आणविक परीक्षणको लागि के गर्ने र के नगर्ने

आणविक पत्ता लगाउने विधिहरूमा नमूनाहरूमा पाइने ट्रेस मात्राको प्रवर्धन मार्फत ठूलो मात्रामा न्यूक्लिक एसिड उत्पादन गर्ने क्षमता हुन्छ। संवेदनशील पत्ता लगाउन सक्षम पार्न यो लाभदायक भएतापनि, यसले प्रयोगशाला वातावरणमा प्रवर्धन एरोसोलको फैलावट मार्फत प्रदूषणको सम्भावनालाई पनि परिचय गराउँछ। प्रयोगहरू सञ्चालन गर्दा, अभिकर्मकहरू, प्रयोगशाला उपकरणहरू र बेन्च स्पेसको प्रदूषणबाट बच्न उपायहरू गर्न सकिन्छ, किनकि यस्तो प्रदूषणले गलत-सकारात्मक (वा गलत-नकारात्मक) परिणामहरू उत्पन्न गर्न सक्छ।

प्रदूषणको सम्भावना कम गर्न, सधैं राम्रो प्रयोगशाला अभ्यास अभ्यास गर्नुपर्छ। विशेष गरी, निम्न बुँदाहरूमा सावधानी अपनाउनु पर्छ:

१. अभिकर्मकहरू ह्यान्डल गर्ने
२. कार्यस्थल र उपकरणको संगठन
३. तोकिएको आणविक ठाउँको लागि प्रयोग र सफाई सल्लाह
४. सामान्य आणविक जीवविज्ञान सल्लाह
५. आन्तरिक नियन्त्रणहरू
६. ग्रन्थसूची

१. अभिकर्मकहरू ह्यान्डल गर्ने

एरोसोलको उत्पादनबाट बच्न खोल्नु अघि सेन्ट्रीफ्यूज अभिकर्मक ट्यूबहरू छोटो रूपमा राख्नुहोस्। धेरै फ्रिज-थाउ र मास्टर स्टकको दूषितताबाट बच्न अभिकर्मकहरू एकै ठाउँमा राख्नुहोस्। सबै अभिकर्मक र प्रतिक्रिया ट्यूबहरूलाई स्पष्ट रूपमा लेबल गर्नुहोस् र मिति दिनुहोस् र सबै प्रयोगहरूमा प्रयोग गरिएका अभिकर्मक लट र ब्याच नम्बरहरूको लगहरू राख्नुहोस्। फिल्टर टिपहरू प्रयोग गरेर सबै अभिकर्मकहरू र नमूनाहरूलाई पिपेट गर्नुहोस्। खरिद गर्नु अघि, निर्मातासँग पुष्टि गर्न सल्लाह दिइन्छ कि फिल्टर टिपहरू प्रयोग गरिने पिपेटको ब्रान्डसँग मिल्छ।

२. कार्यस्थल र उपकरणको संगठन

सफा क्षेत्रहरू (PCR-पूर्व) देखि फोहोर क्षेत्रहरू (PCR पछि) सम्म कामको प्रवाह एक दिशामा हुने कुरा सुनिश्चित गर्न कार्यस्थल व्यवस्थित गरिनुपर्छ। निम्न सामान्य सावधानीहरूले प्रदूषणको सम्भावना कम गर्न मद्दत गर्नेछ। छुट्टै तोकिएका कोठाहरू, वा कम्तिमा भौतिक रूपमा अलग क्षेत्रहरू राख्नुहोस्, जसको लागि: मास्टरमिक्स तयारी, न्यूक्लिक एसिड निकासी र DNA टेम्प्लेट थप, प्रवर्धित उत्पादनको प्रवर्धन र ह्यान्डलिङ, र उत्पादन विश्लेषण, जस्तै जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस।

केही सेटिङहरूमा, ४ वटा छुट्टाछुट्टै कोठा हुनु गाह्रो हुन्छ। एउटा सम्भावित तर कम वांछनीय विकल्प भनेको कन्टेनमेन्ट क्षेत्रमा मास्टरमिक्स तयारी गर्नु हो, जस्तै ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट। नेस्टेड पीसीआर एम्प्लिफिकेशनको अवस्थामा, दोस्रो राउन्ड प्रतिक्रियाको लागि मास्टरमिक्सको तयारी मास्टरमिक्स तयारीको लागि 'सफा' क्षेत्रमा तयार गर्नुपर्छ, तर प्राथमिक पीसीआर उत्पादनको साथ इनोकुलेशन एम्प्लिफिकेशन कोठामा गर्नुपर्छ, र यदि सम्भव छ भने समर्पित कन्टेनमेन्ट क्षेत्रमा (जस्तै ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट)।

प्रत्येक कोठा/क्षेत्रलाई स्पष्ट रूपमा लेबल गरिएका पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्युब र्‍याक, भोर्टेक्स, सेन्ट्रीफ्यूज (यदि सान्दर्भिक भएमा), कलम, जेनेरिक ल्याब अभिकर्मक, ल्याब कोट र पन्जाका बक्सहरूको छुट्टै सेट चाहिन्छ जुन आ-आफ्नो कार्यस्थानमा रहनेछन्। तोकिएको क्षेत्रहरू बीच सर्दा हात धुनुपर्छ र पन्जा र प्रयोगशाला कोटहरू परिवर्तन गर्नुपर्छ। अभिकर्मक र उपकरणहरू फोहोर क्षेत्रबाट सफा क्षेत्रमा सार्न हुँदैन। यदि कुनै चरम अवस्था उत्पन्न हुन्छ जहाँ अभिकर्मक वा उपकरणको टुक्रा पछाडि सार्नु पर्छ भने, यसलाई पहिले १०% सोडियम हाइपोक्लोराइटले निर्जंतुक गर्नुपर्छ, त्यसपछि बाँझ पानीले पुछ्नुपर्छ।

नोट

१०% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल दैनिक ताजा बनाउनु पर्छ। कीटाणुशोधनको लागि प्रयोग गर्दा, न्यूनतम १० मिनेटको सम्पर्क समय पालना गर्नुपर्छ।
वैकल्पिक रूपमा, यदि स्थानीय सुरक्षा सिफारिसहरूले सोडियम हाइपोक्लोराइटको प्रयोगलाई अनुमति दिँदैनन् वा यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट उपकरणको धातु भागहरूलाई प्रदूषित गर्न उपयुक्त छैन भने, DNA-विनाशक सतह निवारकको रूपमा प्रमाणित व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध उत्पादनहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ।

आदर्श रूपमा, कर्मचारीहरूले एकतर्फी कार्यप्रवाहको आचारसंहिताको पालना गर्नुपर्छ र फोहोर क्षेत्रहरू (PCR पछि) बाट एकै दिन सफा क्षेत्रहरू (PCR अघि) मा फर्कनु हुँदैन। यद्यपि, यस्तो अवस्था आउन सक्छ जब यो अपरिहार्य हुन्छ। जब यस्तो अवसर आउँछ, कर्मचारीहरूले हात राम्ररी धुने, पन्जा परिवर्तन गर्ने, तोकिएको प्रयोगशाला कोट प्रयोग गर्ने र प्रयोगशाला पुस्तकहरू जस्ता कोठाबाट फेरि बाहिर लैजान चाहने कुनै पनि उपकरणहरू प्रयोग नगर्ने कुरामा ध्यान दिनुपर्छ। आणविक विधिहरूमा कर्मचारी प्रशिक्षणमा यस्ता नियन्त्रण उपायहरूलाई जोड दिनुपर्छ।

प्रयोग पछि, बेन्च स्पेसहरू १०% सोडियम हाइपोक्लोराइट (अवशिष्ट ब्लीच हटाउन बाँझ पानीले त्यसपछि), ७०% इथेनॉल, वा व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध DNA-विनाशक डिकन्टामिनेन्टले सफा गर्नुपर्छ। आदर्श रूपमा, विकिरणद्वारा डिकन्टामिनेसन सक्षम पार्न अल्ट्रा-भाइलेट (UV) बत्तीहरू जडान गर्नुपर्छ। यद्यपि, प्रयोगशाला कर्मचारीहरूको UV एक्सपोजर सीमित गर्न UV बत्तीहरूको प्रयोग बन्द कार्य क्षेत्रहरू, जस्तै सुरक्षा क्याबिनेटहरूमा सीमित हुनुपर्छ। बत्तीहरू प्रभावकारी रहन सुनिश्चित गर्न UV बत्ती हेरचाह, भेन्टिलेसन र सफाईको लागि निर्माता निर्देशनहरू पालना गर्नुहोस्।

यदि सोडियम हाइपोक्लोराइटको सट्टा ७०% इथेनॉल प्रयोग गरिन्छ भने, निर्जंतुकीकरण पूरा गर्न यूभी प्रकाशको साथ विकिरण आवश्यक पर्दछ।
भोर्टेक्स र सेन्ट्रीफ्यूजलाई सोडियम हाइपोक्लोराइटले सफा नगर्नुहोस्; बरु, ७०% इथेनॉलले पुछ्नुहोस् र यूभी प्रकाशमा पर्दाफास गर्नुहोस्, वा व्यावसायिक डीएनए-विनाशक डिकन्टामिनेन्ट प्रयोग गर्नुहोस्। फैलिएको खण्डमा, थप सफाई सल्लाहको लागि निर्मातासँग जाँच गर्नुहोस्। यदि निर्माताको निर्देशनले अनुमति दिन्छ भने, पिपेट्सलाई नियमित रूपमा अटोक्लेभद्वारा निर्जंतुकीकरण गर्नुपर्छ। यदि पिपेट्सलाई अटोक्लेभ गर्न सकिँदैन भने, तिनीहरूलाई १०% सोडियम हाइपोक्लोराइट (त्यसपछि बाँझ पानीले राम्ररी पुछ्नुहोस्) वा व्यावसायिक डीएनए-विनाशक डिकन्टामिनेन्ट र त्यसपछि यूभी एक्सपोजरले सफा गर्न पर्याप्त हुन्छ।

उच्च-प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइटले नियमित रूपमा सफाई गर्दा पिपेट प्लास्टिक र धातुहरूलाई क्षति पुर्‍याउन सक्छ; पहिले निर्माताबाट सिफारिसहरू जाँच गर्नुहोस्। सबै उपकरणहरू निर्माताले सिफारिस गरेको तालिका अनुसार नियमित रूपमा क्यालिब्रेट गर्न आवश्यक छ। क्यालिब्रेसन तालिका पालना गरिएको छ, विस्तृत लगहरू राखिएको छ, र उपकरणहरूमा सेवा लेबलहरू स्पष्ट रूपमा प्रदर्शित छन् भनी सुनिश्चित गर्ने जिम्मेवारी तोकिएको व्यक्तिको हुनुपर्छ।

३. तोकिएको आणविक ठाउँको लागि प्रयोग र सफाई सल्लाह

प्रि-पीसीआर: अभिकर्मक एलिक्वोटिङ / मास्टरमिक्स तयारी: यो आणविक प्रयोगहरूको तयारीको लागि प्रयोग गरिने सबै ठाउँहरूमध्ये सबैभन्दा सफा हुनुपर्छ र आदर्श रूपमा यूभी प्रकाशले सुसज्जित तोकिएको ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट हुनुपर्छ। यस क्षेत्रमा नमूनाहरू, निकालिएका न्यूक्लिक एसिड र एम्पलीफाइड पीसीआर उत्पादनहरू ह्यान्डल गर्नु हुँदैन। एम्पलीफाइड अभिकर्मकहरूलाई फ्रिजरमा (वा निर्माताको सिफारिस अनुसार रेफ्रिजरेटर) एउटै तोकिएको ठाउँमा राख्नुपर्छ, आदर्श रूपमा ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट वा प्रि-पीसीआर क्षेत्रको छेउमा। प्रि-पीसीआर क्षेत्र वा ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेटमा प्रवेश गर्दा प्रत्येक पटक पन्जा परिवर्तन गर्नुपर्छ।

प्रि-पीसीआर क्षेत्र वा ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट प्रयोग गर्नु अघि र पछि निम्नानुसार सफा गर्नुपर्छ: क्याबिनेटमा भएका सबै वस्तुहरू, जस्तै पिपेट्स, टिप बक्सहरू, भोर्टेक्स, सेन्ट्रीफ्यूज, ट्यूब र्याक, पेन, आदिलाई ७०% इथेनॉल वा व्यावसायिक डीएनए-विनाशक कीटाणुनाशकले पुछ्नुहोस्, र सुक्न दिनुहोस्। बन्द कार्य क्षेत्रको अवस्थामा, जस्तै ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट, हुडलाई ३० मिनेटको लागि यूभी प्रकाशमा राख्नुहोस्।

नोट

अभिकर्मकहरूलाई UV प्रकाशमा नदेखाउनुहोस्; सफा भएपछि मात्र तिनीहरूलाई क्याबिनेटमा सार्नुहोस्। यदि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR गर्दै हुनुहुन्छ भने, सम्पर्कमा RNases लाई तोड्ने घोलले सतहहरू र उपकरणहरू सफा गर्नु पनि उपयोगी हुन सक्छ। यसले RNA को इन्जाइम डिग्रेडेसनबाट हुने गलत-नकारात्मक परिणामहरूबाट बच्न मद्दत गर्न सक्छ। डिकन्टेमिनेशन पछि र मास्टरमिक्स तयार गर्नु अघि, पन्जाहरू फेरि एक पटक परिवर्तन गर्नुपर्छ, र त्यसपछि क्याबिनेट प्रयोगको लागि तयार हुन्छ।

पूर्व-PCR: न्यूक्लिक एसिड निकासी/टेम्प्लेट थप:

न्यूक्लिक एसिड निकालेर दोस्रो तोकिएको क्षेत्रमा ह्यान्डल गर्नुपर्छ, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्युब र्‍याक, ताजा पन्जा, ल्याब कोट र अन्य उपकरणहरूको छुट्टै सेट प्रयोग गर्नुपर्छ। यो क्षेत्र मास्टरमिक्स ट्यूब वा प्लेटहरूमा टेम्प्लेट, नियन्त्रण र ट्रेन्डलाइनहरू थप्नको लागि पनि हो। विश्लेषण गरिँदै गरेको निकासी गरिएको न्यूक्लिक एसिड नमूनाहरूको दूषितताबाट बच्न, सकारात्मक नियन्त्रण वा मापदण्डहरू ह्यान्डल गर्नु अघि पन्जाहरू परिवर्तन गर्न र पिपेट्सको छुट्टै सेट प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ। PCR अभिकर्मकहरू र प्रवर्धित उत्पादनहरू यस क्षेत्रमा पिपेट्स गर्नु हुँदैन। नमूनाहरू एउटै क्षेत्रमा तोकिएको फ्रिज वा फ्रिजरहरूमा भण्डारण गर्नुपर्छ। नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स ठाउँ जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

पीसीआर पछि: प्रवर्धित उत्पादनको प्रवर्धन र ह्यान्डलिङ

यो तोकिएको ठाउँ प्रवर्धन पछिको प्रक्रियाहरूको लागि हो र पूर्व-PCR क्षेत्रहरूबाट भौतिक रूपमा अलग हुनुपर्छ। यसमा सामान्यतया थर्मोसाइक्लरहरू र वास्तविक-समय प्लेटफर्महरू हुन्छन्, र आदर्श रूपमा राउन्ड १ PCR उत्पादनलाई राउन्ड २ प्रतिक्रियामा थप्नको लागि ल्यामिनार फ्लो क्याबिनेट हुनुपर्छ, यदि नेस्टेड PCR प्रदर्शन भइरहेको छ भने। प्रदूषणको जोखिम उच्च भएकोले यस क्षेत्रमा PCR अभिकर्मकहरू र निकालिएको न्यूक्लिक एसिड ह्यान्डल गर्नु हुँदैन। यस क्षेत्रमा पन्जा, ल्याब कोट, प्लेट र ट्यूब र्याक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, बिन र अन्य उपकरणहरूको छुट्टै सेट हुनुपर्छ। ट्यूबहरू खोल्नु अघि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुपर्छ। नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स स्पेस जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

पीसीआर पछि: उत्पादन विश्लेषण

यो कोठा उत्पादन पत्ता लगाउने उपकरणहरूको लागि हो, जस्तै जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्याङ्कहरू, पावर प्याकहरू, UV ट्रान्सिल्युमिनेटर र जेल कागजात प्रणाली। यस क्षेत्रमा पन्जा, ल्याब कोटहरू, प्लेट र ट्यूब र्‍याकहरू, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, बिन र अन्य उपकरणहरूको छुट्टै सेट हुनुपर्छ। लोडिङ डाई, आणविक मार्कर र एगारोज जेल, र बफर कम्पोनेन्टहरू बाहेक यस क्षेत्रमा अन्य कुनै पनि अभिकर्मकहरू ल्याउन सकिँदैन। नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स स्पेस जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

महत्त्वपूर्ण टिप्पणी

आदर्श रूपमा, यदि PCR पछिको कोठाहरूमा पहिले नै काम भइसकेको छ भने, पूर्व-PCR कोठाहरूमा सोही दिन प्रवेश गर्नु हुँदैन। यदि यो पूर्णतया अपरिहार्य छ भने, पहिले हातहरू राम्ररी धोएको र कोठाहरूमा विशेष प्रयोगशाला कोट लगाएको सुनिश्चित गर्नुहोस्। प्रयोगशाला पुस्तकहरू र कागजपत्रहरू PCR पछिको कोठाहरूमा प्रयोग गरिएको छ भने, पूर्व-PCR कोठाहरूमा लैजानु हुँदैन; आवश्यक भएमा, प्रोटोकल/नमूना ID, आदि को डुप्लिकेट प्रिन्ट-आउटहरू लिनुहोस्।

४. सामान्य आणविक जीवविज्ञान सल्लाह

परीक्षण अवरोधबाट बच्न पाउडर-मुक्त पन्जा प्रयोग गर्नुहोस्। प्रदूषण कम गर्न सही पाइपेटिङ प्रविधि अत्यन्त महत्त्वपूर्ण छ। गलत पाइपेटिङले तरल पदार्थ वितरण गर्दा छ्यापछ्याप हुन सक्छ र एरोसोलहरू सिर्जना हुन सक्छ। सही पाइपेटिङको लागि राम्रो अभ्यास निम्न लिङ्कहरूमा पाउन सकिन्छ: पाइपेटिङको लागि गिलसन गाइड, एनाकेम पाइपेटिङ प्रविधि भिडियोहरू, खोल्नु अघि सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू, र छ्यापबाट बच्न तिनीहरूलाई सावधानीपूर्वक खोल्नुहोस्। दूषित पदार्थहरूको परिचयबाट बच्न प्रयोग पछि तुरुन्तै ट्यूबहरू बन्द गर्नुहोस्।

धेरै प्रतिक्रियाहरू गर्दा, अभिकर्मक स्थानान्तरणको संख्या कम गर्न र प्रदूषणको खतरा कम गर्न सामान्य अभिकर्मकहरू (जस्तै पानी, dNTPs, बफर, प्राइमर र इन्जाइम) भएको एउटा मास्टरमिक्स तयार गर्नुहोस्। मास्टरमिक्सलाई बरफ वा चिसो ब्लकमा सेट अप गर्न सिफारिस गरिन्छ। हट स्टार्ट इन्जाइमको प्रयोगले गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूको उत्पादन कम गर्न मद्दत गर्न सक्छ। क्षयबाट बच्नको लागि फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू भएका अभिकर्मकहरूलाई प्रकाशबाट जोगाउनुहोस्।

५. आन्तरिक नियन्त्रणहरू

राम्रोसँग वर्णन गरिएका, पुष्टि गरिएका सकारात्मक र नकारात्मक नियन्त्रणहरू, सबै प्रतिक्रियाहरूमा टेम्प्लेट बिनाको नियन्त्रण, र मात्रात्मक प्रतिक्रियाहरूको लागि बहु-बिन्दु शीर्षकबद्ध ट्रेन्डलाइन समावेश गर्नुहोस्। सकारात्मक नियन्त्रण यति बलियो हुनु हुँदैन कि यसले प्रदूषण जोखिम निम्त्याउँछ। न्यूक्लिक एसिड निकासी गर्दा सकारात्मक र नकारात्मक निकासी नियन्त्रणहरू समावेश गर्नुहोस्।

प्रयोगकर्ताहरूलाई आचारसंहिता बारे सचेत गराउन प्रत्येक क्षेत्रमा स्पष्ट निर्देशनहरू पोस्ट गर्न सिफारिस गरिन्छ। क्लिनिकल नमूनाहरूमा DNA वा RNA को धेरै कम स्तर पत्ता लगाउने डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाहरूले पूर्व-PCR कोठाहरूमा थोरै सकारात्मक हावाको चाप र PCR पछिको कोठाहरूमा थोरै नकारात्मक हावाको चापको साथ छुट्टै हावा ह्यान्डलिङ प्रणालीहरू राख्ने अतिरिक्त सुरक्षा उपाय अपनाउन सक्छन्।

अन्तमा, गुणस्तर आश्वासन (QA) योजना विकास गर्नु उपयोगी छ। यस्तो योजनामा ​​अभिकर्मक मास्टर स्टक र काम गर्ने स्टकहरूको सूची, किट र अभिकर्मकहरू भण्डारण गर्ने नियमहरू, नियन्त्रण परिणामहरूको रिपोर्टिङ, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रमहरू, समस्या निवारण एल्गोरिदमहरू, र आवश्यक पर्दा उपचारात्मक कार्यहरू समावेश हुनुपर्छ।

६. ग्रन्थसूची

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. अध्याय ३: qPCR प्रयोगशाला स्थापना गर्दै। USEPA qPCR विधि १६११ प्रयोग गरेर मनोरञ्जनात्मक पानी परीक्षणको लागि मार्गदर्शन कागजात। Lansing- Michigan State University।

सार्वजनिक स्वास्थ्य इङ्गल्याण्ड, NHS। सूक्ष्मजीव विज्ञान अनुसन्धानका लागि बेलायती मापदण्डहरू: आणविक प्रवर्धन परीक्षण गर्दा राम्रो प्रयोगशाला अभ्यास)। गुणस्तर मार्गदर्शन। २०१३;४(४):१–१५।

मिफ्लिन टी. पीसीआर प्रयोगशाला स्थापना गर्दै। कोल्ड स्प्रिङ हार्ब प्रोटोक। २००७;७।

श्रोडर एस २०१३। सेन्ट्रीफ्यूजको नियमित मर्मतसम्भार: सेन्ट्रीफ्यूज, रोटर र एडेप्टरहरूको सफाई, मर्मतसम्भार र कीटाणुशोधन (श्वेतपत्र नम्बर १४)। ह्याम्बर्ग: एपेनडोर्फ; २०१३।

भियाना आरभी, वालिस सीएल। डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाहरूमा प्रयोग हुने आणविक आधारित परीक्षणहरूको लागि राम्रो क्लिनिकल प्रयोगशाला अभ्यास (GCLP), इन: अक्यार I, सम्पादक। गुणस्तर नियन्त्रणको विस्तृत स्पेक्ट्रा। रिजेका, क्रोएसिया: इन्टेक; २०११: २९–५२।