分子検出法は、サンプル中に存在する微量の核酸を増幅することで大量の核酸を生成できるという利点があります。これは高感度検出を可能にする一方で、増幅エアロゾルが実験室環境に拡散し、汚染を引き起こす可能性も伴います。実験を行う際には、試薬、実験器具、実験台などの汚染を避けるための対策を講じる必要があります。汚染は偽陽性（または偽陰性）の結果をもたらす可能性があるためです。
汚染の可能性を低減するために、常にGLP（優良実験室基準）を遵守する必要があります。具体的には、以下の点について予防措置を講じる必要があります。
1. 試薬の取り扱い
2. 作業スペースと設備の整理
3. 指定された分子空間の使用と清掃に関するアドバイス
4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス
5. 内部統制
6. 参考文献
1. 試薬の取り扱い
エアロゾルの発生を防ぐため、試薬チューブは開封前に軽く遠心分離してください。複数回の凍結融解やマスターストックの汚染を防ぐため、試薬は小分けしてください。すべての試薬チューブと反応チューブには明確なラベルと日付を貼付し、すべての実験で使用した試薬のロット番号とバッチ番号の記録を保管してください。すべての試薬とサンプルはフィルターチップを使用してピペットで分注してください。購入前に、フィルターチップが使用するピペットのブランドに適合していることを製造元に確認することをお勧めします。
2. 作業スペースと設備の整理
作業スペースは、クリーンエリア（PCR前）からダーティーエリア（PCR後）への作業の流れが一方向となるように整理整頓する必要があります。以下の一般的な予防措置は、汚染の可能性を低減するのに役立ちます。マスターミックスの調製、核酸抽出およびDNAテンプレートの添加、増幅および増幅産物の取り扱い、そしてゲル電気泳動などの産物分析を行うための専用の部屋、または少なくとも物理的に分離されたエリアを用意してください。
状況によっては、4つの独立した部屋を用意することが困難な場合があります。可能な選択肢としては、マスターミックスの調製をラミナーフローキャビネットなどの封じ込めエリアで行うことが挙げられますが、あまり望ましくはありません。ネステッドPCR増幅の場合、2回目の反応用のマスターミックスの調製はマスターミックス調製用の「クリーン」エリアで行う必要がありますが、一次PCR産物の接種は増幅室で行い、可能であれば専用の封じ込めエリア（ラミナーフローキャビネットなど）で行います。
各部屋／エリアには、明確にラベルを貼ったピペット、フィルターチップ、チューブラック、ボルテックス、遠心分離機（該当する場合）、ペン、汎用試薬、白衣、手袋の箱をそれぞれ用意し、それぞれのワークステーションに置いてください。指定されたエリア間を移動する際は、必ず手を洗い、手袋と白衣を交換してください。試薬や機器は、汚れたエリアから清潔なエリアに移動させないでください。試薬や機器を後方に移動させる必要がある場合は、まず10%次亜塩素酸ナトリウムで消毒し、その後滅菌水で拭き取ってください。
注記
10%次亜塩素酸ナトリウム溶液は毎日新しく調製する必要があります。除染に使用する場合は、最低10分間の接触時間を確保してください。
あるいは、地域の安全推奨事項により次亜塩素酸ナトリウムの使用が許可されていない場合、または次亜塩素酸ナトリウムが機器の金属部品の除染に適していない場合は、DNA を破壊する表面除染剤として検証されている市販の製品を使用することもできます。
理想的には、職員は一方向のワークフローの精神を遵守し、汚染されたエリア（PCR後）から清潔なエリア（PCR前）へ同日中に再び移動しないことが重要です。しかし、避けられない場合もあります。そのような状況が発生した場合、職員は徹底した手洗い、手袋の交換、指定された白衣の着用を徹底し、実験ノートなど、再び部屋から持ち出したい機器は持ち込まないように注意する必要があります。このような管理措置は、分子生物学的手法に関する職員研修において強調されるべきです。
使用後は、実験台を10%次亜塩素酸ナトリウム（残留漂白剤を除去するために滅菌水を使用）、70%エタノール、または市販のDNA破壊除染剤で清掃してください。理想的には、紫外線（UV）ランプを設置し、照射による除染を可能にする必要があります。ただし、実験スタッフの紫外線曝露を制限するため、UVランプの使用は安全キャビネットなどの密閉された作業区域に限定してください。ランプの有効性を維持するために、UVランプの手入れ、換気、清掃に関する製造元の指示に従ってください。
次亜塩素酸ナトリウムの代わりに 70% エタノールを使用する場合は、除染を完了するために紫外線照射が必要になります。
ボルテックスと遠心分離機は次亜塩素酸ナトリウムで洗浄しないでください。代わりに、70%エタノールで拭き取って紫外線を照射するか、市販のDNA破壊除染剤を使用してください。液体がこぼれた場合は、製造元に洗浄方法の詳細をご確認ください。製造元の指示で許可されている場合は、ピペットは定期的にオートクレーブ滅菌する必要があります。オートクレーブ滅菌ができない場合は、10%次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し（その後、滅菌水で十分に拭き取る）、市販のDNA破壊除染剤で洗浄した後に紫外線を照射するだけで十分です。
高濃度次亜塩素酸ナトリウムによる洗浄を定期的に行うと、ピペットのプラスチックや金属に損傷を与える可能性があります。事前にメーカーの推奨事項をご確認ください。すべての機器は、メーカー推奨のスケジュールに従って定期的に校正する必要があります。校正スケジュールが遵守され、詳細なログが保持され、機器にサービスラベルが明確に表示されていることを確認する担当者を任命する必要があります。
3. 指定された分子空間の使用と清掃に関するアドバイス
PCR前：試薬分注／マスターミックス調製：分子実験の準備に使用するすべての空間の中で最も清潔な空間であるべきであり、理想的には紫外線ライトを備えた専用のラミナーフローキャビネットを使用することが推奨されます。サンプル、抽出された核酸、増幅されたPCR産物は、このエリアで取り扱ってはいけません。増幅試薬は、ラミナーフローキャビネットまたはPCR前処理エリアの隣の同じ指定空間にある冷凍庫（またはメーカーの推奨に従って冷蔵庫）に保管してください。PCR前処理エリアまたはラミナーフローキャビネットに入るたびに、手袋を交換する必要があります。
PCR前処理エリアまたはラミナーフローキャビネットは、使用前後に以下の手順で清掃してください。キャビネット内のすべてのアイテム（ピペット、チップボックス、ボルテックス、遠心分離機、チューブラック、ペンなど）を70%エタノールまたは市販のDNA破壊除染剤で拭き、乾燥させてください。ラミナーフローキャビネットなどの密閉された作業エリアの場合は、フードを30分間紫外線に当ててください。
注記
試薬は紫外線にさらさないでください。キャビネットが清潔になったら、試薬をキャビネットに移してください。逆転写PCRを行う場合は、接触するとRNaseを分解する溶液で表面や器具を拭くことも効果的です。これにより、RNAの酵素分解による偽陰性結果の回避に役立ちます。除染後、マスターミックスを調製する前に、もう一度手袋を交換してください。キャビネットは使用準備完了です。
PCR前：核酸抽出/テンプレート添加：
核酸の抽出および取り扱いは、別の指定されたエリアで、ピペット、フィルターチップ、チューブラック、新しい手袋、実験用白衣、その他の器具を用いて行ってください。このエリアは、テンプレート、コントロール、トレンドラインをマスターミックスチューブまたはプレートに追加する際にも使用します。分析対象の抽出核酸サンプルの汚染を防ぐため、陽性コントロールまたは標準サンプルを扱う前に手袋を交換し、別のピペットを使用することをお勧めします。PCR試薬および増幅産物は、このエリアでピペットで分注しないでください。サンプルは、同じエリア内の指定された冷蔵庫または冷凍庫に保管してください。サンプル作業スペースは、マスターミックス作業スペースと同様に清掃してください。
PCR後：増幅と増幅産物の取り扱い
この指定スペースは増幅後プロセス用であり、PCR前エリアとは物理的に分離する必要があります。通常、サーモサイクラーとリアルタイムプラットフォームが設置されており、ネステッドPCRを実施する場合は、ラウンド1のPCR産物をラウンド2の反応液に添加するためのラミナーフローキャビネットが理想的です。汚染リスクが高いため、PCR試薬および抽出された核酸はこのエリアで取り扱ってはなりません。このエリアには、専用の手袋、実験着、プレートおよびチューブラック、ピペット、フィルターチップ、容器、その他の器具を用意する必要があります。チューブは開封前に遠心分離する必要があります。サンプル作業スペースは、マスターミックススペースと同様に清掃する必要があります。
PCR後：産物分析
この部屋は、ゲル電気泳動槽、パワーパック、UVトランスイルミネーター、ゲル記録システムなどの製品検出機器のための部屋です。このエリアには、手袋、実験着、プレートラックおよびチューブラック、ピペット、フィルターチップ、容器、その他の機器をそれぞれ別に用意してください。ローディングダイ、分子マーカー、アガロースゲル、およびバッファー成分を除き、他の試薬をこのエリアに持ち込むことはできません。サンプル作業スペースは、マスターミックススペースと同様に清掃してください。
重要な注意
理想的には、PCR後室で既に作業が行われている場合は、当日にPCR前室に入室しないでください。どうしても入室できない場合は、必ず事前に手指を丁寧に洗い、専用の白衣を着用してください。PCR後室で使用した実験ノートや書類は、PCR前室に持ち込んではなりません。必要に応じて、プロトコルやサンプルIDなどをコピーして保管してください。
4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス
アッセイ阻害を避けるため、パウダーフリーの手袋を使用してください。正しいピペッティング技術は、汚染の低減に不可欠です。不適切なピペッティングは、液体の分注時に液体が飛び散り、エアロゾルが発生する原因となります。正しいピペッティングのベストプラクティスについては、以下のリンクをご覧ください：Gilson社のピペッティングガイド、Anachem社のピペッティング技術ビデオ、遠心分離チューブは開封前に必ず開封し、液体が飛び散らないように注意して開けてください。使用後は、汚染物質の混入を防ぐため、チューブをすぐに閉じてください。
複数の反応を行う場合は、共通の試薬（水、dNTP、バッファー、プライマー、酵素など）を含むマスターミックスを1つ用意してください。これにより、試薬の移し替え回数を最小限に抑え、コンタミネーションのリスクを軽減できます。マスターミックスは氷上または冷却ブロック上で調製することをお勧めします。ホットスタート酵素を使用すると、非特異的な産物の生成を低減できる場合があります。蛍光プローブを含む試薬は、分解を防ぐため、光から保護してください。
5. 内部統制
すべての反応において、特性が十分に解析され、確認済みの陽性コントロールおよび陰性コントロール、そして鋳型なしのコントロールを、また定量反応においては多点滴定トレンドラインを用いて実施してください。陽性コントロールは、コンタミネーションリスクを引き起こすほど強力なものであってはなりません。核酸抽出を行う際には、陽性および陰性の抽出コントロールを必ず使用してください。
各エリアに明確な指示を掲示し、利用者が行動規範を認識できるようにすることをお勧めします。臨床サンプル中に非常に微量のDNAまたはRNAを検出する診断ラボでは、PCR前室をわずかに正圧に、PCR後室をわずかに負圧に設定した独立した空調システムを設置するなど、追加の安全対策を講じることをお勧めします。
最後に、品質保証（QA）計画を策定することが有用です。このような計画には、試薬のマスターストックとワーキングストックのリスト、キットと試薬の保管ルール、管理結果の報告、スタッフのトレーニングプログラム、トラブルシューティングアルゴリズム、そして必要に応じた是正措置を含める必要があります。
6. 参考文献
Aslan A、Kinzelman J、Dreelin E、Anan'eva T、Lavander J. 第3章：qPCRラボの設置。USEPA qPCR法1611を用いたレクリエーション水域の検査に関するガイダンス文書。ランシング - ミシガン州立大学。
イングランド公衆衛生局（NHS）「英国微生物学検査基準：分子増幅アッセイ実施時の優良実験室基準（GLP）」品質ガイダンス。2013;4(4):1–15。
ミフリンT.PCRラボの設置.コールドスプリングハーブプロトコル.2007;7.
Schroeder S. 2013. 遠心分離機の日常メンテナンス：遠心分離機、ローター、アダプターの洗浄、メンテナンス、消毒（ホワイトペーパー No. 14）. ハンブルク：エッペンドルフ; 2013.
Viana RV、Wallis CL. 診断検査室で使用される分子検査のための適正臨床検査基準（GCLP）, Akyar I編著. 品質管理の幅広い範囲. リエカ（クロアチア）: Intech; 2011: 29–52.
投稿日時: 2020年7月16日
