Molekulárne detekčné metódy dokážu produkovať veľké množstvo nukleovej kyseliny amplifikáciou stopových množstiev nachádzajúcich sa vo vzorkách. Hoci je to výhodné pre umožnenie citlivej detekcie, zároveň to predstavuje možnosť kontaminácie šírením amplifikačných aerosólov v laboratórnom prostredí. Pri vykonávaní experimentov je možné prijať opatrenia na zabránenie kontaminácie činidiel, laboratórneho vybavenia a pracovného priestoru, pretože takáto kontaminácia môže viesť k falošne pozitívnym (alebo falošne negatívnym) výsledkom.
Aby sa znížila pravdepodobnosť kontaminácie, mala by sa vždy dodržiavať správna laboratórna prax. Konkrétne by sa mali prijať preventívne opatrenia týkajúce sa nasledujúcich bodov:
1. Manipulácia s činidlami
2. Organizácia pracovného priestoru a vybavenia
3. Pokyny na použitie a čistenie určeného molekulárneho priestoru
4. Všeobecné rady z oblasti molekulárnej biológie
5. Vnútorné kontroly
6. Bibliografia
1. Manipulácia s činidlami
Pred otvorením skúmavky s činidlami krátko centrifugujte, aby ste predišli tvorbe aerosólov. Činidlá rozdeľte po alikvotných podieloch, aby ste predišli viacnásobnému zmrazovaniu a rozmrazovaniu a kontaminácii základných roztokov. Všetky skúmavky s činidlami a reakciami jasne označte a datujte a veďte záznamy o číslach šarží a dávkovania činidiel použitých vo všetkých experimentoch. Všetky činidlá a vzorky pipetujte pomocou filtračných špičiek. Pred nákupom sa odporúča overiť si u výrobcu, či filtračné špičky pasujú na značku pipety, ktorú budete používať.
2. Organizácia pracovného priestoru a vybavenia
Pracovný priestor by mal byť organizovaný tak, aby sa zabezpečilo, že tok práce prebieha jedným smerom, z čistých oblastí (pred PCR) do znečistených oblastí (po PCR). Nasledujúce všeobecné opatrenia pomôžu znížiť riziko kontaminácie. Majte samostatné vyhradené miestnosti alebo aspoň fyzicky oddelené priestory na: prípravu mastermixu, extrakciu nukleových kyselín a pridanie templátu DNA, amplifikáciu a manipuláciu s amplifikovaným produktom a analýzu produktu, napr. gélovú elektroforézu.
V niektorých prostrediach je ťažké mať 4 samostatné miestnosti. Možnou, ale menej žiaducou možnosťou je príprava mastermixu v uzavretom priestore, napr. v laminárnej skrini. V prípade nested PCR amplifikácie by sa príprava mastermixu pre druhé kolo reakcie mala vykonávať v „čistej“ oblasti pre prípravu mastermixu, ale inokulácia primárnym PCR produktom by sa mala vykonávať v amplifikačnej miestnosti a ak je to možné, vo vyhradenom uzavretom priestore (napr. v laminárnej skrini).
Každá miestnosť/priestor potrebuje samostatnú sadu jasne označených pipiet, filtračných špičiek, stojanov na skúmavky, vortexov, centrifúg (ak sú relevantné), pier, generických laboratórnych činidiel, laboratórnych plášťov a krabíc s rukavicami, ktoré zostanú na príslušných pracovných staniciach. Pri presúvaní medzi určenými priestormi si treba umyť ruky a vymeniť rukavice a laboratórne plášte. Činidlá a vybavenie by sa nemali presúvať zo znečisteného priestoru do čistého priestoru. Ak by nastal extrémny prípad, keď je potrebné činidlo alebo zariadenie presunúť späť, musí sa najskôr dekontaminovať 10 % roztokom chlórnanu sodného a následne utrieť sterilnou vodou.
Poznámka
10 % roztok chlórnanu sodného sa musí pripravovať denne čerstvý. Pri použití na dekontamináciu by sa mal dodržiavať minimálny kontaktný čas 10 minút.
Alternatívne možno použiť komerčne dostupné produkty, ktoré sú validované ako povrchové dekontaminanty ničiace DNA, ak miestne bezpečnostné odporúčania neumožňujú použitie chlórnanu sodného alebo ak chlórnan sodný nie je vhodný na dekontamináciu kovových častí zariadení.
V ideálnom prípade by sa personál mal riadiť etickým postupom jednosmerného pracovného postupu a v ten istý deň by sa nemal vracať zo špinavých priestorov (po PCR) do čistých priestorov (pred PCR). Môžu však nastať situácie, keď sa tomu nedá vyhnúť. V takom prípade si personál musí dôkladne umyť ruky, vymeniť rukavice, použiť určený laboratórny plášť a nevnášať žiadne vybavenie, ktoré si bude chcieť znova vyniesť z miestnosti, ako napríklad laboratórne knihy. Takéto kontrolné opatrenia by sa mali zdôrazňovať v školení personálu o molekulárnych metódach.
Po použití by sa mali pracovné priestory vyčistiť 10 % chlórnanom sodným (a následne sterilnou vodou na odstránenie zvyškov bielidla), 70 % etanolom alebo validovaným komerčne dostupným dekontaminantom ničiacim DNA. V ideálnom prípade by mali byť nainštalované ultrafialové (UV) lampy, ktoré umožnia dekontamináciu ožiarením. Používanie UV lámp by sa však malo obmedziť na uzavreté pracovné priestory, napr. bezpečnostné skrinky, aby sa obmedzilo vystavenie laboratórneho personálu UV žiareniu. Dodržiavajte pokyny výrobcu týkajúce sa starostlivosti o UV lampu, vetrania a čistenia, aby sa zabezpečila jej účinnosť.
Ak sa namiesto chlórnanu sodného použije 70 % etanol, na dokončenie dekontaminácie bude potrebné ožiarenie UV svetlom.
Nečistite vortex a centrifugu chlórnanom sodným; namiesto toho ich utrite 70 % etanolom a vystavte UV žiareniu alebo použite komerčný dekontaminant ničiaci DNA. V prípade rozliatia sa poraďte s výrobcom o ďalších pokynoch na čistenie. Ak to pokyny výrobcu dovoľujú, pipety by sa mali bežne sterilizovať v autokláve. Ak pipety nie je možné autoklávovať, malo by stačiť ich vyčistiť 10 % chlórnanom sodným (a následne dôkladne utrieť sterilnou vodou) alebo komerčným dekontaminantom ničiacim DNA a následne vystaviť UV žiareniu.
Čistenie chlórnanom sodným s vysokým percentom môže pri pravidelnom čistení poškodiť plasty a kovy pipiet; najskôr si prečítajte odporúčania výrobcu. Všetky zariadenia je potrebné pravidelne kalibrovať podľa harmonogramu odporúčaného výrobcom. Určená osoba by mala byť zodpovedná za dodržiavanie kalibračného harmonogramu, vedenie podrobných záznamov a jasne zobrazenie servisných štítkov na zariadeniach.
3. Pokyny na použitie a čistenie určeného molekulárneho priestoru
PredPCR: Alikvotné rozdelenie činidiel / príprava mastermixu: Toto by mal byť najčistejší zo všetkých priestorov používaných na prípravu molekulárnych experimentov a ideálne by to mala byť určená laminárna skriňa vybavená UV svetlom. V tejto oblasti sa nesmie manipulovať so vzorkami, extrahovanými nukleovými kyselinami a amplifikovanými PCR produktmi. Amplifikačné činidlá by sa mali uchovávať v mrazničke (alebo chladničke podľa odporúčaní výrobcu) v rovnakom určenom priestore, ideálne vedľa laminárnej skrine alebo priestoru pred PCR. Rukavice by sa mali vymeniť pri každom vstupe do priestoru pred PCR alebo laminárnej skrine.
Priestor pred PCR alebo laminárna skrinka by sa mala pred použitím a po ňom vyčistiť nasledovne: Všetky predmety v skrinke, napr. pipety, krabičky na špičky, vortex, centrifúgu, stojany na skúmavky, perá atď., utrite 70 % etanolom alebo komerčne dostupným dekontaminantom ničiacim DNA a nechajte uschnúť. V prípade uzavretého pracovného priestoru, napr. laminárnej skrinky, vystavte digestor UV svetlu na 30 minút.
Poznámka
Nevystavujte činidlá UV žiareniu; premiestnite ich do skrinky až po jej vyčistení. Ak vykonávate PCR s reverznou transkripciou, môže byť užitočné utrieť povrchy a zariadenia roztokom, ktorý pri kontakte rozkladá RNázy. To môže pomôcť vyhnúť sa falošne negatívnym výsledkom z enzýmovej degradácie RNA. Po dekontaminácii a pred prípravou mastermixu by sa mali rukavice ešte raz vymeniť a potom je skrinka pripravená na použitie.
PredPCR: Extrakcia nukleových kyselín/pridanie templátu:
Nukleová kyselina sa musí extrahovať a manipulovať s ňou v druhej určenej oblasti s použitím samostatnej sady pipiet, filtračných špičiek, stojanov na skúmavky, nových rukavíc, laboratórnych plášťov a iného vybavenia. Táto oblasť slúži aj na pridávanie templátov, kontrol a trendových čiar do skúmaviek alebo platní s mastermixom. Aby sa predišlo kontaminácii extrahovaných vzoriek nukleových kyselín, ktoré sa analyzujú, odporúča sa pred manipuláciou s pozitívnymi kontrolami alebo štandardmi vymeniť rukavice a použiť samostatnú sadu pipiet. PCR činidlá a amplifikované produkty sa v tejto oblasti nesmú pipetovať. Vzorky by sa mali skladovať v určených chladničkách alebo mrazničkách v tej istej oblasti. Pracovný priestor so vzorkami by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor s mastermixom.
Post-PCR: Amplifikácia a manipulácia s amplifikovaným produktom
Tento vyhradený priestor je určený na post-amplifikačné procesy a mal by byť fyzicky oddelený od oblastí pred PCR. Zvyčajne obsahuje termocykléry a platformy pre analýzu v reálnom čase a ideálne by mal mať laminárnu prietokovú skriňu na pridanie produktu PCR z 1. kola do reakcie z 2. kola, ak sa vykonáva nested PCR. S PCR činidlami a extrahovanou nukleovou kyselinou sa v tejto oblasti nesmie manipulovať, pretože je tu vysoké riziko kontaminácie. Táto oblasť by mala mať samostatnú sadu rukavíc, laboratórnych plášťov, stojanov na platne a skúmavky, pipiet, filtračných špičiek, nádob a ďalšieho vybavenia. Skúmavky sa musia pred otvorením centrifugovať. Pracovný priestor so vzorkami by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor pre mastermix.
Post-PCR: Analýza produktu
Táto miestnosť je určená pre zariadenia na detekciu produktov, napr. nádrže na gélovú elektroforézu, napájacie zdroje, UV transiluminátor a systém na dokumentáciu gélov. Táto oblasť by mala mať samostatné sady rukavíc, laboratórne plášte, stojany na platne a skúmavky, pipety, filtračné špičky, nádoby a ďalšie vybavenie. Do tejto oblasti sa nesmú vnášať žiadne iné činidlá, okrem farbiva na nanášanie, molekulárneho markera a agarózového gélu a zložiek pufrov. Pracovný priestor so vzorkami by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor pre mastermix.
Dôležitá poznámka
V ideálnom prípade by sa do miestností pred PCR nemalo vstupovať v ten istý deň, ak sa už pracovalo v miestnostiach po PCR. Ak sa tomu nedá úplne vyhnúť, uistite sa, že si najprv dôkladne umyjete ruky a že v miestnostiach nosíte špeciálne laboratórne plášte. Laboratórne knihy a dokumenty sa nesmú brať do miestností pred PCR, ak boli použité v miestnostiach po PCR; v prípade potreby si urobte duplikáty výtlačkov protokolov/identifikačných čísiel vzoriek atď.
4. Všeobecné rady z oblasti molekulárnej biológie
Používajte rukavice bez púdru, aby ste predišli inhibícii testu. Správna technika pipetovania je rozhodujúca pre zníženie kontaminácie. Nesprávne pipetovanie môže pri dávkovaní kvapalín viesť k rozstreku a tvorbe aerosólov. Osvedčené postupy pre správne pipetovanie nájdete na nasledujúcich odkazoch: Gilsonov sprievodca pipetovaním, videá o technike pipetovania Anachem, Pred otvorením centrifugujte skúmavky a otvárajte ich opatrne, aby ste predišli rozstreku. Skúmavky ihneď po použití uzavrite, aby ste predišli vniknutiu kontaminantov.
Pri vykonávaní viacerých reakcií pripravte jeden mastermix obsahujúci bežné činidlá (napr. vodu, dNTP, pufor, priméry a enzým), aby ste minimalizovali počet prenosov činidiel a znížili riziko kontaminácie. Odporúča sa umiestniť mastermix na ľad alebo studený blok. Použitie enzýmu Hot Start môže pomôcť znížiť produkciu nešpecifických produktov. Chráňte činidlá obsahujúce fluorescenčné sondy pred svetlom, aby ste predišli ich degradácii.
5. Vnútorné kontroly
Zahrňte dobre charakterizované, potvrdené pozitívne a negatívne kontroly spolu s kontrolou bez templátu vo všetkých reakciách a viacbodovú titrovanú trendovú čiaru pre kvantitatívne reakcie. Pozitívna kontrola by nemala byť taká silná, aby predstavovala riziko kontaminácie. Pri extrakcii nukleových kyselín zahrňte pozitívne a negatívne extrakčné kontroly.
Odporúča sa, aby boli v každej oblasti umiestnené jasné pokyny, aby si používatelia boli vedomí pravidiel správania. Diagnostické laboratóriá, ktoré zistia veľmi nízke hladiny DNA alebo RNA v klinických vzorkách, môžu prijať dodatočné bezpečnostné opatrenie v podobe samostatných systémov na úpravu vzduchu s mierne pozitívnym tlakom vzduchu v miestnostiach pred PCR a mierne negatívnym tlakom vzduchu v miestnostiach po PCR.
Nakoniec je užitočné vypracovať plán zabezpečenia kvality (QA). Takýto plán by mal obsahovať zoznamy hlavných a pracovných zásob činidiel, pravidlá skladovania súprav a činidiel, hlásenie výsledkov kontrol, programy školenia zamestnancov, algoritmy na riešenie problémov a v prípade potreby nápravné opatrenia.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitola 3: Zriadenie laboratória qPCR. Usmernenie k testovaniu rekreačných vôd pomocou metódy USEPA qPCR 1611. Lansing – Michiganská štátna univerzita.
Public Health England, NHS. Štandardy Spojeného kráľovstva pre mikrobiologické vyšetrenia: Správna laboratórna prax pri vykonávaní testov molekulárnej amplifikácie. Pokyny pre kvalitu. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Zriadenie PCR laboratória. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Bežná údržba centrifúg: čistenie, údržba a dezinfekcia centrifúg, rotorov a adaptérov (Biela kniha č. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Správna klinická laboratórna prax (GCLP) pre molekulárne testy používané v diagnostických laboratóriách, In: Akyar I, editor. Široké spektrum kontroly kvality. Rijeka, Chorvátsko: Intech; 2011: 29–52.
Čas uverejnenia: 16. júla 2020
