Οι μέθοδοι μοριακής ανίχνευσης έχουν την ικανότητα να παράγουν μεγάλο όγκο νουκλεϊκού οξέος μέσω της ενίσχυσης ιχνοποσοτήτων που βρίσκονται σε δείγματα. Ενώ αυτό είναι ωφέλιμο για την ενεργοποίηση της ευαίσθητης ανίχνευσης, εισάγει επίσης την πιθανότητα μόλυνσης μέσω της εξάπλωσης αερολυμάτων ενίσχυσης στο εργαστηριακό περιβάλλον. Κατά τη διεξαγωγή πειραμάτων, μπορούν να ληφθούν μέτρα για την αποφυγή της μόλυνσης των αντιδραστηρίων, του εργαστηριακού εξοπλισμού και του χώρου των εργαστηρίων, καθώς μια τέτοια μόλυνση μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά (ή ψευδώς αρνητικά) αποτελέσματα.
Για να μειωθεί η πιθανότητα μόλυνσης, θα πρέπει να εφαρμόζεται η Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική ανά πάσα στιγμή. Συγκεκριμένα, θα πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις σχετικά με τα ακόλουθα σημεία:
1. Χειρισμός αντιδραστηρίων
2. Οργάνωση χώρου εργασίας και εξοπλισμού
3. Συμβουλές χρήσης και καθαρισμού για τον καθορισμένο μοριακό χώρο
4. Γενικές συμβουλές μοριακής βιολογίας
5. Εσωτερικοί έλεγχοι
6. Βιβλιογραφία
1. Χειρισμός αντιδραστηρίων
Φυγοκεντρήστε σύντομα τα σωληνάρια αντιδραστηρίων πριν το άνοιγμα για να αποφύγετε τη δημιουργία αερολυμάτων. Διαχωρίστε τα αντιδραστήρια σε κλάσματα για να αποφύγετε τις πολλαπλές καταψύξεις-αποψύξεις και τη μόλυνση των κύριων αποθεμάτων. Επισημάνετε και χρονολογήστε με σαφήνεια όλα τα σωληνάρια αντιδραστηρίων και αντιδράσεων και τηρείτε αρχεία καταγραφής των αριθμών παρτίδας και παρτίδας αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Πιπετάρετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα χρησιμοποιώντας ρύγχη φίλτρου. Πριν από την αγορά, συνιστάται να επιβεβαιώσετε με τον κατασκευαστή ότι τα ρύγχη φίλτρου ταιριάζουν με τη μάρκα της πιπέτας που θα χρησιμοποιηθεί.
2. Οργάνωση χώρου εργασίας και εξοπλισμού
Ο χώρος εργασίας θα πρέπει να οργανώνεται έτσι ώστε να διασφαλίζεται η ροή της εργασίας προς μία κατεύθυνση, από τις καθαρές περιοχές (πριν την PCR) έως τις βρώμικες περιοχές (μετά την PCR). Οι ακόλουθες γενικές προφυλάξεις θα βοηθήσουν στη μείωση της πιθανότητας μόλυνσης. Να έχετε ξεχωριστούς χώρους ή τουλάχιστον φυσικά ξεχωριστούς χώρους για: παρασκευή mastermix, εξαγωγή νουκλεϊκού οξέος και προσθήκη προτύπου DNA, ενίσχυση και χειρισμό του ενισχυμένου προϊόντος και ανάλυση προϊόντος, π.χ. ηλεκτροφόρηση σε γέλη.
Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ύπαρξη 4 ξεχωριστών δωματίων είναι δύσκολη. Μια πιθανή αλλά λιγότερο επιθυμητή επιλογή είναι η προετοιμασία του κύριου μείγματος σε μια περιοχή περιορισμού, π.χ. ένα θάλαμο στρωτής ροής. Στην περίπτωση της ενίσχυσης με ένθετη PCR, η προετοιμασία του κύριου μείγματος για την αντίδραση δεύτερου γύρου θα πρέπει να γίνεται στην «καθαρή» περιοχή για την προετοιμασία του κύριου μείγματος, αλλά ο εμβολιασμός με το κύριο προϊόν PCR θα πρέπει να γίνεται στο δωμάτιο ενίσχυσης και, ει δυνατόν, σε μια ειδική περιοχή περιορισμού (π.χ. ένα θάλαμο στρωτής ροής).
Κάθε δωμάτιο/περιοχή χρειάζεται ξεχωριστό σετ από σαφώς επισημασμένες πιπέτες, ρύγχη φίλτρων, βάσεις σωληναρίων, στροβίλους, φυγοκεντρητές (εάν υπάρχουν), στυλό, γενικά αντιδραστήρια εργαστηρίου, εργαστηριακές ρόμπες και κουτιά με γάντια, τα οποία θα παραμείνουν στους αντίστοιχους σταθμούς εργασίας τους. Τα χέρια πρέπει να πλένονται και τα γάντια και οι εργαστηριακές ρόμπες να αλλάζονται κατά τη μετακίνηση μεταξύ των καθορισμένων περιοχών. Τα αντιδραστήρια και ο εξοπλισμός δεν πρέπει να μετακινούνται από μια βρώμικη περιοχή σε μια καθαρή. Σε περίπτωση ακραίας περίπτωσης όπου ένα αντιδραστήριο ή ένα κομμάτι εξοπλισμού πρέπει να μετακινηθεί προς τα πίσω, πρέπει πρώτα να απολυμανθεί με 10% υποχλωριώδες νάτριο και στη συνέχεια να σκουπιστεί με αποστειρωμένο νερό.
Σημείωμα
Το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 10% πρέπει να παρασκευάζεται φρέσκο καθημερινά. Όταν χρησιμοποιείται για απολύμανση, θα πρέπει να τηρείται ελάχιστος χρόνος επαφής 10 λεπτών.
Εναλλακτικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα που έχουν επικυρωθεί ως απολυμαντικά επιφανειών που καταστρέφουν το DNA, εάν οι τοπικές συστάσεις ασφαλείας δεν επιτρέπουν τη χρήση υποχλωριώδους νατρίου ή εάν το υποχλωριώδες νάτριο δεν είναι κατάλληλο για την απολύμανση των μεταλλικών μερών του εξοπλισμού.
Ιδανικά, το προσωπικό θα πρέπει να τηρεί την ηθική της μονοκατευθυντικής ροής εργασίας και να μην επιστρέφει από βρώμικες περιοχές (μετά την PCR) σε καθαρές περιοχές (πριν την PCR) την ίδια ημέρα. Ωστόσο, μπορεί να υπάρχουν περιπτώσεις όπου αυτό είναι αναπόφευκτο. Όταν προκύψει τέτοια περίπτωση, το προσωπικό πρέπει να φροντίζει να πλένει σχολαστικά τα χέρια του, να αλλάζει γάντια, να χρησιμοποιεί την καθορισμένη εργαστηριακή ρόμπα και να μην εισάγει ξανά εξοπλισμό που θα θέλει να βγάλει από το δωμάτιο, όπως εργαστηριακά βιβλία. Τέτοια μέτρα ελέγχου θα πρέπει να τονίζονται στην εκπαίδευση του προσωπικού σχετικά με τις μοριακές μεθόδους.
Μετά τη χρήση, οι χώροι των πάγκων θα πρέπει να καθαρίζονται με 10% υποχλωριώδες νάτριο (ακολουθούμενο από αποστειρωμένο νερό για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων χλωρίνης), 70% αιθανόλη ή ένα επικυρωμένο εμπορικά διαθέσιμο απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA. Ιδανικά, θα πρέπει να τοποθετούνται λάμπες υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) για να καθίσταται δυνατή η απολύμανση με ακτινοβολία. Ωστόσο, η χρήση λαμπτήρων UV θα πρέπει να περιορίζεται σε κλειστούς χώρους εργασίας, π.χ. ερμάρια ασφαλείας, προκειμένου να περιοριστεί η έκθεση του προσωπικού του εργαστηρίου στην υπεριώδη ακτινοβολία. Παρακαλούμε να τηρείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη φροντίδα, τον αερισμό και τον καθαρισμό των λαμπτήρων UV, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι οι λαμπτήρες παραμένουν αποτελεσματικοί.
Εάν χρησιμοποιείτε αιθανόλη 70% αντί για υποχλωριώδες νάτριο, θα χρειαστεί ακτινοβολία με υπεριώδη ακτινοβολία για την ολοκλήρωση της απολύμανσης.
Μην καθαρίζετε το vortex και τη φυγόκεντρο με υποχλωριώδες νάτριο. Αντίθετα, σκουπίστε με αιθανόλη 70% και εκθέστε την σε υπεριώδη ακτινοβολία ή χρησιμοποιήστε ένα εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA. Για διαρροές, επικοινωνήστε με τον κατασκευαστή για περαιτέρω συμβουλές καθαρισμού. Εάν οι οδηγίες του κατασκευαστή το επιτρέπουν, οι πιπέτες θα πρέπει να αποστειρώνονται τακτικά σε αυτόκλειστο. Εάν οι πιπέτες δεν μπορούν να αποστειρωθούν σε αυτόκλειστο, θα πρέπει να αρκεί να τις καθαρίσετε με υποχλωριώδες νάτριο 10% (ακολουθούμενο από σχολαστικό σκούπισμα με αποστειρωμένο νερό) ή με ένα εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA και στη συνέχεια έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία.
Ο καθαρισμός με υποχλωριώδες νάτριο υψηλού ποσοστού μπορεί τελικά να προκαλέσει ζημιά στα πλαστικά και τα μέταλλα των πιπετών, εάν γίνεται σε τακτική βάση. Ελέγξτε πρώτα τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όλος ο εξοπλισμός πρέπει να βαθμονομείται τακτικά σύμφωνα με το πρόγραμμα που συνιστά ο κατασκευαστής. Ένα ορισμένο άτομο θα πρέπει να είναι υπεύθυνο για τη διασφάλιση της τήρησης του προγράμματος βαθμονόμησης, της τήρησης λεπτομερών αρχείων καταγραφής και της ευκρινούς εμφάνισης των ετικετών σέρβις στον εξοπλισμό.
3. Συμβουλές χρήσης και καθαρισμού για τον καθορισμένο μοριακό χώρο
Προ-PCR: Δείγματα αντιδραστηρίων / προετοιμασία κύριου μείγματος: Αυτός θα πρέπει να είναι ο καθαρότερος από όλους τους χώρους που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία μοριακών πειραμάτων και ιδανικά θα πρέπει να είναι ένας καθορισμένος θάλαμος στρωτής ροής εξοπλισμένος με υπεριώδη ακτινοβολία. Δείγματα, εκχυλισμένο νουκλεϊκό οξύ και ενισχυμένα προϊόντα PCR δεν πρέπει να χειρίζονται σε αυτόν τον χώρο. Τα αντιδραστήρια ενίσχυσης θα πρέπει να φυλάσσονται σε καταψύκτη (ή ψυγείο, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή) στον ίδιο καθορισμένο χώρο, ιδανικά δίπλα στον θάλαμο στρωτής ροής ή στην περιοχή προ-PCR. Τα γάντια θα πρέπει να αλλάζονται κάθε φορά που εισέρχεστε στον χώρο προ-PCR ή στον θάλαμο στρωτής ροής.
Η περιοχή προ-PCR ή ο θάλαμος στρωτής ροής πρέπει να καθαρίζεται πριν και μετά τη χρήση ως εξής: Σκουπίστε όλα τα αντικείμενα στον θάλαμο, π.χ. πιπέτες, κουτιά ρυγχών, στροβιλιστή, φυγόκεντρο, βάσεις σωληναρίων, στυλό κ.λπ. με αιθανόλη 70% ή ένα εμπορικό απολυμαντικό που καταστρέφει το DNA, και αφήστε το να στεγνώσει. Στην περίπτωση κλειστού χώρου εργασίας, π.χ. θάλαμος στρωτής ροής, εκθέστε το κάλυμμα σε υπεριώδη ακτινοβολία για 30 λεπτά.
Σημείωμα
Μην εκθέτετε τα αντιδραστήρια σε υπεριώδη ακτινοβολία. Μεταφέρετέ τα στο θάλαμο μόνο αφού καθαριστεί. Εάν εκτελείτε PCR αντίστροφης μεταγραφής, μπορεί επίσης να είναι χρήσιμο να σκουπίσετε τις επιφάνειες και τον εξοπλισμό με ένα διάλυμα που διασπά τις RNάσες κατά την επαφή. Αυτό μπορεί να βοηθήσει στην αποφυγή ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων από την ενζυμική αποικοδόμηση του RNA. Μετά την απολύμανση και πριν από την προετοιμασία του κύριου μείγματος, τα γάντια θα πρέπει να αλλαχθούν για άλλη μια φορά και στη συνέχεια το θάλαμο είναι έτοιμο για χρήση.
Προ-PCR: Εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος/προσθήκη προτύπου:
Το νουκλεϊκό οξύ πρέπει να εκχυλίζεται και να χειρίζεται σε μια δεύτερη καθορισμένη περιοχή, χρησιμοποιώντας ξεχωριστό σετ πιπετών, ρύγχων φίλτρου, βάσεων σωληναρίων, νέων γαντιών, εργαστηριακών ποδιών και άλλου εξοπλισμού. Αυτή η περιοχή προορίζεται επίσης για την προσθήκη προτύπου, μαρτύρων και γραμμών τάσης στα σωληνάρια ή τις πλάκες του κύριου μείγματος. Για να αποφευχθεί η μόλυνση των εκχυλισμένων δειγμάτων νουκλεϊκού οξέος που αναλύονται, συνιστάται η αλλαγή γαντιών πριν από τον χειρισμό θετικών μαρτύρων ή προτύπων και η χρήση ξεχωριστού σετ πιπετών. Τα αντιδραστήρια PCR και τα ενισχυμένα προϊόντα δεν πρέπει να πιπετάρονται σε αυτήν την περιοχή. Τα δείγματα πρέπει να αποθηκεύονται σε καθορισμένα ψυγεία ή καταψύκτες στην ίδια περιοχή. Ο χώρος εργασίας των δειγμάτων πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του κύριου μείγματος.
Μετά την PCR: Ενίσχυση και χειρισμός του ενισχυμένου προϊόντος
Αυτός ο καθορισμένος χώρος προορίζεται για διαδικασίες μετά την ενίσχυση και θα πρέπει να είναι φυσικά ξεχωριστός από τις περιοχές πριν από την PCR. Συνήθως περιέχει θερμοκυκλοποιητές και πλατφόρμες πραγματικού χρόνου και, ιδανικά, θα πρέπει να διαθέτει θάλαμο στρωτής ροής για την προσθήκη του προϊόντος PCR του γύρου 1 στην αντίδραση του γύρου 2, εάν εκτελείται ένθετη PCR. Τα αντιδραστήρια PCR και το εκχυλισμένο νουκλεϊκό οξύ δεν πρέπει να χειρίζονται σε αυτήν την περιοχή, καθώς ο κίνδυνος μόλυνσης είναι υψηλός. Αυτή η περιοχή θα πρέπει να διαθέτει ξεχωριστό σετ γαντιών, εργαστηριακών ποδιών, θήκες πλακών και σωληναρίων, πιπέτες, ρύγχη φίλτρου, κάδους και άλλου εξοπλισμού. Τα σωληνάρια πρέπει να φυγοκεντρούνται πριν από το άνοιγμα. Ο χώρος εργασίας του δείγματος θα πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του κύριου μείγματος.
Μετά την PCR: Ανάλυση προϊόντος
Αυτό το δωμάτιο προορίζεται για εξοπλισμό ανίχνευσης προϊόντων, π.χ. δεξαμενές ηλεκτροφόρησης γέλης, τροφοδοτικά, υπεριώδη διαφωτιστή και το σύστημα τεκμηρίωσης γέλης. Αυτός ο χώρος θα πρέπει να διαθέτει ξεχωριστά σετ γαντιών, εργαστηριακών ποδιών, βάσεις πλακών και σωληναρίων, πιπέτες, ρύγχη φίλτρων, κάδους και άλλου εξοπλισμού. Δεν επιτρέπεται η εισαγωγή άλλων αντιδραστηρίων σε αυτόν τον χώρο, εκτός από τη χρωστική φόρτωσης, τον μοριακό δείκτη και τη γέλη αγαρόζης, καθώς και τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος. Ο χώρος εργασίας των δειγμάτων θα πρέπει να καθαρίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως ο χώρος του κύριου μείγματος.
Σημαντική σημείωση
Ιδανικά, δεν θα πρέπει να γίνεται είσοδος στις αίθουσες πριν από την PCR την ίδια ημέρα, εάν έχει ήδη πραγματοποιηθεί εργασία στις αίθουσες μετά την PCR. Εάν αυτό είναι εντελώς αναπόφευκτο, βεβαιωθείτε ότι τα χέρια σας έχουν πλυθεί καλά και ότι φοριούνται οι συγκεκριμένες εργαστηριακές ρόμπες στις αίθουσες. Δεν πρέπει να φέρνετε τα εργαστηριακά βιβλία και τα έγγραφα στις αίθουσες πριν από την PCR, εάν έχουν χρησιμοποιηθεί στις αίθουσες μετά την PCR. Εάν είναι απαραίτητο, πάρτε αντίγραφα εκτυπώσεων πρωτοκόλλων/ταυτοτήτων δειγμάτων κ.λπ.
4. Γενικές συμβουλές μοριακής βιολογίας
Χρησιμοποιήστε γάντια χωρίς πούδρα για να αποφύγετε την αναστολή της δοκιμασίας. Η σωστή τεχνική αναρρόφησης με πιπέτα είναι ύψιστης σημασίας για τη μείωση της μόλυνσης. Η λανθασμένη αναρρόφηση με πιπέτα μπορεί να οδηγήσει σε πιτσίλισμα κατά τη χορήγηση υγρών και στη δημιουργία αερολυμάτων. Ορθές πρακτικές για τη σωστή αναρρόφηση με πιπέτα μπορείτε να βρείτε στους ακόλουθους συνδέσμους: Οδηγός Gilson για αναρρόφηση με πιπέτα, Βίντεο τεχνικής αναρρόφησης με πιπέτα Anachem, Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες πριν το άνοιγμα και ανοίξτε τους προσεκτικά για να αποφύγετε το πιτσίλισμα. Κλείστε τους σωλήνες αμέσως μετά τη χρήση για να αποφύγετε την εισαγωγή ρύπων.
Όταν εκτελείτε πολλαπλές αντιδράσεις, παρασκευάστε ένα κύριο μείγμα που περιέχει κοινά αντιδραστήρια (π.χ. νερό, dNTP, ρυθμιστικό διάλυμα, εκκινητές και ένζυμο) για να ελαχιστοποιήσετε τον αριθμό των μεταφορών αντιδραστηρίων και να μειώσετε την απειλή μόλυνσης. Συνιστάται η προετοιμασία του κύριου μείγματος σε πάγο ή σε ψυχρό μπλοκ. Η χρήση ενζύμου Hot Start μπορεί να βοηθήσει στη μείωση της παραγωγής μη ειδικών προϊόντων. Προστατέψτε τα αντιδραστήρια που περιέχουν φθορίζοντες ανιχνευτές από το φως για να αποφύγετε την υποβάθμιση.
5. Εσωτερικοί έλεγχοι
Συμπεριλάβετε καλά χαρακτηρισμένους, επιβεβαιωμένους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, μαζί με έναν μάρτυρα χωρίς πρότυπο σε όλες τις αντιδράσεις και μια γραμμή τάσης πολλαπλών σημείων τιτλοδοτημένης ανάλυσης για τις ποσοτικές αντιδράσεις. Ο θετικός μάρτυρας δεν πρέπει να είναι τόσο ισχυρός ώστε να ενέχει κίνδυνο μόλυνσης. Συμπεριλάβετε θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες εκχύλισης κατά την εκτέλεση εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων.
Συνιστάται η ανάρτηση σαφών οδηγιών σε κάθε περιοχή, ώστε οι χρήστες να γνωρίζουν τους κανόνες δεοντολογίας. Τα διαγνωστικά εργαστήρια που ανιχνεύουν πολύ χαμηλά επίπεδα DNA ή RNA σε κλινικά δείγματα ενδέχεται να θελήσουν να υιοθετήσουν το πρόσθετο μέτρο ασφαλείας, δηλαδή να διαθέτουν ξεχωριστά συστήματα χειρισμού αέρα με ελαφρώς θετική πίεση αέρα στους χώρους πριν από την PCR και ελαφρώς αρνητική πίεση αέρα στους χώρους μετά την PCR.
Τέλος, η ανάπτυξη ενός σχεδίου διασφάλισης ποιότητας (QA) είναι χρήσιμη. Ένα τέτοιο σχέδιο θα πρέπει να περιλαμβάνει καταλόγους κύριων αποθεμάτων αντιδραστηρίων και αποθεμάτων εργασίας, κανόνες για την αποθήκευση κιτ και αντιδραστηρίων, αναφορά αποτελεσμάτων ελέγχου, προγράμματα εκπαίδευσης προσωπικού, αλγόριθμους αντιμετώπισης προβλημάτων και διορθωτικές ενέργειες όταν χρειάζεται.
6. Βιβλιογραφία
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Κεφάλαιο 3: Δημιουργία εργαστηρίου qPCR. Έγγραφο καθοδήγησης για τον έλεγχο υδάτων αναψυχής χρησιμοποιώντας τη μέθοδο qPCR 1611 της USEPA. Πανεπιστήμιο Lansing- Michigan State.
Δημόσια Υγεία Αγγλίας, NHS. Πρότυπα του Ηνωμένου Βασιλείου για μικροβιολογικές έρευνες: Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική κατά την εκτέλεση δοκιμασιών μοριακής ενίσχυσης). Οδηγίες Ποιότητας. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Δημιουργία εργαστηρίου PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Τακτική συντήρηση φυγοκεντρητών: καθαρισμός, συντήρηση και απολύμανση φυγοκεντρητών, ρότορων και προσαρμογέων (Λευκή βίβλος αριθ. 14). Αμβούργο: Eppendorf· 2013.
Viana RV, Wallis CL. Ορθή Κλινική Εργαστηριακή Πρακτική (GCLP) για μοριακές δοκιμές που χρησιμοποιούνται σε διαγνωστικά εργαστήρια, Στο: Akyar I, επιμελητής. Ευρύ φάσμα ποιοτικού ελέγχου. Ριέκα, Κροατία: Intech; 2011: 29–52.
Ώρα δημοσίευσης: 16 Ιουλίου 2020
