विक पद्धतींवरील कर्मचारी प्रशिक्षणात अशा नियंत्रण उपायांवर भर दिला पाहिजे.
वापरानंतर, बेंचची जागा १०% सोडियम हायपोक्लोराइट (त्यानंतर उर्वरित ब्लीच काढण्यासाठी निर्जंतुक पाण्याने धुवावे), ७०% इथेनॉल, किंवा प्रमाणित व्यावसायिक डीएनए-नष्ट करणाऱ्या निर्जंतुकीकरण द्रव्याने स्वच्छ करावी. आदर्शपणे, किरणोत्सर्गाद्वारे निर्जंतुकीकरण शक्य होण्यासाठी अतिनील (UV) दिवे बसवले पाहिजेत. तथापि, प्रयोगशाळेतील कर्मचाऱ्यांचा अतिनील किरणांशी संपर्क मर्यादित ठेवण्यासाठी, UV दिव्यांचा वापर केवळ बंद कामाच्या जागांपुरता, उदा. सुरक्षा कॅबिनेट, मर्यादित असावा. दिवे प्रभावी राहतील याची खात्री करण्यासाठी, कृपया UV दिव्यांची काळजी, वायुवीजन आणि स्वच्छतेसाठी निर्मात्याच्या सूचनांचे पालन करा.
सोडियम हायपोक्लोराइटऐवजी ७०% इथेनॉल वापरल्यास, निर्जंतुकीकरण पूर्ण करण्यासाठी अतिनील (UV) प्रकाशाने विकिरण करणे आवश्यक असेल.
व्हॉर्टेक्स आणि सेंट्रीफ्यूज सोडियम हायपोक्लोराइटने स्वच्छ करू नका; त्याऐवजी, ७०% इथेनॉलने पुसून घ्या आणि अतिनील (UV) प्रकाशात ठेवा, किंवा व्यावसायिक डीएनए-नष्ट करणारे निर्जंतुकीकरण द्रावण वापरा. काही सांडल्यास, स्वच्छतेबद्दलच्या अधिक सल्ल्यासाठी निर्मात्याशी संपर्क साधा. निर्मात्याच्या सूचनांमध्ये परवानगी असल्यास, पिपेट्स नियमितपणे ऑटोक्लेव्हद्वारे निर्जंतुक केले पाहिजेत. जर पिपेट्स ऑटोक्लेव्ह करता येत नसतील, तर त्यांना १०% सोडियम हायपोक्लोराइटने (त्यानंतर निर्जंतुक पाण्याने पूर्णपणे पुसून) किंवा व्यावसायिक डीएनए-नष्ट करणाऱ्या निर्जंतुकीकरण द्रावणाने स्वच्छ करून अतिनील (UV) प्रकाशात ठेवणे पुरेसे आहे.
उच्च-प्रमाणातील सोडियम हायपोक्लोराइटने नियमितपणे साफसफाई केल्यास कालांतराने पिपेटमधील प्लॅस्टिक आणि धातूंचे नुकसान होऊ शकते; प्रथम निर्मात्याच्या शिफारसी तपासा. निर्मात्याने शिफारस केलेल्या वेळापत्रकानुसार सर्व उपकरणांचे नियमितपणे कॅलिब्रेशन करणे आवश्यक आहे. कॅलिब्रेशनच्या वेळापत्रकाचे पालन केले जात आहे, तपशीलवार नोंदी ठेवल्या जात आहेत आणि उपकरणांवर सर्व्हिस लेबल्स स्पष्टपणे लावलेले आहेत, याची खात्री करण्याची जबाबदारी एका नियुक्त व्यक्तीवर असावी.
३. निर्दिष्ट आण्विक जागेसाठी वापर आणि स्वच्छतेविषयी सल्ला
प्री-पीसीआर: अभिकर्मकांचे विभाजन / मास्टरमिक्सची तयारी: आण्विक प्रयोगांच्या तयारीसाठी वापरल्या जाणाऱ्या सर्व जागांपैकी ही सर्वात स्वच्छ जागा असावी आणि शक्यतोवर यासाठी यूव्ही (UV) लाईटने सुसज्ज असलेले एक निश्चित लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असावे. या भागात नमुने, काढलेले न्यूक्लिक आम्ल आणि वर्धित पीसीआर उत्पादने हाताळली जाऊ नयेत. वर्धन अभिकर्मके त्याच निश्चित जागेत, शक्यतोवर लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट किंवा प्री-पीसीआर क्षेत्राच्या शेजारी, फ्रीझरमध्ये (किंवा निर्मात्याच्या शिफारशीनुसार रेफ्रिजरेटरमध्ये) ठेवावीत. प्री-पीसीआर क्षेत्रात किंवा लॅमिनार फ्लो कॅबिनेटमध्ये प्रत्येक वेळी प्रवेश करताना हातमोजे बदलले पाहिजेत.
प्री-पीसीआर क्षेत्र किंवा लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट वापरण्यापूर्वी आणि वापरल्यानंतर खालीलप्रमाणे स्वच्छ करावे: कॅबिनेटमधील सर्व वस्तू, उदा. पिपेट्स, टिप बॉक्सेस, व्हॉर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रॅक्स, पेन्स इत्यादी ७०% इथेनॉल किंवा व्यावसायिक डीएनए-नष्ट करणाऱ्या निर्जंतुकीकरण द्रव्याने पुसून घ्या आणि सुकू द्या. बंद कार्यक्षेत्राच्या बाबतीत, उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट, हूडला ३० मिनिटांसाठी यूव्ही (UV) प्रकाशात ठेवा.
टीप
अभिक्रियाकारकांना अतिनील (UV) प्रकाशाच्या संपर्कात आणू नका; कॅबिनेट स्वच्छ झाल्यावरच त्यांना त्यात ठेवा. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर करत असल्यास, संपर्कात येताच आरएनएसेस (RNases) चे विघटन करणाऱ्या द्रावणाने पृष्ठभाग आणि उपकरणे पुसून घेणे देखील उपयुक्त ठरू शकते. यामुळे आरएनएच्या एन्झाइम-विघटनामुळे येणारे खोटे-नकारात्मक (false-negative) निकाल टाळण्यास मदत होऊ शकते. निर्जंतुकीकरणानंतर आणि मास्टरमिक्स तयार करण्यापूर्वी, हातमोजे पुन्हा एकदा बदलावेत आणि त्यानंतर कॅबिनेट वापरासाठी तयार आहे.
प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक ॲसिड निष्कर्षण/टेम्पलेट जोडणे:
न्यूक्लिक अॅसिड दुसऱ्या एका निश्चित केलेल्या जागेत, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रॅक्स, नवीन हातमोजे, लॅब कोट आणि इतर उपकरणांचा वेगळा संच वापरून काढले पाहिजे आणि हाताळले पाहिजे. ही जागा मास्टरमिक्स ट्यूब्स किंवा प्लेट्समध्ये टेम्पलेट, कंट्रोल्स आणि ट्रेंडलाइन्स टाकण्यासाठी देखील आहे. विश्लेषण केल्या जाणाऱ्या काढलेल्या न्यूक्लिक अॅसिडच्या नमुन्यांचे दूषितीकरण टाळण्यासाठी, पॉझिटिव्ह कंट्रोल्स किंवा स्टँडर्ड्स हाताळण्यापूर्वी हातमोजे बदलण्याची आणि पिपेट्सचा वेगळा संच वापरण्याची शिफारस केली जाते. या जागेत पीसीआर रिएजंट्स आणि अॅम्प्लिफाइड उत्पादने पिपेट करू नयेत. नमुने त्याच जागेतील निश्चित केलेल्या फ्रिज किंवा फ्रीझरमध्ये साठवले पाहिजेत. नमुन्यांची कामाची जागा मास्टरमिक्सच्या जागेप्रमाणेच स्वच्छ केली पाहिजे.
पीसीआर नंतर: प्रवर्धन आणि प्रवर्धित उत्पादनाची हाताळणी
ही निश्चित केलेली जागा प्रवर्धनोत्तर प्रक्रियांसाठी आहे आणि ती पीसीआर-पूर्व क्षेत्रांपासून भौतिकदृष्ट्या वेगळी असावी. यामध्ये सामान्यतः थर्मोसायक्लर्स आणि रिअल-टाइम प्लॅटफॉर्म्स असतात, आणि जर नेस्टेड पीसीआर केला जात असेल, तर पहिल्या फेरीतील पीसीआर उत्पादन दुसऱ्या फेरीतील अभिक्रियेत टाकण्यासाठी आदर्शपणे येथे एक लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असावे. या क्षेत्रात पीसीआर अभिकर्मक आणि काढलेले न्यूक्लिक आम्ल हाताळले जाऊ नये, कारण दूषित होण्याचा धोका जास्त असतो. या क्षेत्रात हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, डबे आणि इतर उपकरणांचा एक वेगळा संच असावा. ट्यूब्स उघडण्यापूर्वी त्या सेंट्रीफ्यूज करणे आवश्यक आहे. नमुन्याची कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्सच्या जागेप्रमाणेच स्वच्छ केली पाहिजे.
पीसीआर नंतर: उत्पादनाचे विश्लेषण
ही खोली उत्पादन ओळखण्याच्या उपकरणांसाठी आहे, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस टँक, पॉवर पॅक, यूव्ही ट्रान्सइल्यूमिनेटर आणि जेल डॉक्युमेंटेशन सिस्टीम. या जागेत हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट, फिल्टर टिप्स, डबे आणि इतर उपकरणांचे स्वतंत्र संच असावेत. लोडिंग डाय, मॉलिक्युलर मार्कर आणि ॲगारोज जेल, आणि बफरचे घटक वगळता इतर कोणतेही अभिकर्मक या जागेत आणता येणार नाहीत. नमुना कामाची जागा मास्टरमिक्सच्या जागेप्रमाणेच स्वच्छ केली पाहिजे.
महत्त्वाची नोंद
शक्यतो, पोस्ट-पीसीआर खोल्यांमध्ये आधीच काम झाले असल्यास, त्याच दिवशी प्री-पीसीआर खोल्यांमध्ये प्रवेश करू नये. जर हे पूर्णपणे टाळता येत नसेल, तर प्रथम हात पूर्णपणे धुतले आहेत आणि खोल्यांमध्ये विशिष्ट लॅब कोट घातले आहेत याची खात्री करा. पोस्ट-पीसीआर खोल्यांमध्ये वापरलेली लॅब पुस्तके आणि कागदपत्रे प्री-पीसीआर खोल्यांमध्ये नेऊ नयेत; आवश्यक असल्यास, प्रोटोकॉल/नमुना आयडी इत्यादींच्या डुप्लिकेट प्रिंट-आउट्स सोबत घ्या.
४. सर्वसाधारण आण्विक जीवशास्त्र सल्ला
चाचणीतील अडथळा टाळण्यासाठी पावडर-विरहित हातमोजे वापरा. दूषितीकरण कमी करण्यासाठी योग्य पिपेटिंग तंत्र अत्यंत महत्त्वाचे आहे. चुकीच्या पिपेटिंगमुळे द्रव पदार्थ बाहेर टाकताना ते उडू शकते आणि एरोसोल तयार होऊ शकतात. योग्य पिपेटिंगसाठी चांगल्या पद्धती खालील लिंक्सवर आढळतील: गिलसनचे पिपेटिंग मार्गदर्शक, ॲनाकेम पिपेटिंग तंत्राचे व्हिडिओ, ट्यूब उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज करा आणि ते उडू नये म्हणून काळजीपूर्वक उघडा. दूषित पदार्थ आत जाणे टाळण्यासाठी वापरानंतर लगेच ट्यूब बंद करा.
एकापेक्षा जास्त अभिक्रिया करत असताना, अभिकर्मक हस्तांतरणाची संख्या कमी करण्यासाठी आणि दूषित होण्याचा धोका टाळण्यासाठी, सामान्य अभिकर्मक (उदा. पाणी, dNTPs, बफर, प्रायमर्स आणि एन्झाइम) असलेले एकच मास्टरमिक्स तयार करा. मास्टरमिक्स बर्फावर किंवा कोल्ड ब्लॉकवर सेट करण्याची शिफारस केली जाते. हॉट स्टार्ट एन्झाइमच्या वापरामुळे अविशिष्ट उत्पादनांची निर्मिती कमी होण्यास मदत होऊ शकते. ऱ्हास टाळण्यासाठी, फ्लोरोसेंट प्रोब्स असलेल्या अभिकर्मकांना प्रकाशापासून संरक्षित करा.
५. अंतर्गत नियंत्रणे
सर्व अभिक्रियांमध्ये सुस्पष्टपणे वैशिष्ट्यीकृत, पुष्टी केलेले सकारात्मक आणि नकारात्मक नियंत्रक, तसेच एक नो-टेम्पलेट नियंत्रक समाविष्ट करा; आणि परिमाणात्मक अभिक्रियांसाठी एक मल्टी-पॉइंट टायट्रेटेड ट्रेंडलाइन समाविष्ट करा. सकारात्मक नियंत्रक इतके प्रभावी नसावे की त्यामुळे दूषित होण्याचा धोका निर्माण होईल. न्यूक्लिक आम्लाचे निष्कर्षण करताना सकारात्मक आणि नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रक समाविष्ट करा.
अशी शिफारस केली जाते की प्रत्येक क्षेत्रात स्पष्ट सूचना लावल्या जाव्यात, जेणेकरून वापरकर्त्यांना वर्तणुकीच्या नियमांची जाणीव होईल. क्लिनिकल नमुन्यांमध्ये डीएनए किंवा आरएनएचे अत्यंत कमी प्रमाण शोधणाऱ्या निदान प्रयोगशाळा, प्री-पीसीआर खोल्यांमध्ये किंचित सकारात्मक हवेच्या दाबाची आणि पोस्ट-पीसीआर खोल्यांमध्ये किंचित नकारात्मक हवेच्या दाबाची स्वतंत्र एअर हँडलिंग सिस्टीम ठेवण्याचा अतिरिक्त सुरक्षा उपाय अवलंबू शकतात.
शेवटी, गुणवत्ता हमी (QA) योजना विकसित करणे उपयुक्त ठरते. अशा योजनेत अभिकर्मक मास्टर स्टॉक आणि वर्किंग स्टॉकच्या याद्या, किट आणि अभिकर्मक साठवण्याचे नियम, नियंत्रण परिणामांचा अहवाल, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्यानिवारण अल्गोरिदम आणि आवश्यकतेनुसार उपाययोजना यांचा समावेश असावा.
६. संदर्भसूची
अस्लान ए, किंझेलमन जे, ड्रीलिन ई, अनानेवा टी, लॅव्हेंडर जे. प्रकरण ३: क्यूपीसीआर प्रयोगशाळेची स्थापना. युएसईपीए क्यूपीसीआर पद्धत १६११ वापरून मनोरंजनात्मक पाण्याच्या चाचणीसाठी एक मार्गदर्शन दस्तऐवज. लान्सिंग- मिशिगन स्टेट युनिव्हर्सिटी.
पब्लिक हेल्थ इंग्लंड, एनएचएस. सूक्ष्मजीवशास्त्र तपासणीसाठी यूके मानके: आण्विक प्रवर्धन चाचण्या करताना चांगली प्रयोगशाळा पद्धत). गुणवत्ता मार्गदर्शन. 2013;4(4):1–15.
मिफ्लिन टी. पीसीआर प्रयोगशाळेची स्थापना करणे. कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रोटोकॉल. २००७;७.
श्रोडर एस २०१३. सेंट्रीफ्यूजची नियमित देखभाल: सेंट्रीफ्यूज, रोटर्स आणि अडॅप्टर्सची स्वच्छता, देखभाल आणि निर्जंतुकीकरण (श्वेतपत्र क्र. १४). हॅम्बर्ग: एपेंडॉर्फ; २०१३.
वियाना आरव्ही, वॉलिस सीएल. निदान प्रयोगशाळांमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या आण्विक आधारित चाचण्यांसाठी चांगली क्लिनिकल प्रयोगशाळा पद्धत (GCLP), इन: अक्यार आय, संपादक. गुणवत्ता नियंत्रणाचे विस्तृत स्पेक्ट्रम. रिजेका, क्रोएशिया: इनटेक; २०११: २९–५२.
पोस्ट करण्याची वेळ: जुलै-१६-२०२०
