მოლეკულური ტესტირების დაშვებული და არასაჭირო ფაქტორები

მოლეკულური დეტექციის მეთოდებს აქვთ ნუკლეინის მჟავის დიდი მოცულობის წარმოების უნარი ნიმუშებში ნაპოვნი კვალი რაოდენობების ამპლიფიკაციის გზით. მიუხედავად იმისა, რომ ეს სასარგებლოა მგრძნობიარე დეტექციის უზრუნველსაყოფად, ის ასევე ქმნის დაბინძურების შესაძლებლობას ამპლიფიკაციის აეროზოლების ლაბორატორიულ გარემოში გავრცელების გზით. ექსპერიმენტების ჩატარებისას შესაძლებელია ზომების მიღება რეაგენტების, ლაბორატორიული აღჭურვილობისა და სამუშაო მაგიდის დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, რადგან ასეთმა დაბინძურებამ შეიძლება გამოიწვიოს ცრუ დადებითი (ან ცრუ უარყოფითი) შედეგები.

დაბინძურების ალბათობის შესამცირებლად, ყოველთვის უნდა დაიცვათ კარგი ლაბორატორიული პრაქტიკა. კერძოდ, უნდა იქნას მიღებული სიფრთხილის ზომები შემდეგ საკითხებთან დაკავშირებით:

1. რეაგენტების დამუშავება
2. სამუშაო სივრცისა და აღჭურვილობის ორგანიზება
3. დანიშნული მოლეკულური სივრცის გამოყენებისა და გაწმენდის რჩევები
4. მოლეკულური ბიოლოგიის ზოგადი რჩევები
5. შიდა კონტროლი
6. ბიბლიოგრაფია

1. რეაგენტების დამუშავება

გახსნამდე რეაგენტის მილები ხანმოკლედ დაცენტრიფუგეთ აეროზოლების წარმოქმნის თავიდან ასაცილებლად. რეაგენტები ალიკვოტირებულია მრავალჯერადი გაყინვა-დათბობის და ძირითადი მარაგების დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად. ყველა რეაგენტისა და რეაქციის მილის ეტიკეტირება და თარიღის მითითება და ყველა ექსპერიმენტში გამოყენებული რეაგენტის პარტიისა და პარტიის ნომრების ჟურნალების წარმოება. ყველა რეაგენტისა და ნიმუშის პიპეტირება ფილტრის წვერების გამოყენებით. შეძენამდე სასურველია მწარმოებელთან გადაამოწმოთ, რომ ფილტრის წვერები შეესაბამება გამოსაყენებელი პიპეტის ბრენდს.

2. სამუშაო სივრცისა და აღჭურვილობის ორგანიზება

სამუშაო სივრცე ისე უნდა იყოს ორგანიზებული, რომ სამუშაოს ნაკადი ერთი მიმართულებით მიმდინარეობდეს, სუფთა ადგილებიდან (PCR-მდე) დაბინძურებულ ადგილებამდე (PCR-ის შემდგომი). შემდეგი ზოგადი სიფრთხილის ზომები ხელს შეუწყობს დაბინძურების ალბათობის შემცირებას. გქონდეთ ცალკე გამოყოფილი ოთახები, ან სულ მცირე ფიზიკურად გამოყოფილი ადგილები: მასტერმიქსის მომზადების, ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქციისა და დნმ-ის შაბლონის დამატების, გამრავლებული პროდუქტის ამპლიფიკაციისა და დამუშავების, ასევე პროდუქტის ანალიზისთვის, მაგ. გელის ელექტროფორეზი.

ზოგიერთ გარემოში 4 ცალკე ოთახის ქონა რთულია. შესაძლო, მაგრამ ნაკლებად სასურველი ვარიანტია მასტერმიქსის მომზადება შეკავების ზონაში, მაგ. ლამინარული ნაკადის კაბინეტში. ჩადგმული PCR ამპლიფიკაციის შემთხვევაში, მეორე რაუნდის რეაქციისთვის მასტერმიქსის მომზადება უნდა მოხდეს მასტერმიქსის მომზადების „სუფთა“ ზონაში, მაგრამ პირველადი PCR პროდუქტით ინოკულაცია უნდა მოხდეს ამპლიფიკაციის ოთახში და, თუ შესაძლებელია, სპეციალურად გამოყოფილ შეკავების ზონაში (მაგ. ლამინარული ნაკადის კაბინეტი).

თითოეულ ოთახს/ზონას სჭირდება მკაფიოდ მონიშნული პიპეტების, ფილტრის წვერების, მილების თაროების, მორტექსების, ცენტრიფუგების (ასეთის არსებობის შემთხვევაში), კალმების, ზოგადი ლაბორატორიული რეაგენტების, ლაბორატორიული ხალათების და ხელთათმანების ყუთების ცალკე ნაკრები, რომლებიც შესაბამის სამუშაო ადგილებზე დარჩება. დანიშნულ ზონებს შორის გადაადგილებისას ხელები უნდა დაიბანოთ, ხელთათმანები და ლაბორატორიული ხალათები კი უნდა გამოიცვალოს. რეაგენტები და აღჭურვილობა არ უნდა გადაიტანოთ ჭუჭყიანი ადგილიდან სუფთა ადგილას. უკიდურეს შემთხვევაში, როდესაც რეაგენტი ან აღჭურვილობა უკუღმა უნდა გადაადგილდეს, ის ჯერ უნდა გაიწმინდოს 10%-იანი ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით, შემდეგ კი სტერილური წყლით გაიწმინდოს.

შენიშვნა

10%-იანი ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ხსნარი ყოველდღიურად უნდა მომზადდეს. დეკონტამინაციისთვის გამოყენებისას, კონტაქტის მინიმალური დრო 10 წუთი უნდა იყოს დაცული.
ალტერნატიულად, თუ ადგილობრივი უსაფრთხოების რეკომენდაციები არ იძლევა ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის გამოყენების საშუალებას ან თუ ნატრიუმის ჰიპოქლორიტი არ არის შესაფერისი აღჭურვილობის მეტალის ნაწილების დეკონტამინაციისთვის, შეიძლება გამოყენებულ იქნას კომერციულად ხელმისაწვდომი პროდუქტები, რომლებიც დადასტურებულია, როგორც დნმ-ის გამანადგურებელი ზედაპირის დეკონტამინატორები.

იდეალურ შემთხვევაში, პერსონალმა უნდა დაიცვას ცალმხრივი სამუშაო ნაკადის ეთოსი და იმავე დღეს არ დაბრუნდეს დაბინძურებული ადგილებიდან (PCR-ის შემდგომი) სუფთა ადგილებში (PCR-ის წინ). თუმცა, შეიძლება არსებობდეს შემთხვევები, როდესაც ეს გარდაუვალია. ასეთ შემთხვევაში, პერსონალმა უნდა იზრუნოს ხელების საფუძვლიანად დაბანაზე, ხელთათმანების გამოცვლაზე, ლაბორატორიული ხალათის გამოყენებაზე და არ შეიტანოს ისეთი აღჭურვილობა, რომლის ოთახიდან გატანაც მოუწევს, მაგალითად, ლაბორატორიული წიგნები. ასეთი კონტროლის ზომები ხაზგასმული უნდა იყოს პერსონალის მოლეკულურ მეთოდებში ტრენინგის დროს.

გამოყენების შემდეგ, სამუშაო მაგიდის სივრცეები უნდა გაიწმინდოს 10%-იანი ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით (შემდეგ სტერილური წყლით ნარჩენი მათეთრებლის მოსაშორებლად), 70%-იანი ეთანოლით ან კომერციულად ხელმისაწვდომი დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტით. იდეალურ შემთხვევაში, დასხივებით დეკონტამინაციის უზრუნველსაყოფად უნდა დამონტაჟდეს ულტრაიისფერი (UV) ნათურები. თუმცა, ლაბორატორიის პერსონალის ულტრაიისფერი გამოსხივების ზემოქმედების შესამცირებლად, UV ნათურების გამოყენება უნდა შემოიფარგლოს დახურული სამუშაო ადგილებით, მაგალითად, დამცავი კარადებით. ნათურების ეფექტურობის უზრუნველსაყოფად, გთხოვთ, დაიცვათ მწარმოებლის ინსტრუქციები UV ნათურის მოვლის, ვენტილაციისა და გაწმენდის შესახებ.

თუ ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ნაცვლად 70%-იან ეთანოლს იყენებთ, დეკონტამინაციის დასასრულებლად საჭირო იქნება ულტრაიისფერი ნათურებით დასხივება.
არ გაწმინდოთ მორტექსი და ცენტრიფუგა ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით; ამის ნაცვლად, გაწმინდეთ 70%-იანი ეთანოლით და გააშრეთ ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედების ქვეშ, ან გამოიყენეთ კომერციული დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტი. დაღვრის შემთხვევაში, დამატებითი ინფორმაციისთვის მიმართეთ მწარმოებელს. თუ მწარმოებლის ინსტრუქციები იძლევა ამის საშუალებას, პიპეტები რეგულარულად უნდა სტერილიზდეს ავტოკლავში. თუ პიპეტების ავტოკლავირება შეუძლებელია, საკმარისი იქნება მათი გაწმენდა 10%-იანი ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით (შემდეგ სტერილური წყლით საფუძვლიანად გაწმენდით) ან კომერციული დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტით და შემდეგ ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედების ქვეშ.

მაღალი პროცენტული შემცველობის ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით გაწმენდამ შესაძლოა საბოლოოდ დააზიანოს პიპეტის პლასტმასი და ლითონები, თუ რეგულარულად ხორციელდება; პირველ რიგში, გაეცანით მწარმოებლის რეკომენდაციებს. ყველა აღჭურვილობა რეგულარულად უნდა დაკალიბრდეს მწარმოებლის მიერ რეკომენდებული გრაფიკის შესაბამისად. დანიშნული პირი უნდა იყოს პასუხისმგებელი კალიბრაციის გრაფიკის დაცვაზე, დეტალური ჟურნალების წარმოებასა და აღჭურვილობაზე მომსახურების ეტიკეტების მკაფიოდ გამოტანაზე.

3. დანიშნული მოლეკულური სივრცის გამოყენებისა და გაწმენდის რჩევები

წინასწარი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR): რეაგენტების ალიკვოტირება / მასტერმიქსის მომზადება: ეს უნდა იყოს ყველაზე სუფთა სივრცე მოლეკულური ექსპერიმენტების მოსამზადებლად გამოყენებული ყველა სხვა ადგილიდან და იდეალურ შემთხვევაში უნდა იყოს სპეციალურად გამოყოფილი ლამინარული ნაკადის კაბინეტი, რომელიც აღჭურვილია ულტრაიისფერი ნათურით. ნიმუშები, ექსტრაგირებული ნუკლეინის მჟავა და გამრავლებული PCR პროდუქტები არ უნდა იქნას დამუშავებული ამ ზონაში. გამრავლების რეაგენტები უნდა ინახებოდეს საყინულეში (ან მაცივარში, მწარმოებლის რეკომენდაციების შესაბამისად) იმავე გამოყოფილ სივრცეში, იდეალურ შემთხვევაში ლამინარული ნაკადის კაბინეტის ან PCR-წინასწარი ზონის გვერდით. ხელთათმანები უნდა შეიცვალოს ყოველ ჯერზე, როდესაც შეხვალთ PCR-წინასწარი ზონის ან ლამინარული ნაკადის კაბინეტში.

გამოყენებამდე და გამოყენებამდე და შემდეგ, წინასწარი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის არე ან ლამინარული ნაკადის კაბინეტი უნდა გაიწმინდოს შემდეგნაირად: კაბინეტში არსებული ყველა ნივთი, მაგ. პიპეტები, წვერის ყუთები, მორტექსი, ცენტრიფუგა, მილის თაროები, კალმები და ა.შ. გაწმინდეთ 70%-იანი ეთანოლით ან კომერციული დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტით და გააშრეთ. დახურული სამუშაო ზონის შემთხვევაში, მაგ. ლამინარული ნაკადის კაბინეტი, დამცავი საფარი 30 წუთის განმავლობაში გააჩერეთ ულტრაიისფერი სხივების ქვეშ.

შენიშვნა

რეაგენტები არ დაუშვათ ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედების ქვეშ; ისინი კაბინეტში მხოლოდ მისი გაწმენდის შემდეგ გადაიტანეთ. თუ უკუტრანსკრიფციის PCR ატარებთ, ასევე შეიძლება სასარგებლო იყოს ზედაპირებისა და აღჭურვილობის გაწმენდა ხსნარით, რომელიც კონტაქტისთანავე შლის რნმ-ნაზებს. ამან შეიძლება თავიდან აიცილოს რნმ-ის ფერმენტული დეგრადაციით გამოწვეული ცრუ უარყოფითი შედეგები. დეკონტამინაციის შემდეგ და მასტერმიქსის მომზადებამდე, ხელთათმანები კიდევ ერთხელ უნდა გამოიცვალოს, რის შემდეგაც კაბინეტი გამოსაყენებლად მზად იქნება.

წინასწარი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია: ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქცია/შაბლონის დამატება:

ნუკლეინის მჟავა უნდა იქნას ამოღებული და დამუშავებული მეორე გამოყოფილ ადგილას, პიპეტების, ფილტრის წვერების, მილების თაროების, ახალი ხელთათმანების, ლაბორატორიული ხალათების და სხვა აღჭურვილობის გამოყენებით. ეს ადგილი ასევე განკუთვნილია მასტერმიქსის მილებში ან ფირფიტებზე შაბლონის, კონტროლისა და ტენდენციის ხაზების დასამატებლად. ანალიზისთვის განკუთვნილი ექსტრაგირებული ნუკლეინის მჟავას ნიმუშების დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, რეკომენდებულია ხელთათმანების შეცვლა დადებითი კონტროლის ან სტანდარტების გამოყენებამდე და პიპეტების ცალკე ნაკრების გამოყენება. PCR რეაგენტები და გამრავლებული პროდუქტები არ უნდა იქნას პიპეტირებული ამ ადგილას. ნიმუშები უნდა ინახებოდეს გამოყოფილ მაცივრებში ან საყინულეებში იმავე ადგილას. ნიმუშების სამუშაო სივრცე უნდა გაიწმინდოს მასტერმიქსის სივრცის მსგავსად.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის შემდგომი პერიოდი: გამრავლებული პროდუქტის ამპლიფიკაცია და დამუშავება

ეს გამოყოფილი სივრცე განკუთვნილია პოსტამპლიფიკაციური პროცესებისთვის და ფიზიკურად უნდა იყოს გამოყოფილი PCR-მდელი ზონებისგან. ის, როგორც წესი, შეიცავს თერმოციკლერებს და რეალურ დროში მომუშავე პლატფორმებს და იდეალურ შემთხვევაში, თუ ტარდება ჩადგმული PCR, უნდა ჰქონდეს ლამინარული ნაკადის კაბინეტი პირველი რაუნდის PCR პროდუქტის მეორე რაუნდის რეაქციაში დასამატებლად. PCR რეაგენტები და ექსტრაქტირებული ნუკლეინის მჟავა არ უნდა იქნას დამუშავებული ამ ზონაში, რადგან დაბინძურების რისკი მაღალია. ამ ზონაში უნდა იყოს ხელთათმანების, ლაბორატორიული ხალათების, ფირფიტებისა და მილების თაროების, პიპეტების, ფილტრის წვერების, კონტეინერების და სხვა აღჭურვილობის ცალკე ნაკრები. მილები გახსნამდე უნდა იყოს ცენტრიფუგირებული. ნიმუშის სამუშაო სივრცე უნდა გაიწმინდოს მასტერმიქსის სივრცის მსგავსად.

პოსტ-პჯრ: პროდუქტის ანალიზი

ეს ოთახი განკუთვნილია პროდუქტის აღმოჩენის აღჭურვილობისთვის, მაგ. გელის ელექტროფორეზის ავზებისთვის, ელექტროპაკეტებისთვის, ულტრაიისფერი ტრანსილუმინატორისთვის და გელის დოკუმენტაციის სისტემისთვის. ამ ზონაში უნდა იყოს ხელთათმანების, ლაბორატორიული ხალათების, ფირფიტებისა და მილების თაროების, პიპეტების, ფილტრის წვერების, კონტეინერების და სხვა აღჭურვილობის ცალკეული კომპლექტები. ამ ზონაში სხვა რეაგენტების შეტანა არ შეიძლება, გარდა ჩატვირთვის საღებავისა, მოლეკულური მარკერისა და აგაროზის გელისა და ბუფერული კომპონენტებისა. ნიმუშის სამუშაო სივრცე უნდა გაიწმინდოს მასტერმიქსის სივრცის მსგავსად.

მნიშვნელოვანი შენიშვნა

იდეალურ შემთხვევაში, PCR-ის შემდგომ ოთახებში შესვლა იმავე დღეს არ უნდა მოხდეს, თუ PCR-ის შემდგომ ოთახებში უკვე შესრულებული სამუშაოა. თუ ეს სრულიად გარდაუვალია, დარწმუნდით, რომ ხელები ჯერ კარგად დაიბანეთ და ოთახებში სპეციალური ლაბორატორიული ხალათები გეცვათ. ლაბორატორიული წიგნები და დოკუმენტები არ უნდა შეიტანოთ PCR-ის შემდგომ ოთახებში, თუ ისინი გამოყენებულია PCR-ის შემდგომ ოთახებში; საჭიროების შემთხვევაში, წაიღეთ პროტოკოლების/ნიმუშების ID-ების და ა.შ. დუბლიკატები.

4. მოლეკულური ბიოლოგიის ზოგადი რჩევები

ანალიზის შეფერხების თავიდან ასაცილებლად გამოიყენეთ ფხვნილის გარეშე ხელთათმანები. დაბინძურების შესამცირებლად პიპეტირების სწორი ტექნიკა უმნიშვნელოვანესია. არასწორმა პიპეტირებამ შეიძლება გამოიწვიოს სითხეების გაცემისას შხეფები და აეროზოლების წარმოქმნა. სწორი პიპეტირების კარგი პრაქტიკა შეგიძლიათ იხილოთ შემდეგ ბმულებზე: Gilson-ის სახელმძღვანელო პიპეტირებისთვის, Anachem-ის პიპეტირების ტექნიკის ვიდეოები, ცენტრიფუგის მილები გახსნამდე და ფრთხილად გახსენით შხეფების თავიდან ასაცილებლად. გამოყენებისთანავე დახურეთ მილები დამაბინძურებლების შეღწევის თავიდან ასაცილებლად.

მრავალი რეაქციის ჩატარებისას, რეაგენტების გადატანის რაოდენობის მინიმიზაციისა და დაბინძურების საფრთხის შესამცირებლად, მოამზადეთ ერთი მასტერმიქსი, რომელიც შეიცავს საერთო რეაგენტებს (მაგ., წყალი, dNTP-ები, ბუფერი, პრაიმერები და ფერმენტი). რეკომენდებულია მასტერმიქსის ყინულზე ან ცივ ბლოკზე განთავსება. ცხელი გაშვების ფერმენტის გამოყენებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს არასპეციფიკური პროდუქტების წარმოების შემცირებას. დაიცავით ფლუორესცენტური ზონდების შემცველი რეაგენტები სინათლისგან, რათა თავიდან აიცილოთ დეგრადაცია.

5. შიდა კონტროლი

ყველა რეაქციაში ჩართეთ კარგად დახასიათებული, დადასტურებული დადებითი და უარყოფითი კონტროლი, შაბლონის გარეშე კონტროლი და რაოდენობრივი რეაქციებისთვის მრავალპუნქტიანი ტიტრული ტენდენციის ხაზი. დადებითი კონტროლი არ უნდა იყოს იმდენად ძლიერი, რომ დაბინძურების რისკი შექმნას. ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქციის ჩატარებისას ჩართეთ დადებითი და უარყოფითი ექსტრაქციის კონტროლი.

რეკომენდებულია, რომ თითოეულ ზონაში გამოკრული იყოს მკაფიო ინსტრუქციები, რათა მომხმარებლებმა იცოდნენ ქცევის წესების შესახებ. დიაგნოსტიკურ ლაბორატორიებს, რომლებიც კლინიკურ ნიმუშებში დნმ-ის ან რნმ-ის ძალიან დაბალ დონეს აფიქსირებენ, შეიძლება სურდეთ დამატებითი უსაფრთხოების ზომების მიღება და ცალკე ჰაერის დამუშავების სისტემების გამოყენება PCR-მდელ ოთახებში ოდნავ დადებითი ჰაერის წნევით და PCR-ის შემდგომ ოთახებში ოდნავ უარყოფითი ჰაერის წნევით.

და ბოლოს, სასარგებლოა ხარისხის უზრუნველყოფის (QA) გეგმის შემუშავება. ასეთი გეგმა უნდა მოიცავდეს რეაგენტების ძირითადი მარაგებისა და სამუშაო მარაგების სიებს, ნაკრებებისა და რეაგენტების შენახვის წესებს, კონტროლის შედეგების შესახებ ანგარიშგებას, პერსონალის სასწავლო პროგრამებს, პრობლემების მოგვარების ალგორითმებს და საჭიროების შემთხვევაში გამოსასწორებელ ქმედებებს.

6. ბიბლიოგრაფია

ასლან ა., კინზელმანი ჯ., დრელინი ე., ანანევა თ., ლავანდერ ჯ. თავი 3: qPCR ლაბორატორიის მოწყობა. სახელმძღვანელო დოკუმენტი რეკრეაციული წყლების ტესტირებისთვის USEPA qPCR მეთოდი 1611-ის გამოყენებით. ლანსინგ-მიჩიგანის სახელმწიფო უნივერსიტეტი.

ინგლისის საზოგადოებრივი ჯანდაცვა, NHS. მიკრობიოლოგიური კვლევების დიდი ბრიტანეთის სტანდარტები: კარგი ლაბორატორიული პრაქტიკა მოლეკულური ამპლიფიკაციის ანალიზების ჩატარებისას). ხარისხის სახელმძღვანელო. 2013;4(4):1–15.

მიფლინი თ. PCR ლაბორატორიის მოწყობა. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

შროდერ ს. 2013. ცენტრიფუგების რუტინული მოვლა-პატრონობა: ცენტრიფუგების, როტორებისა და ადაპტერების გაწმენდა, მოვლა-პატრონობა და დეზინფექცია (თეთრი დოკუმენტი No. 14). ჰამბურგი: ეპენდორფი; 2013.

ვიანა რ.ვ., უოლისი ს.ლ. კარგი კლინიკური ლაბორატორიული პრაქტიკა (GCLP) დიაგნოსტიკურ ლაბორატორიებში გამოყენებული მოლეკულური ტესტებისთვის, ში: აკიარი I, რედაქტორი. ხარისხის კონტროლის ფართო სპექტრი. რიეკა, ხორვატია: Intech; 2011: 29–52.