Il-metodi ta' skoperta molekulari għandhom il-ħila li jipproduċu volum kbir ta' aċidu nuklejku permezz tal-amplifikazzjoni ta' kwantitajiet traċċabbli misjuba fil-kampjuni. Filwaqt li dan huwa ta' benefiċċju biex jippermetti skoperta sensittiva, jintroduċi wkoll il-possibbiltà ta' kontaminazzjoni permezz tat-tixrid ta' aerosols ta' amplifikazzjoni fl-ambjent tal-laboratorju. Meta jsiru esperimenti, jistgħu jittieħdu miżuri biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni tar-reaġenti, it-tagħmir tal-laboratorju u l-ispazju tal-bank tat-testijiet, peress li tali kontaminazzjoni tista' tiġġenera riżultati foloz-pożittivi (jew foloz-negattivi).
Biex tgħin tnaqqas il-probabbiltà ta' kontaminazzjoni, għandha tiġi eżerċitata Prattika Tajba tal-Laboratorju f'kull ħin. Speċifikament, għandhom jittieħdu prekawzjonijiet rigward il-punti li ġejjin:
1. L-immaniġġjar tar-reaġenti
2. Organizzazzjoni tal-ispazju tax-xogħol u t-tagħmir
3. Pariri dwar l-użu u t-tindif għall-ispazju molekulari magħżul
4. Pariri ġenerali dwar il-bijoloġija molekulari
5. Kontrolli interni
6. Biblijografija
1. L-immaniġġjar tar-reaġenti
Iċċentrifuga fil-qosor it-tubi tar-reaġent qabel ma tiftaħhom biex tevita l-ġenerazzjoni ta' aerosols. Alikwota r-reaġenti biex tevita ffriżar u tidwib multipli u l-kontaminazzjoni tal-istokks ewlenin. Ittikketta u iddata b'mod ċar ir-reaġenti u t-tubi tar-reazzjoni kollha u żomm reġistri tan-numri tal-lott u l-lott tar-reaġenti użati fl-esperimenti kollha. Ippipetta r-reaġenti u l-kampjuni kollha billi tuża ponot tal-filtru. Qabel ix-xiri, huwa rakkomandabbli li tikkonferma mal-manifattur li l-ponot tal-filtru jaqblu mal-marka tal-pipetta li se tintuża.
2. Organizzazzjoni tal-ispazju tax-xogħol u t-tagħmir
L-ispazju tax-xogħol għandu jkun organizzat biex jiżgura li l-fluss tax-xogħol iseħħ f'direzzjoni waħda, minn żoni nodfa (qabel il-PCR) għal żoni maħmuġin (wara l-PCR). Il-prekawzjonijiet ġenerali li ġejjin se jgħinu biex jitnaqqas iċ-ċans ta' kontaminazzjoni. Ikollu kmamar separati ddedikati, jew għall-inqas żoni fiżikament separati, għal: preparazzjoni tal-mastermix, estrazzjoni tal-aċidu nuklejku u żieda ta' mudell tad-DNA, amplifikazzjoni u mmaniġġjar tal-prodott amplifikat, u analiżi tal-prodott, eż. elettroforesi tal-ġel.
F'xi ambjenti, li jkollok 4 kmamar separati huwa diffiċli. Għażla possibbli iżda inqas mixtieqa hija li l-preparazzjoni tal-mastermix issir f'żona ta' konteniment, eż. kabinett tal-fluss laminari. Fil-każ ta' amplifikazzjoni tal-PCR nested, il-preparazzjoni tal-mastermix għat-tieni reazzjoni għandha titħejja fiż-żona 'nadifa' għall-preparazzjoni tal-mastermix, iżda l-inokulazzjoni bil-prodott primarju tal-PCR għandha ssir fil-kamra tal-amplifikazzjoni, u jekk possibbli f'żona ta' konteniment iddedikata (eż. kabinett tal-fluss laminari).
Kull kamra/żona teħtieġ sett separat ta’ pipetti, ponot tal-filtri, xtillieri tat-tubi, vortiċi, ċentrifugi (jekk rilevanti), pinen, reaġenti ġeneriċi tal-laboratorju, kowtijiet tal-laboratorju u kaxxi tal-ingwanti mmarkati b’mod ċar li jibqgħu fl-istazzjonijiet tax-xogħol rispettivi tagħhom. L-idejn iridu jinħaslu u l-ingwanti u l-kowtijiet tal-laboratorju jinbidlu meta wieħed jiċċaqlaq bejn iż-żoni magħżula. Ir-reaġenti u t-tagħmir m’għandhomx jiġu mċaqalqa minn żona maħmuġa għal żona nadifa. Jekk jinqala’ każ estrem fejn reaġent jew biċċa tagħmir jeħtieġ li jiġi mċaqlaq lura, l-ewwel irid jiġi dekontaminat b’10% sodium hypochlorite, segwit minn imsaħ b’ilma sterili.
Nota
Is-soluzzjoni ta' 10% sodium hypochlorite trid tiġi ppreparata friska kuljum. Meta tintuża għad-dekontaminazzjoni, għandu jiġi osservat ħin minimu ta' kuntatt ta' 10 minuti.
Alternattivament, jistgħu jintużaw prodotti disponibbli kummerċjalment li huma vvalidati bħala dekontaminanti tal-uċuħ li jeqirdu d-DNA jekk ir-rakkomandazzjonijiet lokali tas-sikurezza ma jippermettux l-użu ta' ipoklorit tas-sodju jew jekk l-ipoklorit tas-sodju mhux adattat għad-dekontaminazzjoni tal-partijiet metalliċi tat-tagħmir.
Idealment, il-persunal għandu jimxi mal-etos tal-fluss tax-xogħol unidirezzjonali u ma jmurx minn żoni maħmuġin (wara l-PCR) lura għal żoni nodfa (qabel il-PCR) fl-istess jum. Madankollu, jista' jkun hemm okkażjonijiet meta dan ikun inevitabbli. Meta tinqala' okkażjoni bħal din, il-persunal għandu joqgħod attent li jaħsel idejh sew, jibdel l-ingwanti, juża l-kowt tal-laboratorju indikat u ma jintroduċi l-ebda tagħmir li jkun irid joħroġ mill-kamra mill-ġdid, bħal kotba tal-laboratorju. Tali miżuri ta' kontroll għandhom jiġu enfasizzati fit-taħriġ tal-persunal dwar metodi molekulari.
Wara l-użu, l-ispazji tal-bank tat-test għandhom jitnaddfu b'10% sodium hypochlorite (segwit minn ilma sterili biex jitneħħa l-bliċ residwu), 70% etanol, jew dekontaminant li jeqred id-DNA u li huwa disponibbli kummerċjalment u li huwa vvalidat. Idealment, għandhom jitwaħħlu lampi ultravjola (UV) biex jippermettu d-dekontaminazzjoni permezz ta' irradjazzjoni. Madankollu, l-użu ta' lampi UV għandu jkun ristrett għal żoni tax-xogħol magħluqa, eż. kabinetti tas-sigurtà, sabiex tiġi limitata l-espożizzjoni tal-persunal tal-laboratorju għar-raġġi UV. Jekk jogħġbok segwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-kura, il-ventilazzjoni u t-tindif tal-lampi UV sabiex tiżgura li l-lampi jibqgħu effettivi.
Jekk qed tuża 70% etanol minflok ipoklorit tas-sodju, ikun hemm bżonn ta' irradjazzjoni bid-dawl UV biex titlesta d-dekontaminazzjoni.
Tnaddafx il-vortiċi u ċ-ċentrifuga b'sodium hypochlorite; minflok, imsaħ b'70% etanol u esponi għad-dawl UV, jew uża dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA. Għal tixrid, iċċekkja mal-manifattur għal aktar pariri dwar it-tindif. Jekk l-istruzzjonijiet tal-manifattur jippermettu dan, il-pipetti għandhom jiġu sterilizzati b'mod regolari b'awtoklav. Jekk il-pipetti ma jistgħux jiġu awtoklavati, għandu jkun biżżejjed li tnaddafhom b'10% sodium hypochlorite (segwit minn tindif bir-reqqa b'ilma sterili) jew b'dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA segwit minn espożizzjoni għar-raġġi UV.
It-tindif b'sodium hypochlorite b'perċentwal għoli jista' eventwalment jagħmel ħsara lill-plastik u l-metalli tal-pipetti jekk isir fuq bażi regolari; iċċekkja r-rakkomandazzjonijiet mill-manifattur l-ewwel. It-tagħmir kollu jeħtieġ li jiġi kalibrat regolarment skont l-iskeda rakkomandata mill-manifattur. Persuna nominata għandha tkun inkarigata li tiżgura li l-iskeda tal-kalibrazzjoni tiġi osservata, li jinżammu reġistri dettaljati, u li t-tikketti tas-servizz jintwerew b'mod ċar fuq it-tagħmir.
3. Pariri dwar l-użu u t-tindif għall-ispazju molekulari magħżul
Pre-PCR: Alikwotazzjoni tar-reaġent / tħejjija tal-mastermix: Dan għandu jkun l-aktar spazju nadif mill-ispazji kollha użati għat-tħejjija ta' esperimenti molekulari u idealment għandu jkun kabinett tal-fluss laminari ddedikat mgħammar b'dawl UV. Kampjuni, aċidu nuklejku estratt u prodotti tal-PCR amplifikati m'għandhomx jiġu mmaniġġjati f'din iż-żona. Ir-reaġenti tal-amplifikazzjoni għandhom jinżammu fi friżer (jew refriġeratur, skont ir-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur) fl-istess spazju ddedikat, idealment ħdejn il-kabinett tal-fluss laminari jew iż-żona pre-PCR. L-ingwanti għandhom jinbidlu kull darba li tidħol fiż-żona pre-PCR jew fil-kabinett tal-fluss laminari.
Iż-żona ta' qabel il-PCR jew il-kabinett tal-fluss laminari għandhom jitnaddfu qabel u wara l-użu kif ġej: Imsaħ l-oġġetti kollha fil-kabinett, eż. pipetti, kaxxi tat-tip, vortiċi, ċentrifuga, xtillieri tat-tubi, pinen, eċċ. b'70% etanol jew dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA, u ħallihom jinxfu. Fil-każ ta' żona tax-xogħol magħluqa, eż. kabinett tal-fluss laminari, esponi l-kappa għad-dawl UV għal 30 minuta.
Nota
Tesponix ir-reaġenti għad-dawl UV; mexxihom fil-kabinett biss ladarba jkun nadif. Jekk qed twettaq PCR ta' traskrizzjoni inversa, jista' jkun ta' għajnuna wkoll li timsaħ l-uċuħ u t-tagħmir b'soluzzjoni li tkisser l-RNases mal-kuntatt. Dan jista' jgħin biex jiġu evitati riżultati foloz-negattivi mid-degradazzjoni tal-enzimi tal-RNA. Wara d-dekontaminazzjoni u qabel ma tipprepara l-mastermix, l-ingwanti għandhom jinbidlu darba oħra, u mbagħad il-kabinett ikun lest għall-użu.
Pre-PCR: Estrazzjoni tal-aċidu nuklejku/żieda ta' mudell:
L-aċidu nuklejku għandu jiġi estratt u mmaniġġjat f'żona oħra magħżula, bl-użu ta' sett separat ta' pipetti, ponot tal-filtri, xtillieri tat-tubi, ingwanti ġodda, kowtijiet tal-laboratorju u tagħmir ieħor. Din iż-żona hija wkoll għaż-żieda ta' template, kontrolli u trendlines mat-tubi jew il-pjanċi tal-mastermix. Biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni tal-kampjuni tal-aċidu nuklejku estratti li qed jiġu analizzati, huwa rakkomandat li l-ingwanti jinbidlu qabel ma jiġu mmaniġġjati kontrolli jew standards pożittivi u li jintuża sett separat ta' pipetti. Ir-reaġenti tal-PCR u l-prodotti amplifikati m'għandhomx jiġu pipettati f'din iż-żona. Il-kampjuni għandhom jinħażnu fi friġġijiet jew friżers magħżula fl-istess żona. L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.
Wara l-PCR: Amplifikazzjoni u mmaniġġjar tal-prodott amplifikat
Dan l-ispazju magħżul huwa għal proċessi ta' wara l-amplifikazzjoni u għandu jkun fiżikament separat miż-żoni ta' qabel il-PCR. Normalment ikun fih termoċiklaturi u pjattaformi f'ħin reali, u idealment għandu jkollu kabinett tal-fluss laminari biex jiżdied il-prodott tal-PCR tal-ewwel rawnd mar-reazzjoni tat-tieni rawnd, jekk ikun qed isir nested PCR. Ir-reaġenti tal-PCR u l-aċidu nuklejku estratt m'għandhomx jiġu mmaniġġjati f'din iż-żona peress li r-riskju ta' kontaminazzjoni huwa għoli. Din iż-żona għandu jkollha sett separat ta' ingwanti, kowtijiet tal-laboratorju, xtillieri tal-pjanċi u tat-tubi, pipetti, ponot tal-filtri, kontenituri u tagħmir ieħor. It-tubi għandhom jiġu ċċentrifugati qabel ma jinfetħu. L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.
Wara l-PCR: Analiżi tal-prodott
Din il-kamra hija għat-tagħmir tad-detezzjoni tal-prodott, eż. tankijiet tal-elettroforesi bil-ġel, power packs, transilluminatur UV u s-sistema ta' dokumentazzjoni tal-ġel. Din iż-żona għandu jkollha settijiet separati ta' ingwanti, kowtijiet tal-laboratorju, xtillieri tal-pjanċi u tat-tubi, pipetti, ponot tal-filtri, kontenituri u tagħmir ieħor. L-ebda reaġenti oħra ma jistgħu jiddaħħlu f'din iż-żona, minbarra ż-żebgħa tat-tagħbija, il-markatur molekulari u l-ġel tal-agarose, u l-komponenti tal-buffer. L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.
Nota importanti
Idealment, il-kmamar ta’ qabel il-PCR m’għandhomx jidħlu fl-istess jum jekk ikun diġà sar xogħol fil-kmamar ta’ wara l-PCR. Jekk dan huwa kompletament inevitabbli, kun żgur li l-idejn jinħaslu sew l-ewwel u li jintlibsu kowtijiet tal-laboratorju speċifiċi fil-kmamar. Kotba u dokumenti tal-laboratorju m’għandhomx jittieħdu fil-kmamar ta’ qabel il-PCR jekk ikunu ntużaw fil-kmamar ta’ wara l-PCR; jekk meħtieġ, ħu kopji stampati duplikati tal-protokolli/IDs tal-kampjuni, eċċ.
4. Pariri ġenerali dwar il-bijoloġija molekulari
Uża ingwanti mingħajr trab biex tevita l-inibizzjoni tal-assaġġ. It-teknika korretta tal-pipettar hija kruċjali biex titnaqqas il-kontaminazzjoni. Pipettar mhux korrett jista' jirriżulta fi titjir meta jiġu dispensati l-likwidi u l-ħolqien ta' aerosols. Prattika tajba għal pipettar korrett tista' tinstab fil-links li ġejjin: Gwida Gilson għall-pipettar, Vidjows tat-teknika tal-pipettar Anachem, Tubi taċ-ċentrifuga qabel tiftaħhom, u iftaħhom bir-reqqa biex tevita t-titjir. Agħlaq it-tubi immedjatament wara l-użu biex tevita l-introduzzjoni ta' kontaminanti.
Meta twettaq reazzjonijiet multipli, ipprepara mastermix waħda li fiha reaġenti komuni (eż. ilma, dNTPs, buffer, primers u enzima) biex timminimizza n-numru ta' trasferimenti ta' reaġenti u tnaqqas it-theddida ta' kontaminazzjoni. Huwa rakkomandat li l-mastermix titwaqqaf fuq is-silġ jew blokka kiesħa. L-użu ta' enzima Hot Start jista' jgħin biex titnaqqas il-produzzjoni ta' prodotti mhux speċifiċi. Ipproteġi r-reaġenti li fihom sondi fluworexxenti mid-dawl sabiex tevita d-degradazzjoni.
5. Kontrolli interni
Inkludi kontrolli pożittivi u negattivi kkonfermati u kkaratterizzati sew, flimkien ma' kontroll mingħajr mudell fir-reazzjonijiet kollha, u linja ta' xejra titrata b'ħafna punti għal reazzjonijiet kwantitattivi. Il-kontroll pożittiv m'għandux ikun daqshekk qawwi li joħloq riskju ta' kontaminazzjoni. Inkludi kontrolli ta' estrazzjoni pożittivi u negattivi meta twettaq estrazzjoni ta' aċidu nuklejku.
Huwa rakkomandat li jitwaħħlu struzzjonijiet ċari f'kull waħda miż-żoni sabiex l-utenti jkunu konxji tar-regoli ta' kondotta. Laboratorji dijanjostiċi li jidentifikaw livelli baxxi ħafna ta' DNA jew RNA f'kampjuni kliniċi jistgħu jkunu jridu jadottaw il-miżura ta' sigurtà addizzjonali li jkollhom sistemi separati ta' mmaniġġjar tal-arja bi pressjoni tal-arja kemxejn pożittiva fil-kmamar ta' qabel il-PCR u pressjoni tal-arja kemxejn negattiva fil-kmamar ta' wara l-PCR.
Fl-aħħar nett, l-iżvilupp ta' pjan ta' assigurazzjoni tal-kwalità (QA) huwa ta' għajnuna. Pjan bħal dan għandu jinkludi listi ta' stokkijiet ewlenin ta' reaġenti u stokkijiet tax-xogħol, regoli għall-ħażna ta' kits u reaġenti, rappurtar tar-riżultati tal-kontroll, programmi ta' taħriġ tal-persunal, algoritmi għas-soluzzjoni tal-problemi, u azzjonijiet ta' rimedju meta jkun hemm bżonn.
6. Biblijografija
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitlu 3: Twaqqif ta' laboratorju qPCR. Dokument ta' gwida għall-ittestjar ta' ilmijiet rikreattivi bl-użu tal-metodu USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.
Saħħa Pubblika tal-Ingilterra, NHS. Standards tar-Renju Unit għal investigazzjonijiet mikrobijoloġiċi: Prattika Tajba tal-Laboratorju meta jitwettqu assays ta' amplifikazzjoni molekulari). Gwida għall-Kwalità. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Twaqqif ta' laboratorju tal-PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Manutenzjoni ta' rutina taċ-ċentrifugi: tindif, manutenzjoni u diżinfezzjoni taċ-ċentrifugi, rotors u adapters (White paper Nru. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Prattika Tajba tal-Laboratorju Kliniku (GCLP) għal testijiet ibbażati fuq il-molekuli użati f'laboratorji dijanjostiċi, Fi: Akyar I, editur. Spettri wiesgħa ta' kontroll tal-kwalità. Rijeka, Kroazja: Intech; 2011: 29–52.
Ħin tal-posta: 16 ta' Lulju 2020
