분자 검출 방법은 시료에 미량으로 존재하는 핵산을 증폭시켜 대량의 핵산을 생성할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이는 민감한 검출을 가능하게 하는 장점이지만, 증폭 과정에서 발생하는 에어로졸이 실험실 환경으로 확산되어 오염될 가능성도 있습니다. 실험 수행 시 시약, 실험 장비 및 실험대 공간의 오염을 방지하기 위한 조치를 취해야 하며, 이러한 오염은 위양성(또는 위음성) 결과를 초래할 수 있습니다.
오염 가능성을 줄이기 위해 항상 우수 실험실 운영 기준(Good Laboratory Practice)을 준수해야 합니다. 특히 다음과 같은 사항에 유의하여 예방 조치를 취해야 합니다.
1. 시약 취급
2. 작업 공간 및 장비 배치
3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 지침
4. 분자생물학 관련 일반적인 조언
5. 내부 통제
6. 참고문헌
1. 시약 취급
에어로졸 발생을 방지하기 위해 시약 튜브를 개봉하기 전에 잠시 원심분리하십시오. 여러 번의 동결-해동 및 마스터 스톡의 오염을 방지하기 위해 시약을 소분하십시오. 모든 시약 및 반응 튜브에 라벨을 명확하게 붙이고 날짜를 기록하며, 모든 실험에 사용된 시약의 로트 번호와 배치 번호를 기록해 두십시오. 모든 시약과 시료는 필터 팁을 사용하여 피펫팅하십시오. 구매 전에 필터 팁이 사용하려는 피펫 브랜드에 적합한지 제조업체에 확인하는 것이 좋습니다.
2. 작업 공간 및 장비 배치
작업 공간은 작업 흐름이 깨끗한 구역(PCR 전)에서 오염된 구역(PCR 후)으로 한 방향으로 이루어지도록 구성해야 합니다. 다음의 일반적인 예방 조치를 통해 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. 마스터믹스 준비, 핵산 추출 및 DNA 주형 첨가, 증폭 및 증폭 산물 처리, 그리고 산물 분석(예: 겔 전기영동)을 위해 각각 별도의 지정된 방 또는 최소한 물리적으로 분리된 공간을 마련하십시오.
일부 환경에서는 4개의 독립된 공간을 확보하기 어렵습니다. 가능하지만 바람직하지는 않은 대안으로, 마스터믹스 준비를 밀폐된 공간(예: 층류 캐비닛)에서 수행하는 방법이 있습니다. 중첩 PCR 증폭의 경우, 2차 반응용 마스터믹스는 마스터믹스 준비를 위한 '청정' 공간에서 준비해야 하지만, 1차 PCR 산물을 접종하는 작업은 증폭실에서, 가능하면 전용 밀폐 공간(예: 층류 캐비닛)에서 수행해야 합니다.
각 방/구역에는 라벨이 명확하게 부착된 피펫, 필터 팁, 튜브 랙, 볼텍스, 원심분리기(필요한 경우), 펜, 일반 실험 시약, 실험복, 장갑 상자 세트가 각각 따로 비치되어 해당 작업대에 놓여 있어야 합니다. 지정된 구역을 이동할 때는 손을 씻고 장갑과 실험복을 갈아입어야 합니다. 시약과 장비는 오염된 구역에서 깨끗한 구역으로 옮겨서는 안 됩니다. 만약 시약이나 장비를 다시 오염된 구역으로 옮겨야 하는 극단적인 경우에는 먼저 10% 차아염소산나트륨 용액으로 소독한 후 멸균수로 닦아내야 합니다.
메모
10% 차아염소산나트륨 용액은 매일 새로 제조해야 합니다. 오염 제거에 사용할 경우 최소 10분의 접촉 시간을 준수해야 합니다.
또는 현지 안전 권고 사항에서 차아염소산나트륨 사용을 허용하지 않거나 차아염소산나트륨이 장비의 금속 부품 소독에 적합하지 않은 경우, DNA 파괴 효과가 검증된 시판 표면 소독제를 사용할 수 있습니다.
이상적으로는, 직원들은 일방향 작업 흐름 원칙을 준수하여 오염된 구역(PCR 후)에서 깨끗한 구역(PCR 전)으로 당일에 다시 이동하지 않아야 합니다. 그러나 불가피한 경우가 있을 수 있습니다. 이러한 상황이 발생할 경우, 직원들은 손을 깨끗이 씻고, 장갑을 교체하고, 지정된 실험복을 착용하며, 실험 노트와 같이 다시 반출해야 할 장비를 반입하지 않도록 주의해야 합니다. 이러한 통제 조치는 분자생물학적 방법 관련 직원 교육에서 강조되어야 합니다.
사용 후에는 실험대 공간을 10% 차아염소산나트륨 용액(잔류 표백제 제거를 위해 멸균수로 헹굼), 70% 에탄올 또는 검증된 시판 DNA 파괴 소독제로 세척해야 합니다. 이상적으로는 자외선(UV) 램프를 설치하여 조사에 의한 소독을 실시해야 합니다. 그러나 실험실 직원의 자외선 노출을 최소화하기 위해 UV 램프는 안전 캐비닛과 같은 밀폐된 작업 공간에서만 사용해야 합니다. UV 램프의 효과를 유지하기 위해 제조사의 관리, 환기 및 세척 지침을 준수하십시오.
차아염소산나트륨 대신 70% 에탄올을 사용하는 경우, 오염 제거를 완료하려면 자외선 조사가 필요합니다.
볼텍스 믹서와 원심분리기는 차아염소산나트륨으로 세척하지 마십시오. 대신 70% 에탄올로 닦은 후 자외선에 노출시키거나 시판되는 DNA 파괴용 소독제를 사용하십시오. 액체가 쏟아진 경우에는 제조사에 문의하여 추가적인 세척 방법을 확인하십시오. 제조사 지침에 따라 피펫은 정기적으로 고압멸균해야 합니다. 고압멸균이 불가능한 경우에는 10% 차아염소산나트륨으로 세척한 후 멸균수로 깨끗이 닦거나, 시판되는 DNA 파괴용 소독제를 사용한 후 자외선에 노출시키는 것으로 충분합니다.
고농도 차아염소산나트륨 용액으로 정기적으로 세척하면 피펫의 플라스틱과 금속 부분이 손상될 수 있으므로, 사용 전에 제조사의 권장 사항을 먼저 확인하십시오. 모든 장비는 제조사에서 권장하는 일정에 따라 정기적으로 교정해야 합니다. 담당자를 지정하여 교정 일정을 준수하고, 상세한 기록을 유지하며, 장비에 서비스 라벨을 명확하게 부착하도록 해야 합니다.
3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 지침
PCR 전 단계: 시약 분주/마스터믹스 준비: 분자 실험 준비에 사용되는 모든 공간 중 가장 청결해야 하는 공간이며, 이상적으로는 UV 램프가 장착된 층류 캐비닛이어야 합니다. 샘플, 추출된 핵산 및 증폭된 PCR 산물은 이 구역에서 취급해서는 안 됩니다. 증폭 시약은 동일한 지정된 공간, 이상적으로는 층류 캐비닛 또는 PCR 전 단계 구역 옆에 있는 냉동고(또는 제조사 권장 사항에 따라 냉장고)에 보관해야 합니다. PCR 전 단계 구역 또는 층류 캐비닛에 들어갈 때마다 장갑을 교체해야 합니다.
PCR 전처리 공간 또는 층류 캐비닛은 사용 전후에 다음과 같이 청소해야 합니다. 캐비닛 내 모든 물품(예: 피펫, 팁 박스, 볼텍스 믹서, 원심분리기, 튜브 랙, 펜 등)을 70% 에탄올 또는 시판되는 DNA 파괴용 소독제로 닦고 건조시키십시오. 층류 캐비닛과 같은 밀폐된 작업 공간의 경우, 후드를 자외선(UV)에 30분 동안 노출시키십시오.
메모
시약을 자외선에 노출시키지 마십시오. 캐비닛이 깨끗해진 후에만 시약을 캐비닛 안으로 옮기십시오. 역전사 PCR을 수행하는 경우, 접촉 시 RNase를 분해하는 용액으로 표면과 장비를 닦아내는 것도 도움이 될 수 있습니다. 이는 RNA의 효소 분해로 인한 위음성 결과를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오염 제거 후 마스터믹스를 준비하기 전에 장갑을 다시 한 번 교체해야 하며, 그 후에 캐비닛을 사용할 수 있습니다.
PCR 전 단계: 핵산 추출/주형 첨가:
핵산 추출 및 취급은 별도의 피펫, 필터 팁, 튜브 랙, 새 장갑, 실험복 및 기타 장비를 사용하는 지정된 구역에서 수행해야 합니다. 이 구역은 또한 마스터믹스 튜브 또는 플레이트에 주형, 대조군 및 추세선을 첨가하는 데 사용됩니다. 분석 중인 추출된 핵산 샘플의 오염을 방지하기 위해 양성 대조군 또는 표준 물질을 다루기 전에 장갑을 교체하고 별도의 피펫 세트를 사용하는 것이 좋습니다. PCR 시약 및 증폭 산물은 이 구역에서 피펫팅해서는 안 됩니다. 샘플은 같은 구역에 있는 지정된 냉장고 또는 냉동고에 보관해야 합니다. 샘플 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
PCR 후 단계: 증폭 및 증폭된 산물의 처리
이 지정된 공간은 증폭 후 처리 과정을 위한 공간으로, PCR 전 단계 영역과 물리적으로 분리되어야 합니다. 일반적으로 열순환기(thermocycler)와 실시간 PCR 플랫폼이 있으며, 중첩 PCR(nested PCR)을 수행하는 경우 1차 PCR 산물을 2차 반응에 첨가하기 위한 층류 캐비닛(laminar flow cabinet)이 있는 것이 이상적입니다. PCR 시약과 추출된 핵산은 오염 위험이 높으므로 이 구역에서 취급해서는 안 됩니다. 이 구역에는 별도의 장갑, 실험복, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 용기 및 기타 장비가 비치되어 있어야 합니다. 튜브는 개봉 전에 원심분리해야 합니다. 샘플 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
PCR 후 분석: 생성물 분석
이 공간은 겔 전기영동 탱크, 전원 공급 장치, UV 투과 조명기 및 겔 문서화 시스템과 같은 제품 검출 장비를 위한 공간입니다. 이 구역에는 장갑, 실험복, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 용기 및 기타 장비가 별도로 비치되어 있어야 합니다. 로딩 염료, 분자량 마커, 아가로스 겔 및 완충액 성분을 제외한 다른 시약은 이 구역으로 반입할 수 없습니다. 시료 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
중요 사항
이상적으로는 PCR 후처리실에서 이미 작업을 마친 경우, 같은 날에는 PCR 전처리실에 들어가지 않는 것이 좋습니다. 만약 불가피한 경우라면, 손을 깨끗이 씻고 PCR 전처리실 전용 실험복을 착용해야 합니다. PCR 후처리실에서 사용한 실험 노트와 서류는 PCR 전처리실로 가져가서는 안 되며, 필요한 경우 프로토콜/샘플 ID 등의 사본을 준비하십시오.
4. 분자생물학 관련 일반적인 조언
분석 저해를 방지하기 위해 파우더가 없는 장갑을 사용하십시오. 오염을 줄이려면 올바른 피펫팅 기술이 매우 중요합니다. 잘못된 피펫팅은 액체를 분주할 때 튀거나 에어로졸을 생성할 수 있습니다. 올바른 피펫팅 방법에 대한 자세한 내용은 다음 링크를 참조하십시오. 길슨 피펫팅 가이드, 아나켐 피펫팅 기술 비디오, 튜브를 열기 전에 원심분리하고, 튀는 것을 방지하기 위해 조심스럽게 여십시오. 오염 물질 유입을 방지하기 위해 사용 후에는 즉시 튜브를 닫으십시오.
여러 반응을 동시에 수행할 경우, 시약 이동 횟수를 최소화하고 오염 위험을 줄이기 위해 공통 시약(예: 물, dNTP, 완충액, 프라이머 및 효소)을 포함하는 마스터믹스를 하나 준비하십시오. 마스터믹스는 얼음이나 콜드 블록 위에서 준비하는 것이 좋습니다. 핫 스타트 효소를 사용하면 비특이적 생성물 생성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 형광 프로브가 포함된 시약은 분해를 방지하기 위해 빛으로부터 보호하십시오.
5. 내부 통제
모든 반응에는 특성이 잘 규명되고 검증된 양성 및 음성 대조군과 무템플릿 대조군을 포함해야 하며, 정량 반응의 경우 다점 적정 추세선을 사용해야 합니다. 양성 대조군은 오염 위험을 초래할 정도로 강해서는 안 됩니다. 핵산 추출을 수행할 때는 양성 및 음성 추출 대조군을 포함해야 합니다.
각 구역에 명확한 지침을 게시하여 사용자들이 행동 수칙을 숙지할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 임상 검체에서 매우 낮은 농도의 DNA 또는 RNA를 검출하는 진단 실험실은 PCR 전처리실에는 약간의 양압을, PCR 후처리실에는 약간의 음압을 유지하는 별도의 공기 조절 시스템을 도입하는 추가적인 안전 조치를 고려할 수 있습니다.
마지막으로 품질 보증(QA) 계획을 수립하는 것이 도움이 됩니다. 이러한 계획에는 시약 원액 및 작업 시약 목록, 키트 및 시약 보관 규칙, 관리 결과 보고, 직원 교육 프로그램, 문제 해결 알고리즘, 필요시 시정 조치 등이 포함되어야 합니다.
6. 참고문헌
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게시 시간: 2020년 7월 16일
