Molekylära detektionsmetoder har förmågan att producera en stor volym nukleinsyra genom amplifiering av spårmängder som finns i prover. Även om detta är fördelaktigt för att möjliggöra känslig detektion, introducerar det också möjligheten till kontaminering genom spridning av amplifieringsaerosoler i laboratoriemiljön. Vid utförande av experiment kan åtgärder vidtas för att undvika kontaminering av reagenser, laboratorieutrustning och bänkutrymme, eftersom sådan kontaminering kan generera falskt positiva (eller falskt negativa) resultat.
För att minska sannolikheten för kontaminering bör god laboratoriesed alltid tillämpas. Specifikt bör försiktighetsåtgärder vidtas avseende följande punkter:
1. Hantering av reagenser
2. Organisering av arbetsyta och utrustning
3. Användnings- och rengöringsråd för det avsedda molekylära utrymmet
4. Allmänna råd om molekylärbiologi
5. Interna kontroller
6. Bibliografi
1. Hantering av reagenser
Centrifugera reagensrören kort innan de öppnas för att undvika aerosoler. Alikvotera reagens för att undvika upprepad frysning och upptining och kontaminering av masterstockar. Märk och datera alla reagens- och reaktionsrör tydligt och för logg över reagensparti- och batchnummer som använts i alla experiment. Pipettera alla reagens och prover med filterspetsar. Innan köp är det lämpligt att bekräfta med tillverkaren att filterspetsarna passar det pipettmärke som ska användas.
2. Organisering av arbetsyta och utrustning
Arbetsutrymmet bör organiseras så att arbetsflödet sker i en riktning, från rena områden (före PCR) till smutsiga områden (efter PCR). Följande allmänna försiktighetsåtgärder bidrar till att minska risken för kontaminering. Ha separata avsedda rum, eller åtminstone fysiskt separerade områden, för: mastermixberedning, nukleinsyraextraktion och tillsats av DNA-mall, amplifiering och hantering av amplifierad produkt, och produktanalys, t.ex. gelelektrofores.
I vissa miljöer är det svårt att ha fyra separata rum. Ett möjligt men mindre önskvärt alternativ är att göra mastermixberedning i ett inneslutningsområde, t.ex. ett laminärt flödesskåp. Vid kapslad PCR-amplifiering bör beredningen av mastermixen för den andra omgången av reaktionen beredas i det "rena" området för mastermixberedning, men inokuleringen med den primära PCR-produkten bör göras i amplifieringsrummet, och om möjligt i ett dedikerat inneslutningsområde (t.ex. ett laminärt flödesskåp).
Varje rum/område behöver en separat uppsättning tydligt märkta pipetter, filterspetsar, rörställ, virvelrör, centrifuger (om relevant), pennor, generiska laboratoriereagenser, laboratorierockar och lådor med handskar som kommer att finnas kvar vid respektive arbetsstation. Händer måste tvättas och handskar och laboratorierockar bytas vid förflyttning mellan de angivna områdena. Reagenser och utrustning bör inte flyttas från ett smutsigt område till ett rent område. Om ett extremt fall uppstår där ett reagens eller en utrustningsdel behöver flyttas bakåt, måste den först dekontamineras med 10 % natriumhypoklorit, följt av avtorkning med sterilt vatten.
Notera
10 % natriumhypokloritlösning måste göras färsk dagligen. Vid användning för dekontaminering bör en kontakttid på minst 10 minuter iakttas.
Alternativt kan kommersiellt tillgängliga produkter som är validerade som DNA-förstörande ytdekontamineringsmedel användas om lokala säkerhetsrekommendationer inte tillåter användning av natriumhypoklorit eller om natriumhypoklorit inte är lämpligt för dekontaminering av metalldelar i utrustning.
Helst bör personalen följa principen om enkelriktad arbetsgång och inte gå tillbaka från smutsiga områden (efter PCR) till rena områden (före PCR) samma dag. Det kan dock finnas tillfällen då detta är oundvikligt. När ett sådant tillfälle uppstår måste personalen se till att tvätta händerna noggrant, byta handskar, använda den avsedda laboratorierocken och inte föra in någon utrustning som de vill ta ut ur rummet igen, såsom labböcker. Sådana kontrollåtgärder bör betonas i personalens utbildning om molekylära metoder.
Efter användning bör arbetsbänkarna rengöras med 10 % natriumhypoklorit (följt av sterilt vatten för att avlägsna kvarvarande blekmedel), 70 % etanol eller ett validerat kommersiellt tillgängligt DNA-förstörande dekontamineringsmedel. Helst bör ultravioletta (UV) lampor monteras för att möjliggöra dekontaminering genom bestrålning. Användningen av UV-lampor bör dock begränsas till slutna arbetsområden, t.ex. säkerhetsskåp, för att begränsa laboratoriepersonalens UV-exponering. Följ tillverkarens instruktioner för skötsel, ventilation och rengöring av UV-lampor för att säkerställa att lamporna förblir effektiva.
Om 70 % etanol används istället för natriumhypoklorit krävs bestrålning med UV-ljus för att slutföra dekontamineringen.
Rengör inte virveln och centrifugen med natriumhypoklorit; torka istället av med 70 % etanol och exponera för UV-ljus, eller använd ett kommersiellt DNA-förstörande dekontamineringsmedel. Vid spill, kontakta tillverkaren för ytterligare rengöringsråd. Om tillverkarens instruktioner tillåter det bör pipetter rutinmässigt steriliseras med autoklav. Om pipetter inte kan autoklaveras bör det räcka att rengöra dem med 10 % natriumhypoklorit (följt av en noggrann avtorkning med sterilt vatten) eller med ett kommersiellt DNA-förstörande dekontamineringsmedel följt av UV-exponering.
Rengöring med högprocentig natriumhypoklorit kan så småningom skada pipettens plast och metaller om det görs regelbundet; kontrollera tillverkarens rekommendationer först. All utrustning måste kalibreras regelbundet enligt tillverkarens rekommenderade schema. En utsedd person bör ansvara för att kalibreringsschemat följs, att detaljerade loggar förs och att serviceetiketter är tydligt synliga på utrustningen.
3. Användnings- och rengöringsråd för det avsedda molekylära utrymmet
Pre-PCR: Reagensalikvotering / mastermixberedning: Detta bör vara det renaste av alla utrymmen som används för beredning av molekylära experiment och bör helst vara ett avsett laminärt flödesskåp utrustat med UV-ljus. Prover, extraherad nukleinsyra och amplifierade PCR-produkter får inte hanteras i detta område. Amplifieringsreagens bör förvaras i en frys (eller kylskåp, enligt tillverkarens rekommendationer) i samma avsedda utrymme, helst bredvid laminärt flödesskåpet eller pre-PCR-området. Handskar bör bytas varje gång man går in i pre-PCR-området eller laminärt flödesskåpet.
Pre-PCR-området eller laminärflödesskåpet bör rengöras före och efter användning enligt följande: Torka av alla föremål i skåpet, t.ex. pipetter, spetslådor, vortex, centrifug, rörställ, pennor etc. med 70 % etanol eller ett kommersiellt DNA-förstörande dekontamineringsmedel och låt torka. Vid ett slutet arbetsområde, t.ex. ett laminärflödesskåp, exponera huven för UV-ljus i 30 minuter.
Notera
Utsätt inte reagenser för UV-ljus; flytta dem inte in i skåpet förrän det är rent. Om du utför omvänd transkriptions-PCR kan det också vara bra att torka av ytor och utrustning med en lösning som bryter ner RNaser vid kontakt. Detta kan bidra till att undvika falskt negativa resultat från enzymnedbrytning av RNA. Efter dekontaminering och innan mastermixen bereds bör handskarna bytas igen, och sedan är skåpet klart att användas.
Pre-PCR: Nukleinsyraextraktion/malltillsats:
Nukleinsyra måste extraheras och hanteras i ett annat avsett område med hjälp av en separat uppsättning pipetter, filterspetsar, rörställ, rena handskar, laboratorierockar och annan utrustning. Detta område är också avsett för tillsats av mall, kontroller och trendlinjer till mastermixrören eller plattorna. För att undvika kontaminering av de extraherade nukleinsyraproverna som analyseras rekommenderas det att byta handskar innan positiva kontroller eller standarder hanteras och att använda en separat uppsättning pipetter. PCR-reagens och amplifierade produkter får inte pipetteras i detta område. Prover bör förvaras i avsedda kyl- eller frysrum i samma område. Provarbetsytan bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.
Post-PCR: Amplifiering och hantering av den amplifierade produkten
Detta avsedda utrymme är avsett för postamplifieringsprocesser och bör vara fysiskt avskilt från områdena före PCR. Det innehåller vanligtvis termocykler och realtidsplattformar, och bör helst ha ett laminärt flödesskåp för att tillsätta PCR-produkten från runda 1 till reaktionen från runda 2, om kapslad PCR utförs. PCR-reagens och extraherad nukleinsyra får inte hanteras i detta område eftersom risken för kontaminering är hög. Detta område bör ha en separat uppsättning handskar, laboratorierockar, platt- och rörställ, pipetter, filterspetsar, behållare och annan utrustning. Rören måste centrifugeras innan de öppnas. Provarbetsytan bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.
Post-PCR: Produktanalys
Detta rum är avsett för produktdetekteringsutrustning, t.ex. gelelektroforesbehållare, nätaggregat, UV-transilluminator och geldokumentationssystem. Detta område bör ha separata uppsättningar handskar, laboratorierockar, platt- och rörställ, pipetter, filterspetsar, behållare och annan utrustning. Inga andra reagenser får föras in i detta område, förutom laddningsfärgämne, molekylär markör och agarosgel, samt buffertkomponenter. Provarbetsytan bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.
Viktig anmärkning
Helst bör man inte gå in i pre-PCR-rummen samma dag som arbete redan har utförts i post-PCR-rummen. Om detta är helt oundvikligt, se till att händerna först tvättas noggrant och att specifika labrockar bärs i rummen. Labböcker och dokumentation får inte tas med in i pre-PCR-rummen om de har använts i post-PCR-rummen; vid behov, ta kopior av protokoll/prov-ID etc.
4. Allmänna råd om molekylärbiologi
Använd puderfria handskar för att undvika hämning av assayen. Korrekt pipetteringsteknik är avgörande för att minska kontaminering. Felaktig pipettering kan leda till stänk vid dispensering av vätskor och bildning av aerosoler. God praxis för korrekt pipettering finns på följande länkar: Gilson-guide till pipettering, Anachem-pipetteringsteknikvideor, Centrifugera rören innan de öppnas och öppna dem försiktigt för att undvika stänk. Stäng rören omedelbart efter användning för att undvika att föroreningar införs.
När du utför flera reaktioner, förbered en mastermix som innehåller gemensamma reagens (t.ex. vatten, dNTP, buffert, primers och enzym) för att minimera antalet reagensöverföringar och minska risken för kontaminering. Det rekommenderas att ställa in mastermixen på is eller ett kallt block. Användning av ett Hot Start-enzym kan bidra till att minska produktionen av ospecifika produkter. Skydda reagens som innehåller fluorescerande prober från ljus för att undvika nedbrytning.
5. Interna kontroller
Inkludera välkarakteriserade, bekräftade positiva och negativa kontroller, tillsammans med en kontroll utan mall i alla reaktioner, och en titrerad trendlinje med flera punkter för kvantitativa reaktioner. Den positiva kontrollen bör inte vara så stark att den utgör en kontamineringsrisk. Inkludera positiva och negativa extraktionskontroller vid utförande av nukleinsyraextraktion.
Det rekommenderas att tydliga instruktioner sätts upp i varje område så att användarna är medvetna om uppförandereglerna. Diagnostiska laboratorier som upptäcker mycket låga nivåer av DNA eller RNA i kliniska prover kan vilja införa den extra säkerhetsåtgärden att ha separata luftbehandlingssystem med svagt positivt lufttryck i rummen före PCR och svagt negativt lufttryck i rummen efter PCR.
Slutligen är det bra att utveckla en kvalitetssäkringsplan (QA). En sådan plan bör innehålla listor över reagensbaser och arbetslager, regler för förvaring av kit och reagenser, rapportering av kontrollresultat, personalutbildningsprogram, felsökningsalgoritmer och korrigerande åtgärder vid behov.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Upprättande av ett qPCR-laboratorium. Ett vägledningsdokument för testning av rekreationsvatten med USEPA qPCR-metod 1611. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Brittiska standarder för mikrobiologiska undersökningar: God laboratoriesed vid utförande av molekylära amplifieringsanalyser. Kvalitetsvägledning. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Att etablera ett PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinmässigt underhåll av centrifuger: rengöring, underhåll och desinfektion av centrifuger, rotorer och adaptrar (White paper nr 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. God klinisk laboratoriesed (GCLP) för molekylärbaserade tester som används i diagnostiska laboratorier, I: Akyar I, redaktör. Brett spektrum av kvalitetskontroll. Rijeka, Kroatien: Intech; 2011: 29–52.
Publiceringstid: 16 juli 2020
