Metodat e zbulimit molekular kanë aftësinë të prodhojnë një vëllim të madh të acidit nukleik nëpërmjet amplifikimit të sasive të gjurmëve që gjenden në mostra. Ndërsa kjo është e dobishme për të mundësuar zbulimin e ndjeshëm, ajo gjithashtu paraqet mundësinë e kontaminimit nëpërmjet përhapjes së aerosoleve të amplifikimit në mjedisin laboratorik. Gjatë kryerjes së eksperimenteve, mund të merren masa për të shmangur kontaminimin e reagentëve, pajisjeve laboratorike dhe hapësirës së stolit, pasi një kontaminim i tillë mund të gjenerojë rezultate të rreme pozitive (ose të rreme negative).
Për të ndihmuar në uljen e gjasave të kontaminimit, Praktika e Mirë Laboratorike duhet të ushtrohet në çdo kohë. Në mënyrë specifike, duhet të merren masa paraprake në lidhje me pikat e mëposhtme:
1. Trajtimi i reagentëve
2. Organizimi i hapësirës së punës dhe pajisjeve
3. Këshilla për përdorimin dhe pastrimin e hapësirës molekulare të caktuar
4. Këshilla të përgjithshme për biologjinë molekulare
5. Kontrollet e brendshme
6. Bibliografia
1. Trajtimi i reagentëve
Centrifugoni shkurtimisht tubat e reagentëve para hapjes për të shmangur gjenerimin e aerosoleve. Alikotizoni reagentët për të shmangur ngrirje-shkrirjet e shumëfishta dhe kontaminimin e stoqeve kryesore. Etiketoni dhe datoni qartë të gjithë tubat e reagentëve dhe të reaksionit dhe mbani regjistra të numrave të loteve dhe serive të reagentëve të përdorur në të gjitha eksperimentet. Pipetoni të gjithë reagentët dhe mostrat duke përdorur majat e filtrit. Përpara blerjes, këshillohet të konfirmoni me prodhuesin që majat e filtrit përputhen me markën e pipetës që do të përdoret.
2. Organizimi i hapësirës së punës dhe pajisjeve
Hapësira e punës duhet të organizohet në mënyrë të tillë që rrjedha e punës të ndodhë në një drejtim, nga zonat e pastra (para-PCR) në zonat e ndotura (pas-PCR). Masat paraprake të përgjithshme të mëposhtme do të ndihmojnë në uljen e mundësisë së kontaminimit. Të keni dhoma të veçanta të caktuara, ose të paktën zona fizikisht të ndara, për: përgatitjen e përzierjes kryesore, nxjerrjen e acidit nukleik dhe shtimin e shabllonit të ADN-së, amplifikimin dhe trajtimin e produktit të amplifikuar, si dhe analizën e produktit, p.sh. elektroforezën e xhelit.
Në disa mjedise, të kesh 4 dhoma të ndara është e vështirë. Një mundësi e mundshme, por më pak e dëshirueshme, është të bësh përgatitjen e përzierjes kryesore në një zonë të izoluar, p.sh. një kabinet me rrjedhje laminare. Në rastin e amplifikimit të PCR-së të ndërthurur, përgatitja e përzierjes kryesore për reaksionin e raundit të dytë duhet të përgatitet në zonën 'e pastër' për përgatitjen e përzierjes kryesore, por inokulimi me produktin primar të PCR-së duhet të bëhet në dhomën e amplifikimit dhe, nëse është e mundur, në një zonë të dedikuar për izolim (p.sh. një kabinet me rrjedhje laminare).
Çdo dhomë/zonë ka nevojë për një set të veçantë pipetash të etiketuara qartë, majash filtri, mbështetësesh tubash, vorbullash, centrifugash (nëse janë të nevojshme), stilolapsash, reagentësh laboratorikë gjenerikë, uniformash laboratorike dhe kutish me doreza që do të mbeten në vendet përkatëse të punës. Duart duhet të lahen dhe dorezat dhe uniformat laboratorike të ndërrohen kur lëvizni midis zonave të caktuara. Reagentët dhe pajisjet nuk duhet të zhvendosen nga një zonë e ndotur në një zonë të pastër. Nëse lind një rast ekstrem ku një reagent ose një pjesë e pajisjes duhet të zhvendoset mbrapsht, ajo duhet së pari të dekontaminohet me 10% hipoklorit natriumi, e më pas të fshihet me ujë steril.
Shënim
Tretësira 10% e hipokloritit të natriumit duhet të përgatitet e freskët çdo ditë. Kur përdoret për dekontaminim, duhet të respektohet një kohë minimale kontakti prej 10 minutash.
Si alternativë, produktet e disponueshme në treg që janë validuar si dekontaminues sipërfaqësorë që shkatërrojnë ADN-në mund të përdoren nëse rekomandimet lokale të sigurisë nuk lejojnë përdorimin e hipokloritit të natriumit ose nëse hipokloriti i natriumit nuk është i përshtatshëm për dekontaminimin e pjesëve metalike të pajisjeve.
Idealisht, stafi duhet t'i përmbahet etosit të rrjedhës së punës unidireksionale dhe të mos kthehet nga zonat e ndotura (pas-PCR) në zonat e pastra (para-PCR) në të njëjtën ditë. Megjithatë, mund të ketë raste kur kjo është e pashmangshme. Kur lind një rast i tillë, personeli duhet të kujdeset që të lajë duart plotësisht, të ndërrojë dorezat, të përdorë uniformën e laboratorit të caktuar dhe të mos fusë asnjë pajisje që do të duan ta nxjerrin përsëri nga dhoma, siç janë librat e laboratorit. Masa të tilla kontrolli duhet të theksohen në trajnimin e stafit mbi metodat molekulare.
Pas përdorimit, hapësirat e stolave duhet të pastrohen me 10% hipoklorit natriumi (i ndjekur nga ujë steril për të hequr zbardhuesin e mbetur), 70% etanol ose një dekontaminues të validuar që shkatërron ADN-në dhe është i disponueshëm në treg. Idealisht, duhet të instalohen llamba ultravjollcë (UV) për të mundësuar dekontaminimin me anë të rrezatimit. Megjithatë, përdorimi i llambave UV duhet të kufizohet në zona pune të mbyllura, p.sh. kabinete sigurie, në mënyrë që të kufizohet ekspozimi i stafit të laboratorit ndaj rrezeve UV. Ju lutemi të ndiqni udhëzimet e prodhuesit për kujdesin, ventilimin dhe pastrimin e llambave UV në mënyrë që të siguroheni që llambat të mbeten efektive.
Nëse përdorni 70% etanol në vend të hipokloritit të natriumit, do të nevojitet rrezatim me dritë UV për të përfunduar dekontaminimin.
Mos e pastroni vorteksin dhe centrifugën me hipoklorit natriumi; në vend të kësaj, fshijeni me 70% etanol dhe ekspozojeni ndaj dritës UV, ose përdorni një dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në. Për derdhjet, kontrolloni me prodhuesin për këshilla të mëtejshme për pastrimin. Nëse udhëzimet e prodhuesit e lejojnë, pipetat duhet të sterilizohen rregullisht me autoklavë. Nëse pipetat nuk mund të autoklavohen, mjafton t'i pastroni ato me 10% hipoklorit natriumi (e ndjekur nga një fshirje e plotë me ujë steril) ose me një dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në e ndjekur nga ekspozimi ndaj rrezeve UV.
Pastrimi me hipoklorit natriumi me përqindje të lartë mund të dëmtojë plastikën dhe metalet e pipetave nëse bëhet rregullisht; kontrolloni më parë rekomandimet nga prodhuesi. Të gjitha pajisjet duhet të kalibrohen rregullisht sipas orarit të rekomanduar nga prodhuesi. Një person i caktuar duhet të jetë përgjegjës për të siguruar që orari i kalibrimit të respektohet, të mbahen regjistrat e detajuar dhe etiketat e shërbimit të shfaqen qartë në pajisje.
3. Këshilla për përdorimin dhe pastrimin e hapësirës molekulare të caktuar
Para-PCR: Alikuotimi i reagentit / përgatitja e përzierjes kryesore: Kjo duhet të jetë hapësira më e pastër nga të gjitha hapësirat e përdorura për përgatitjen e eksperimenteve molekulare dhe idealisht duhet të jetë një kabinet i caktuar për rrjedhje laminare i pajisur me një dritë UV. Mostrat, acidi nukleik i nxjerrë dhe produktet e amplifikuara të PCR nuk duhet të trajtohen në këtë zonë. Reagentët e amplifikimit duhet të mbahen në një ngrirës (ose frigorifer, sipas rekomandimeve të prodhuesit) në të njëjtën hapësirë të caktuar, idealisht pranë kabinetit të rrjedhjes laminare ose zonës së para-PCR. Dorezat duhet të ndërrohen çdo herë që hyjnë në zonën e para-PCR ose kabinetit të rrjedhjes laminare.
Zona para-PCR ose kabineti i rrjedhës laminare duhet të pastrohet para dhe pas përdorimit si më poshtë: Fshini të gjitha sendet në kabinet, p.sh. pipetat, kutitë e majave, vorteksin, centrifugën, mbështetëset e tubave, stilolapsat etj., me 70% etanol ose një dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në, dhe lëreni të thahet. Në rastin e një zone pune të mbyllur, p.sh. një kabinet me rrjedhë laminare, ekspozoni kapuçin në dritën UV për 30 minuta.
Shënim
Mos i ekspozoni reagentët ndaj dritës UV; zhvendosini ato në kabinet vetëm pasi të jetë pastruar. Nëse kryeni PCR me transkriptim të kundërt, mund të jetë gjithashtu e dobishme të fshini sipërfaqet dhe pajisjet me një tretësirë që zbërthen RNazat në kontakt. Kjo mund të ndihmojë në shmangien e rezultateve të rreme negative nga degradimi enzimatik i ARN-së. Pas dekontaminimit dhe para përgatitjes së përzierjes kryesore, dorezat duhet të ndërrohen edhe një herë, dhe më pas kabineti është gati për t'u përdorur.
Para-PCR: Nxjerrja e acidit nukleik/shtimi i shabllonit:
Acidi nukleik duhet të nxirret dhe të trajtohet në një zonë të dytë të caktuar, duke përdorur një set të veçantë pipetash, majash filtrash, mbështetësesh tubash, dorezash të freskëta, uniformash laboratori dhe pajisje të tjera. Kjo zonë është gjithashtu për shtimin e shabllonit, kontrolleve dhe vijave të trendit në tubat ose pllakat e përzierjes master. Për të shmangur kontaminimin e mostrave të acidit nukleik të nxjerrë që po analizohen, rekomandohet të ndërrohen dorezat para se të trajtohen kontrollet pozitive ose standardet dhe të përdoret një set i veçantë pipetash. Reagentët PCR dhe produktet e amplifikuara nuk duhet të pipetohen në këtë zonë. Mostrat duhet të ruhen në frigoriferë ose ngrirës të caktuar në të njëjtën zonë. Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e përzierjes master.
Pas-PCR: Amplifikimi dhe trajtimi i produktit të amplifikuar
Kjo hapësirë e caktuar është për proceset pas amplifikimit dhe duhet të jetë fizikisht e ndarë nga zonat para-PCR. Zakonisht përmban termociklues dhe platforma në kohë reale, dhe idealisht duhet të ketë një kabinet me rrjedhje laminare për shtimin e produktit të PCR të raundit 1 në reaksionin e raundit 2, nëse kryhet PCR e ndërthurur. Reagentët e PCR dhe acidi nukleik i nxjerrë nuk duhet të trajtohen në këtë zonë pasi rreziku i kontaminimit është i lartë. Kjo zonë duhet të ketë një set të veçantë dorezash, uniformash laboratori, rafte pllakash dhe tubash, pipeta, maja filtrash, kosha dhe pajisje të tjera. Tubat duhet të centrifugohen para hapjes. Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e përzierjes kryesore.
Post-PCR: Analiza e produktit
Kjo dhomë është për pajisjet e zbulimit të produkteve, p.sh., rezervuarët e elektroforezës së xhelit, paketat e fuqisë, transiluminatorin UV dhe sistemin e dokumentimit të xhelit. Kjo zonë duhet të ketë grupe të veçanta dorezash, uniformash laboratori, rafte pllakash dhe tubash, pipeta, maja filtrash, kosha dhe pajisje të tjera. Asnjë reagentë tjetër nuk mund të futet në këtë zonë, përveç ngjyrës së ngarkimit, shënuesit molekular dhe xhelit të agarozës, si dhe përbërësve të tamponit. Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e përzierjes kryesore.
Shënim i rëndësishëm
Idealisht, në dhomat para-PCR nuk duhet të hyhet në të njëjtën ditë nëse puna është kryer tashmë në dhomat pas-PCR. Nëse kjo është plotësisht e pashmangshme, sigurohuni që duart të lahen më parë plotësisht dhe që të vishen uniforma specifike laboratorike në dhoma. Librat dhe dokumentet e laboratorit nuk duhen marrë në dhomat para-PCR nëse janë përdorur në dhomat pas-PCR; nëse është e nevojshme, merrni kopje të printuara të protokolleve/ID-ve të mostrave, etj.
4. Këshilla të përgjithshme për biologjinë molekulare
Përdorni doreza pa pluhur për të shmangur pengimin e analizës. Teknika e saktë e pipetimit është thelbësore për të zvogëluar kontaminimin. Pipetimi i gabuar mund të rezultojë në spërkatje gjatë shpërndarjes së lëngjeve dhe krijimin e aerosoleve. Praktikat e mira për pipetimin e saktë mund të gjenden në lidhjet e mëposhtme: Udhëzuesi Gilson për pipetimin, Videot e teknikës së pipetimit Anachem, Centrifugo tubat para hapjes dhe hapini ato me kujdes për të shmangur spërkatjen. Mbyllini tubat menjëherë pas përdorimit për të shmangur futjen e ndotësve.
Kur kryeni reaksione të shumëfishta, përgatitni një përzierje kryesore që përmban reagentë të zakonshëm (p.sh. ujë, dNTP, tampon, prajmerë dhe enzimë) për të minimizuar numrin e transferimeve të reagentëve dhe për të zvogëluar kërcënimin e kontaminimit. Rekomandohet që përzierja kryesore të vendoset në akull ose në një bllok të ftohtë. Përdorimi i një enzime Hot Start mund të ndihmojë në uljen e prodhimit të produkteve jo-specifike. Mbrojini reagentët që përmbajnë sonda fluoreshente nga drita për të shmangur degradimin.
5. Kontrollet e brendshme
Përfshini kontrolle pozitive dhe negative të karakterizuara mirë, të konfirmuara, së bashku me një kontroll pa shabllon në të gjitha reaksionet dhe një vijë trendi të titruar me shumë pika për reaksionet sasiore. Kontrolli pozitiv nuk duhet të jetë aq i fortë sa të paraqesë rrezik kontaminimi. Përfshini kontrolle pozitive dhe negative të nxjerrjes kur kryeni nxjerrjen e acidit nukleik.
Rekomandohet që udhëzime të qarta të vendosen në secilën prej zonave në mënyrë që përdoruesit të jenë të vetëdijshëm për rregullat e sjelljes. Laboratorët diagnostikues që zbulojnë nivele shumë të ulëta të ADN-së ose ARN-së në mostrat klinike mund të duan të miratojnë masën shtesë të sigurisë duke pasur sisteme të ndara të trajtimit të ajrit me presion ajri pak pozitiv në dhomat para-PCR dhe presion ajri pak negativ në dhomat pas-PCR.
Së fundmi, zhvillimi i një plani për sigurimin e cilësisë (QA) është i dobishëm. Një plan i tillë duhet të përfshijë listat e stoqeve kryesore të reagentëve dhe stoqeve të punës, rregullat për ruajtjen e kitave dhe reagentëve, raportimin e rezultateve të kontrollit, programet e trajnimit të stafit, algoritmet e zgjidhjes së problemeve dhe veprimet korrigjuese kur është e nevojshme.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitulli 3: Ngritja e një laboratori qPCR. Një dokument udhëzues për testimin e ujërave rekreative duke përdorur metodën qPCR 1611 të USEPA-s. Lansing- Universiteti Shtetëror i Miçiganit.
Shëndeti Publik i Anglisë, NHS. Standardet e Mbretërisë së Bashkuar për hetimet mikrobiologjike: Praktika e Mirë Laboratorike gjatë kryerjes së analizave të amplifikimit molekular). Udhëzime për Cilësinë. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Ngritja e një laboratori PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Mirëmbajtja rutinë e centrifugave: pastrimi, mirëmbajtja dhe dezinfektimi i centrifugave, rotorëve dhe adaptorëve (Dokumenti i Bardhë Nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Praktika e Mirë Laboratorike Klinike (GCLP) për testet molekulare të përdorura në laboratorët diagnostikues, Në: Akyar I, redaktor. Spektër i gjerë i kontrollit të cilësisë. Rijeka, Kroaci: Intech; 2011: 29–52.
Koha e postimit: 16 korrik 2020
