Metòd deteksyon molekilè yo gen kapasite pou pwodui yon gwo volim asid nikleyik atravè anplifikasyon kantite tras yo jwenn nan echantiyon yo. Pandan ke sa a benefik pou pèmèt yon deteksyon sansib, li prezante tou posibilite kontaminasyon atravè pwopagasyon ayewosòl anplifikasyon nan anviwònman laboratwa a. Lè w ap fè eksperyans, yo ka pran mezi pou evite kontaminasyon reyaktif yo, ekipman laboratwa a ak espas ki sou ban an, paske kontaminasyon sa a ka jenere rezilta fo pozitif (oswa fo negatif).
Pou ede diminye chans pou kontaminasyon, yo ta dwe toujou aplike Bon Pratik Laboratwa. Espesyalman, yo ta dwe pran prekosyon konsènan pwen sa yo:
1. Manyen reyaktif yo
2. Òganizasyon espas travay ak ekipman yo
3. Konsèy pou itilizasyon ak netwayaj pou espas molekilè ki deziyen an
4. Konsèy jeneral sou byoloji molekilè
5. Kontwòl entèn yo
6. Bibliyografi
1. Manyen reyaktif yo
Santrifije tib reyaktif yo yon ti tan anvan ou louvri yo pou evite jenerasyon ayewosòl. Mete reyaktif yo nan alikòt pou evite plizyè konjelasyon-dekonjelasyon ak kontaminasyon rezèv prensipal yo. Mete etikèt aklè sou tout tib reyaktif ak reyaksyon yo epi kenbe yon jounal sou nimewo lo ak pakèt reyaktif yo te itilize nan tout eksperyans yo. Pipete tout reyaktif ak echantiyon yo lè l sèvi avèk pwent filtè yo. Anvan ou achte, li rekòmande pou konfime ak manifakti a ke pwent filtè yo anfòm ak mak pipèt ou pral itilize a.
2. Òganizasyon espas travay ak ekipman yo
Espas travay la ta dwe òganize pou asire ke travay la ap fèt nan yon sèl direksyon, soti nan zòn pwòp yo (anvan PCR) rive nan zòn sal yo (apre PCR). Prekosyon jeneral sa yo ap ede diminye chans kontaminasyon. Fè chanm apa, oubyen omwen zòn fizikman separe, pou: preparasyon mastermix, ekstraksyon asid nikleyik ak adisyon modèl ADN, anplifikasyon ak manipilasyon pwodwi anplifye a, ak analiz pwodwi, pa egzanp elektwoforèz jèl.
Nan kèk anviwònman, li difisil pou gen 4 chanm separe. Yon opsyon posib men mwens dezirab se fè preparasyon mastermix la nan yon zòn kontwòl, pa egzanp yon kabinè koule laminè. Nan ka anplifikasyon PCR entegre, preparasyon mastermix la pou dezyèm reyaksyon wonn nan ta dwe prepare nan zòn 'pwòp' la pou preparasyon mastermix la, men inokilasyon an ak pwodwi PCR prensipal la ta dwe fèt nan chanm anplifikasyon an, epi si posib nan yon zòn kontwòl dedye (pa egzanp yon kabinè koule laminè).
Chak chanm/zòn bezwen yon seri pipèt, pwent filt, etajè tib, vortex, santrifij (si sa nesesè), plim, reyaktif laboratwa jenerik, rad laboratwa ak bwat gan apa ki byen make. Y ap rete nan estasyon travay respektif yo. Fòk lave men yo epi chanje gan ak rad laboratwa lè w ap deplase ant zòn ki deziyen yo. Pa dwe deplase reyaktif ak ekipman soti nan yon zòn sal pou ale nan yon zòn pwòp. Si yon ka ekstrèm rive kote yon reyaktif oswa yon ekipman bezwen deplase pa dèyè, fòk dekontamine li anvan ak 10% ipoklorit sodyòm, epi answit siye li ak dlo esteril.
Nòt
Fòk ou prepare solisyon ipoklorit sodyòm 10% lan chak jou. Lè w ap itilize li pou dekontaminasyon, ou dwe respekte yon tan kontak minimòm 10 minit.
Yon lòt opsyon se si rekòmandasyon sekirite lokal yo pa pèmèt itilizasyon ipoklorit sodyòm oswa si ipoklorit sodyòm pa apwopriye pou dekontamine pati metalik ekipman yo, ou ka itilize pwodui ki disponib nan komès epi ki valide kòm dekontamine sifas ki detwi ADN.
Idealman, anplwaye yo ta dwe respekte prensip koule travay inidireksyonèl la epi yo pa ta dwe soti nan zòn sal yo (apre PCR) tounen nan zòn pwòp yo (anvan PCR) nan menm jou a. Sepandan, ka gen okazyon kote sa inevitab. Lè yon okazyon konsa rive, pèsonèl yo dwe pran prekosyon pou yo byen lave men yo, chanje gan yo, mete rad laboratwa ki apwopriye a epi pa mete okenn ekipman yo ta vle pote soti nan sal la ankò, tankou liv laboratwa. Yo ta dwe mete aksan sou mezi kontwòl sa yo nan fòmasyon anplwaye yo sou metòd molekilè yo.
Apre w fin itilize yo, ou ta dwe netwaye espas ki sou ban yo ak 10% ipoklorit sodyòm (epi sèvi ak dlo esteril pou retire klowòks ki rete a), 70% etanòl, oubyen yon dekontaminan ki detwi ADN ki disponib nan komès. Idealman, ou ta dwe enstale lanp iltravyolèt (UV) pou pèmèt dekontaminasyon pa iradyasyon. Sepandan, ou ta dwe limite itilizasyon lanp UV yo nan zòn travay ki fèmen, pa egzanp kabinèt sekirite, pou limite ekspozisyon anplwaye laboratwa a nan reyon UV. Tanpri swiv enstriksyon manifakti a pou antretyen, vantilasyon ak netwayaj lanp UV pou asire ke lanp yo rete efikas.
Si w ap itilize 70% etanòl olye de ipoklorit sodyòm, w ap bezwen iradyasyon ak limyè UV pou konplete dekontaminasyon an.
Pa netwaye vortex la ak santrifij la ak ipoklorit sodyòm; olye de sa, siye ak etanòl 70% epi ekspoze a limyè UV, oswa itilize yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN. Pou debòdman, tcheke avèk manifakti a pou plis konsèy sou netwayaj. Si enstriksyon manifakti a pèmèt sa, pipèt yo ta dwe esterilize regilyèman nan otoklav. Si pipèt yo pa ka otoklave, li ta dwe sifi pou netwaye yo ak ipoklorit sodyòm 10% (ki te swiv pa yon siye byen ak dlo esteril) oswa ak yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN epi ekspoze a limyè UV.
Netwayaj ak ipoklorit sodyòm ki gen yon gwo pousantaj ka evantyèlman domaje plastik ak metal pipèt yo si yo fè l regilyèman; tcheke rekòmandasyon manifakti a an premye. Tout ekipman yo bezwen kalibre regilyèman dapre orè rekòmande pa manifakti a. Yon moun deziyen ta dwe responsab pou asire ke orè kalibrasyon an respekte, ke jounal detaye yo kenbe, epi ke etikèt sèvis yo byen klè sou ekipman yo.
3. Konsèy pou itilizasyon ak netwayaj pou espas molekilè ki deziyen an
Pre-PCR: Alikòt reyaktif / preparasyon mastermelanj: Sa a ta dwe espas ki pi pwòp nan tout espas yo itilize pou preparasyon eksperyans molekilè yo epi li ta dwe ideyalman yon kabinè koule laminè ekipe ak yon limyè UV. Echantiyon yo, asid nikleyik ki ekstrè yo ak pwodwi PCR anplifye yo pa dwe manyen nan zòn sa a. Reyaktif anplifikasyon yo ta dwe konsève nan yon frizè (oswa frijidè, dapre rekòmandasyon manifakti a) nan menm espas ki deziyen an, idealman akote kabinè koule laminè a oswa zòn pre-PCR la. Gan yo ta dwe chanje chak fwa lè w antre nan zòn pre-PCR a oswa kabinè koule laminè a.
Yo ta dwe netwaye zòn pre-PCR a oswa kabinè koule laminè a anvan ak apre yo fin itilize li jan sa a: Siye tout bagay ki nan kabinè a, pa egzanp pipèt, bwat pwent, vortex, santrifij, etajè tib, plim, elatriye avèk 70% etanòl oswa yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN, epi kite yo sèk. Nan ka yon zòn travay fèmen, pa egzanp yon kabinè koule laminè, ekspoze kapo a nan limyè UV pandan 30 minit.
Nòt
Pa ekspoze reyaktif yo a limyè UV; sèlman deplase yo nan kabinèt la lè li pwòp. Si w ap fè PCR transkripsyon envès, li ka itil tou pou siye sifas yo ak ekipman yo ak yon solisyon ki kraze RNaz yo lè yo antre an kontak. Sa ka ede evite rezilta fo negatif ki soti nan degradasyon anzim ARN lan. Apre dekontaminasyon an epi anvan ou prepare melanj prensipal la, ou ta dwe chanje gan yo ankò, epi kabinèt la pare pou itilize.
Pre-PCR: Ekstraksyon asid nikleyik/adisyon modèl:
Yo dwe ekstrè epi manyen asid nikleyik la nan yon dezyèm zòn ki deziyen pou sa, lè l sèvi avèk yon seri pipèt apa, pwent filtè, etajè tib, gan pwòp, rad laboratwa ak lòt ekipman. Zòn sa a la tou pou ajoute modèl, kontwòl ak liy tandans nan tib oswa plak mastermix yo. Pou evite kontaminasyon echantiyon asid nikleyik yo te ekstrè k ap analize yo, li rekòmande pou chanje gan anvan ou manyen kontwòl pozitif oswa estanda epi pou itilize yon seri pipèt apa. Pa dwe pipete reyaktif PCR ak pwodwi anplifye nan zòn sa a. Echantiyon yo ta dwe estoke nan frijidè oswa frizè ki deziyen pou sa nan menm zòn nan. Yo ta dwe netwaye espas travay echantiyon an menm jan ak espas mastermix la.
Apre PCR: Anplifikasyon ak manipilasyon pwodwi anplifye a
Espas sa a se pou pwosesis pòs-anplifikasyon epi li ta dwe fizikman separe de zòn pre-PCR yo. Li anjeneral gen ladan l tèmosiklè ak platfòm an tan reyèl, epi idealman li ta dwe gen yon kabinè koule laminè pou ajoute pwodwi PCR wonn 1 an nan reyaksyon wonn 2 a, si y ap fè PCR entegre. Pa dwe manyen reyaktif PCR yo ak asid nikleyik ki te ekstrè nan zòn sa a paske risk kontaminasyon an wo. Zòn sa a ta dwe gen yon seri gan apa, rad laboratwa, etajè plak ak tib, pipèt, pwent filtè, bwat ak lòt ekipman. Tib yo dwe santrifije anvan yo louvri yo. Espas travay echantiyon an ta dwe netwaye menm jan ak espas melanj prensipal la.
Apre PCR: Analiz pwodwi
Sal sa a se pou ekipman deteksyon pwodwi, pa egzanp tank elektwoforèz jèl, pake pouvwa, transililuminatè UV ak sistèm dokimantasyon jèl la. Zòn sa a ta dwe gen seri gan separe, rad laboratwa, etajè plak ak tib, pipèt, pwent filtè, bwat ak lòt ekipman. Pa gen okenn lòt reyaktif ki ka antre nan zòn sa a, eksepte lank chajman, makè molekilè ak jèl agaroz, ak konpozan tampon. Espas travay echantiyon an ta dwe netwaye menm jan ak espas mastermix la.
Nòt enpòtan
Idealman, moun pa ta dwe antre nan chanm pre-PCR yo nan menm jou a si yo te deja fè travay nan chanm post-PCR yo. Si sa pa ka evite ditou, asire w ke men yo byen lave anvan epi ke moun nan mete rad laboratwa espesifik nan chanm yo. Pa dwe gen liv ak papye laboratwa nan chanm pre-PCR yo si yo te itilize yo nan chanm post-PCR yo; si sa nesesè, pran kopi pwotokòl/ID echantiyon yo, elatriye.
4. Konsèy jeneral sou byoloji molekilè
Sèvi ak gan ki pa gen poud pou evite anpèchman nan tès la. Teknik pipete ki kòrèk la esansyèl pou diminye kontaminasyon. Pipete ki pa kòrèk ka lakòz pwojeksyon lè w ap bay likid epi kreyasyon ayewosòl. Ou ka jwenn bon pratik pou pipete kòrèk nan lyen sa yo: Gid Gilson pou pipete, Videyo teknik pipete Anachem, Tib santrifij anvan ou louvri yo, epi louvri yo ak anpil atansyon pou evite pwojeksyon. Fèmen tib yo imedyatman apre w fin itilize yo pou evite entwodiksyon kontaminan.
Lè w ap fè plizyè reyaksyon, prepare yon sèl melanj prensipal ki gen reyaktif komen (pa egzanp dlo, dNTP, tanpon, primè ak anzim) pou minimize kantite transfè reyaktif epi diminye menas kontaminasyon. Li rekòmande pou mete melanj prensipal la sou glas oswa yon blòk frèt. Itilizasyon yon anzim Hot Start ka ede diminye pwodiksyon pwodwi ki pa espesifik. Pwoteje reyaktif ki gen sond fliyoresan yo kont limyè pou evite degradasyon.
5. Kontwòl entèn yo
Mete ladan yo kontwòl pozitif ak negatif byen karakterize ak konfime, ansanm ak yon kontwòl san modèl nan tout reyaksyon yo, epi yon liy tandans titrasyon plizyè pwen pou reyaksyon kantitatif yo. Kontwòl pozitif la pa ta dwe tèlman fò ke li poze yon risk kontaminasyon. Mete ladan yo kontwòl ekstraksyon pozitif ak negatif lè w ap fè ekstraksyon asid nikleyik.
Li rekòmande pou yo afiche enstriksyon klè nan chak zòn pou itilizatè yo ka okouran de règ konduit yo. Laboratwa dyagnostik ki detekte nivo ADN oswa ARN ki trè ba nan echantiyon klinik yo ka vle adopte mezi sekirite adisyonèl pou gen sistèm tretman lè separe ak yon presyon lè ki yon ti jan pozitif nan chanm pre-PCR yo ak yon presyon lè ki yon ti jan negatif nan chanm post-PCR yo.
Finalman, devlope yon plan asirans kalite (QA) itil. Yon plan konsa ta dwe gen ladan lis rezèv prensipal reyaktif ak rezèv travay, règ pou estoke twous ak reyaktif, rapò rezilta kontwòl yo, pwogram fòmasyon anplwaye yo, algoritm depanaj, ak aksyon korektif lè sa nesesè.
6. Bibliyografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chapit 3: Mete kanpe yon laboratwa qPCR. Yon dokiman gid pou teste dlo rekreyasyonèl lè l sèvi avèk metòd USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.
Sante Piblik Angletè, NHS. Nòm Wayòm Ini pou envestigasyon mikwobyoloji: Bon Pratik Laboratwa lè w ap fè tès anplifikasyon molekilè). Gid Kalite. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Mete sou pye yon laboratwa PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Antretyen woutin santrifij yo: netwayaj, antretyen ak dezenfeksyon santrifij, rotor ak adaptè (Liv blan No 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bon Pratik Laboratwa Klinik (GCLP) pou tès molekilè yo itilize nan laboratwa dyagnostik, Nan: Akyar I, editè. Wide spectre of quality control. Rijeka, Kwoasi: Intech; 2011: 29–52.
Dat piblikasyon: 16 Jiyè 2020
