Các phương pháp phát hiện phân tử có khả năng tạo ra một lượng lớn axit nucleic thông qua việc khuếch đại các lượng vết tìm thấy trong mẫu. Mặc dù điều này có lợi cho việc phát hiện nhạy, nhưng nó cũng tiềm ẩn nguy cơ nhiễm bẩn do sự lan truyền của các hạt khí dung khuếch đại trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi tiến hành thí nghiệm, cần thực hiện các biện pháp để tránh nhiễm bẩn thuốc thử, thiết bị phòng thí nghiệm và không gian bàn làm việc, vì sự nhiễm bẩn như vậy có thể tạo ra kết quả dương tính giả (hoặc âm tính giả).
Để giúp giảm thiểu khả năng nhiễm bẩn, cần luôn áp dụng Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt (GLP). Cụ thể, cần thực hiện các biện pháp phòng ngừa liên quan đến các điểm sau:
1. Xử lý thuốc thử
2. Tổ chức không gian làm việc và thiết bị
3. Lời khuyên về cách sử dụng và vệ sinh cho không gian phân tử được chỉ định
4. Lời khuyên chung về sinh học phân tử
5. Kiểm soát nội bộ
6. Tài liệu tham khảo
1. Xử lý thuốc thử
Ly tâm nhanh các ống thuốc thử trước khi mở để tránh tạo ra khí dung. Chia nhỏ thuốc thử để tránh đông-rã đông nhiều lần và tránh nhiễm bẩn vào dung dịch gốc. Ghi nhãn và ghi ngày tháng rõ ràng cho tất cả các ống thuốc thử và ống phản ứng, đồng thời lưu giữ nhật ký lô thuốc thử và số lô đã sử dụng trong tất cả các thí nghiệm. Hút tất cả thuốc thử và mẫu bằng đầu lọc. Trước khi mua, nên xác nhận với nhà sản xuất xem đầu lọc có phù hợp với nhãn hiệu pipet cần sử dụng hay không.
2. Tổ chức không gian làm việc và thiết bị
Không gian làm việc cần được sắp xếp sao cho luồng công việc diễn ra theo một hướng, từ khu vực sạch (trước PCR) đến khu vực bẩn (sau PCR). Các biện pháp phòng ngừa chung sau đây sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn. Cần có các phòng riêng biệt, hoặc ít nhất là các khu vực riêng biệt về mặt vật lý, cho: chuẩn bị hỗn hợp chính, chiết xuất axit nucleic và bổ sung khuôn DNA, khuếch đại và xử lý sản phẩm khuếch đại, và phân tích sản phẩm, ví dụ như điện di trên gel.
Trong một số trường hợp, việc có 4 phòng riêng biệt là khó khăn. Một lựa chọn khả thi nhưng ít mong muốn hơn là chuẩn bị hỗn hợp chính trong một khu vực khép kín, ví dụ như tủ dòng chảy tầng. Trong trường hợp khuếch đại PCR lồng nhau, việc chuẩn bị hỗn hợp chính cho phản ứng vòng hai nên được thực hiện trong khu vực "sạch" để chuẩn bị hỗn hợp chính, nhưng việc cấy sản phẩm PCR sơ cấp nên được thực hiện trong phòng khuếch đại, và nếu có thể, trong một khu vực khép kín chuyên dụng (ví dụ như tủ dòng chảy tầng).
Mỗi phòng/khu vực cần một bộ pipet, đầu lọc, giá đỡ ống nghiệm, máy vortex, máy ly tâm (nếu có), bút, thuốc thử phòng thí nghiệm thông thường, áo khoác phòng thí nghiệm và hộp găng tay được dán nhãn rõ ràng, để tại vị trí làm việc tương ứng. Phải rửa tay và thay găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm khi di chuyển giữa các khu vực được chỉ định. Không được di chuyển thuốc thử và thiết bị từ khu vực bẩn sang khu vực sạch. Trong trường hợp nghiêm trọng cần di chuyển thuốc thử hoặc thiết bị ngược, trước tiên phải khử nhiễm bằng natri hypoclorit 10%, sau đó lau sạch bằng nước vô trùng.
Ghi chú
Dung dịch natri hypoclorit 10% phải được pha mới hàng ngày. Khi sử dụng để khử nhiễm, cần tuân thủ thời gian tiếp xúc tối thiểu là 10 phút.
Ngoài ra, có thể sử dụng các sản phẩm thương mại được chứng nhận là chất khử nhiễm bề mặt phá hủy DNA nếu khuyến nghị về an toàn tại địa phương không cho phép sử dụng natri hypoclorit hoặc nếu natri hypoclorit không thích hợp để khử nhiễm các bộ phận kim loại của thiết bị.
Tốt nhất, nhân viên nên tuân thủ quy trình làm việc một chiều và không di chuyển từ khu vực bẩn (sau PCR) trở lại khu vực sạch (trước PCR) trong cùng ngày. Tuy nhiên, có thể có những trường hợp không thể tránh khỏi việc này. Khi những trường hợp như vậy xảy ra, nhân viên phải rửa tay kỹ lưỡng, thay găng tay, mặc áo khoác phòng thí nghiệm được chỉ định và không mang bất kỳ thiết bị nào mà họ sẽ muốn mang ra khỏi phòng thí nghiệm, chẳng hạn như sách thí nghiệm. Các biện pháp kiểm soát như vậy nên được nhấn mạnh trong chương trình đào tạo nhân viên về phương pháp phân tử.
Sau khi sử dụng, cần vệ sinh mặt bàn bằng dung dịch natri hypoclorit 10% (sau đó dùng nước vô trùng để loại bỏ thuốc tẩy còn sót lại), ethanol 70%, hoặc chất khử nhiễm phá hủy DNA đã được kiểm chứng trên thị trường. Lý tưởng nhất là nên lắp đèn cực tím (UV) để khử nhiễm bằng chiếu xạ. Tuy nhiên, nên hạn chế sử dụng đèn UV trong khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ an toàn, để hạn chế tiếp xúc với tia UV của nhân viên phòng thí nghiệm. Vui lòng tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về việc bảo quản, thông gió và vệ sinh đèn UV để đảm bảo đèn luôn hoạt động hiệu quả.
Nếu sử dụng ethanol 70% thay vì natri hypoclorit, cần phải chiếu tia UV để hoàn tất quá trình khử nhiễm.
Không vệ sinh ống xoáy và máy ly tâm bằng natri hypoclorit; thay vào đó, hãy lau sạch bằng cồn 70% và chiếu tia UV, hoặc sử dụng chất khử nhiễm DNA thương mại. Nếu bị đổ, hãy tham khảo ý kiến nhà sản xuất để được hướng dẫn vệ sinh thêm. Nếu hướng dẫn của nhà sản xuất cho phép, nên khử trùng pipet thường xuyên bằng nồi hấp. Nếu không thể khử trùng pipet bằng nồi hấp, chỉ cần rửa bằng natri hypoclorit 10% (sau đó lau sạch bằng nước vô trùng) hoặc bằng chất khử nhiễm DNA thương mại, sau đó chiếu tia UV.
Việc vệ sinh bằng natri hypoclorit nồng độ cao có thể làm hỏng nhựa và kim loại của pipet nếu thực hiện thường xuyên; hãy kiểm tra khuyến nghị của nhà sản xuất trước. Tất cả thiết bị cần được hiệu chuẩn thường xuyên theo lịch trình do nhà sản xuất khuyến nghị. Cần có người được chỉ định chịu trách nhiệm đảm bảo tuân thủ lịch trình hiệu chuẩn, ghi chép nhật ký chi tiết và dán nhãn dịch vụ rõ ràng trên thiết bị.
3. Lời khuyên về cách sử dụng và vệ sinh cho không gian phân tử được chỉ định
Tiền PCR: Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử/hỗn hợp mastermix: Đây phải là không gian sạch nhất được sử dụng để chuẩn bị các thí nghiệm phân tử và lý tưởng nhất là tủ dòng chảy tầng được trang bị đèn UV. Không được xử lý mẫu, axit nucleic chiết xuất và sản phẩm PCR khuếch đại trong khu vực này. Thuốc thử khuếch đại phải được bảo quản trong tủ đông (hoặc tủ lạnh, theo khuyến nghị của nhà sản xuất) trong cùng không gian được chỉ định, lý tưởng nhất là bên cạnh tủ dòng chảy tầng hoặc khu vực tiền PCR. Cần thay găng tay mỗi lần vào khu vực tiền PCR hoặc tủ dòng chảy tầng.
Khu vực tiền PCR hoặc tủ dòng chảy tầng cần được vệ sinh trước và sau khi sử dụng như sau: Lau sạch tất cả các vật dụng trong tủ, ví dụ như pipet, hộp đựng tip, máy vortex, máy ly tâm, giá đỡ ống, bút, v.v. bằng cồn 70% hoặc chất khử nhiễm DNA thương mại, và để khô. Trong trường hợp khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ dòng chảy tầng, hãy chiếu đèn UV vào tủ hút trong 30 phút.
Ghi chú
Không để thuốc thử tiếp xúc với tia UV; chỉ chuyển thuốc thử vào tủ sau khi tủ đã sạch. Nếu thực hiện PCR phiên mã ngược, việc lau sạch bề mặt và thiết bị bằng dung dịch có khả năng phân hủy RNase khi tiếp xúc cũng có thể hữu ích. Điều này có thể giúp tránh kết quả âm tính giả do enzyme phân hủy RNA. Sau khi khử nhiễm và trước khi chuẩn bị hỗn hợp mastermix, nên thay găng tay một lần nữa, sau đó tủ đã sẵn sàng để sử dụng.
Tiền PCR: Chiết xuất axit nucleic/thêm khuôn mẫu:
Axit nucleic phải được chiết xuất và xử lý tại một khu vực được chỉ định khác, sử dụng một bộ pipet, đầu lọc, giá đỡ ống nghiệm, găng tay sạch, áo khoác phòng thí nghiệm và các thiết bị khác riêng. Khu vực này cũng dành cho việc thêm khuôn mẫu, mẫu đối chứng và đường xu hướng vào các ống hoặc đĩa mastermix. Để tránh nhiễm bẩn các mẫu axit nucleic đã chiết xuất đang được phân tích, khuyến nghị thay găng tay trước khi xử lý mẫu đối chứng dương tính hoặc mẫu chuẩn và sử dụng một bộ pipet riêng. Không được hút thuốc thử PCR và sản phẩm khuếch đại tại khu vực này. Mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đông được chỉ định trong cùng khu vực. Khu vực làm việc của mẫu phải được vệ sinh tương tự như khu vực mastermix.
Hậu PCR: Khuếch đại và xử lý sản phẩm khuếch đại
Khu vực này dành cho các quy trình hậu khuếch đại và cần được tách biệt về mặt vật lý với khu vực tiền PCR. Khu vực này thường chứa các máy luân nhiệt và nền tảng thời gian thực, và lý tưởng nhất là nên có tủ dòng chảy tầng để thêm sản phẩm PCR vòng 1 vào phản ứng vòng 2, nếu thực hiện PCR lồng nhau. Không được xử lý thuốc thử PCR và axit nucleic chiết xuất trong khu vực này vì nguy cơ nhiễm bẩn cao. Khu vực này cần có một bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống, pipet, đầu lọc, thùng chứa và các thiết bị khác riêng biệt. Các ống phải được ly tâm trước khi mở. Khu vực làm việc của mẫu nên được vệ sinh tương tự như khu vực mastermix.
Sau PCR: Phân tích sản phẩm
Phòng này dành cho các thiết bị phát hiện sản phẩm, ví dụ như bể điện di gel, bộ nguồn, đèn chiếu tia UV và hệ thống ghi chép gel. Khu vực này cần có bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống, pipet, đầu lọc, thùng chứa và các thiết bị khác riêng biệt. Không được mang bất kỳ thuốc thử nào khác vào khu vực này, ngoại trừ thuốc nhuộm tải, marker phân tử, gel agarose và các thành phần đệm. Khu vực làm việc của mẫu cần được vệ sinh tương tự như khu vực mastermix.
Lưu ý quan trọng
Lý tưởng nhất là không nên vào phòng tiền PCR trong cùng ngày nếu công việc đã được thực hiện ở phòng hậu PCR. Nếu điều này là hoàn toàn không thể tránh khỏi, hãy đảm bảo rửa tay kỹ lưỡng trước và mặc áo khoác phòng thí nghiệm chuyên dụng trong phòng. Không được mang sổ sách và giấy tờ phòng thí nghiệm vào phòng tiền PCR nếu chúng đã được sử dụng ở phòng hậu PCR; nếu cần, hãy mang theo bản in các giao thức/mã số mẫu, v.v.
4. Lời khuyên chung về sinh học phân tử
Sử dụng găng tay không bột để tránh ức chế xét nghiệm. Kỹ thuật hút mẫu đúng là tối quan trọng để giảm thiểu ô nhiễm. Hút mẫu không đúng cách có thể dẫn đến bắn chất lỏng khi phân phối và tạo ra khí dung. Bạn có thể tìm thấy hướng dẫn thực hành hút mẫu đúng cách tại các liên kết sau: Hướng dẫn hút mẫu của Gilson, Video kỹ thuật hút mẫu của Anachem, Ly tâm ống nghiệm trước khi mở và mở cẩn thận để tránh bắn chất bẩn. Đóng ống nghiệm ngay sau khi sử dụng để tránh nhiễm bẩn.
Khi thực hiện nhiều phản ứng, hãy chuẩn bị một hỗn hợp mastermix chứa các thuốc thử thông dụng (ví dụ: nước, dNTP, đệm, mồi và enzyme) để giảm thiểu số lần chuyển thuốc thử và giảm nguy cơ nhiễm bẩn. Nên bảo quản hỗn hợp mastermix trên đá hoặc khối lạnh. Sử dụng enzyme Khởi động nóng có thể giúp giảm việc tạo ra các sản phẩm không đặc hiệu. Bảo vệ thuốc thử chứa đầu dò huỳnh quang khỏi ánh sáng để tránh bị phân hủy.
5. Kiểm soát nội bộ
Bao gồm các mẫu đối chứng dương tính và âm tính đã được xác nhận, được mô tả rõ ràng, cùng với mẫu đối chứng không có khuôn mẫu trong tất cả các phản ứng và đường xu hướng chuẩn độ đa điểm cho các phản ứng định lượng. Mẫu đối chứng dương tính không nên quá mạnh đến mức gây ra nguy cơ nhiễm bẩn. Bao gồm mẫu đối chứng dương tính và âm tính khi thực hiện chiết xuất axit nucleic.
Khuyến nghị nên dán hướng dẫn rõ ràng ở mỗi khu vực để người dùng nắm rõ quy tắc ứng xử. Các phòng xét nghiệm chẩn đoán phát hiện nồng độ DNA hoặc RNA rất thấp trong các mẫu lâm sàng có thể cần áp dụng biện pháp an ninh bổ sung bằng cách lắp đặt hệ thống xử lý không khí riêng biệt với áp suất không khí hơi dương trong phòng trước PCR và hơi âm trong phòng sau PCR.
Cuối cùng, việc xây dựng kế hoạch đảm bảo chất lượng (QA) rất hữu ích. Kế hoạch này nên bao gồm danh sách thuốc thử dự trữ và thuốc thử làm việc, quy tắc bảo quản bộ dụng cụ và thuốc thử, báo cáo kết quả kiểm soát, chương trình đào tạo nhân viên, thuật toán xử lý sự cố và các biện pháp khắc phục khi cần thiết.
6. Tài liệu tham khảo
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chương 3: Thiết lập phòng thí nghiệm qPCR. Tài liệu hướng dẫn xét nghiệm nước giải trí bằng phương pháp qPCR 1611 của USEPA. Lansing - Đại học Bang Michigan.
Cơ quan Y tế Công cộng Anh, NHS. Tiêu chuẩn của Vương quốc Anh về các cuộc điều tra vi sinh: Thực hành phòng thí nghiệm tốt khi thực hiện xét nghiệm khuếch đại phân tử). Hướng dẫn chất lượng. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Thiết lập phòng thí nghiệm PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Bảo trì định kỳ máy ly tâm: vệ sinh, bảo trì và khử trùng máy ly tâm, rotor và bộ chuyển đổi (Sách trắng số 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Thực hành Phòng xét nghiệm Lâm sàng Tốt (GCLP) cho các xét nghiệm phân tử được sử dụng trong phòng xét nghiệm chẩn đoán, Trong: Akyar I, biên tập viên. Phổ rộng của kiểm soát chất lượng. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Thời gian đăng: 16-07-2020
