Els mètodes de detecció molecular tenen la capacitat de produir un gran volum d'àcid nucleic mitjançant l'amplificació de quantitats traça que es troben a les mostres. Si bé això és beneficiós per permetre una detecció sensible, també introdueix la possibilitat de contaminació a través de la propagació d'aerosols d'amplificació a l'entorn del laboratori. Quan es realitzen experiments, es poden prendre mesures per evitar la contaminació dels reactius, l'equip de laboratori i l'espai del banc de proves, ja que aquesta contaminació pot generar resultats falsos positius (o falsos negatius).
Per ajudar a reduir la probabilitat de contaminació, s'han d'aplicar les Bones Pràctiques de Laboratori en tot moment. En concret, s'han de prendre precaucions pel que fa als punts següents:
1. Manipulació de reactius
2. Organització de l'espai de treball i l'equipament
3. Consells d'ús i neteja per a l'espai molecular designat
4. Consells generals de biologia molecular
5. Controls interns
6. Bibliografia
1. Manipulació de reactius
Centrifugueu breument els tubs de reactius abans d'obrir-los per evitar la generació d'aerosols. Alíquoteu els reactius per evitar múltiples congelacions i descongelacions i la contaminació dels estocs mestres. Etiqueteu i dateu clarament tots els tubs de reactius i de reacció i manteniu registres dels números de lot i lot de reactius utilitzats en tots els experiments. Pipetegeu tots els reactius i les mostres amb filtres. Abans de la compra, és recomanable confirmar amb el fabricant que els filtres s'adapten a la marca de la pipeta que s'utilitzarà.
2. Organització de l'espai de treball i l'equipament
L'espai de treball s'ha d'organitzar per garantir que el flux de treball es produeixi en una sola direcció, des de les zones netes (pre-PCR) fins a les zones brutes (post-PCR). Les següents precaucions generals ajudaran a reduir la possibilitat de contaminació. Disposeu d'habitacions designades separades, o com a mínim zones físicament separades, per a: preparació de la mescla principal, extracció d'àcids nucleics i addició de motlles d'ADN, amplificació i manipulació del producte amplificat, i anàlisi del producte, p. ex. electroforesi en gel.
En alguns entorns, tenir 4 sales separades és difícil. Una opció possible però menys desitjable és fer la preparació de la mescla màster en una zona de contenció, per exemple, una cabina de flux laminar. En el cas de l'amplificació per PCR imbricada, la preparació de la mescla màster per a la segona reacció s'ha de preparar a la zona "neta" per a la preparació de la mescla màster, però la inoculació amb el producte de PCR primari s'ha de fer a la sala d'amplificació i, si és possible, en una zona de contenció dedicada (per exemple, una cabina de flux laminar).
Cada habitació/zona necessita un conjunt separat de pipetes, filtres, graelles per a tubs, vòrtex, centrífugues (si escau), bolígrafs, reactius de laboratori genèrics, bates de laboratori i caixes de guants clarament etiquetats, que romandran als seus respectius llocs de treball. Cal rentar-se les mans i canviar-se els guants i les bates de laboratori quan es mogui entre les zones designades. Els reactius i l'equip no s'han de moure d'una zona bruta a una zona neta. En cas que es produeixi un cas extrem en què un reactiu o una peça d'equip s'hagi de moure cap enrere, primer s'ha de descontaminar amb hipoclorit de sodi al 10% i, a continuació, netejar-los amb aigua estèril.
Nota
La solució d'hipoclorit de sodi al 10% s'ha de preparar fresca diàriament. Quan s'utilitza per a la descontaminació, s'ha de respectar un temps de contacte mínim de 10 minuts.
Alternativament, es poden utilitzar productes disponibles comercialment que estiguin validats com a descontaminants de superfícies que destrueixen l'ADN si les recomanacions de seguretat locals no permeten l'ús d'hipoclorit de sodi o si l'hipoclorit de sodi no és adequat per descontaminar les parts metàl·liques dels equips.
Idealment, el personal hauria de seguir l'essència del flux de treball unidireccional i no tornar de les zones brutes (després de la PCR) a les zones netes (abans de la PCR) el mateix dia. Tanmateix, hi pot haver ocasions en què això sigui inevitable. Quan sorgeixi aquesta ocasió, el personal ha de tenir cura de rentar-se bé les mans, canviar-se els guants, utilitzar la bata de laboratori assignada i no introduir cap equip que vulgui tornar a treure de l'habitació, com ara llibres de laboratori. Aquestes mesures de control s'haurien de posar de manifest en la formació del personal sobre mètodes moleculars.
Després de l'ús, els espais de la taula de treball s'han de netejar amb hipoclorit de sodi al 10% (seguit d'aigua estèril per eliminar el lleixiu residual), etanol al 70% o un descontaminant validat que destrueixi l'ADN i disponible comercialment. Idealment, s'haurien d'instal·lar làmpades ultraviolades (UV) per permetre la descontaminació per irradiació. Tanmateix, l'ús de làmpades UV s'ha de restringir a zones de treball tancades, com ara armaris de seguretat, per tal de limitar l'exposició del personal del laboratori als UV. Si us plau, seguiu les instruccions del fabricant per a la cura, la ventilació i la neteja de les làmpades UV per tal de garantir que les làmpades continuïn sent efectives.
Si s'utilitza etanol al 70% en comptes d'hipoclorit de sodi, caldrà irradiar-lo amb llum UV per completar la descontaminació.
No netegeu el vòrtex ni la centrifugadora amb hipoclorit de sodi; en comptes d'això, netegeu-los amb etanol al 70% i exposeu-los a la llum ultraviolada o utilitzeu un descontaminant comercial que destrueixi l'ADN. En cas de vessaments, consulteu amb el fabricant per obtenir més consells de neteja. Si les instruccions del fabricant ho permeten, les pipetes s'han d'esterilitzar rutinàriament amb autoclau. Si les pipetes no es poden esterilitzar a l'autoclau, n'hi hauria d'haver prou amb netejar-les amb hipoclorit de sodi al 10% (seguit d'una neteja a fons amb aigua estèril) o amb un descontaminant comercial que destrueixi l'ADN seguit d'exposició UV.
La neteja amb hipoclorit de sodi en un alt percentatge pot danyar els plàstics i els metalls de les pipetes si es fa regularment; consulteu primer les recomanacions del fabricant. Cal calibrar tots els equips regularment segons el programa recomanat pel fabricant. Una persona designada s'ha d'encarregar de garantir que es compleixi el programa de calibratge, que es mantinguin registres detallats i que les etiquetes de servei es mostrin clarament a l'equip.
3. Consells d'ús i neteja per a l'espai molecular designat
Pre-PCR: Aliquota de reactius / preparació de la mescla màster: Aquest hauria de ser l'espai més net de tots els utilitzats per a la preparació d'experiments moleculars i idealment hauria de ser una cabina de flux laminar designada equipada amb llum UV. Les mostres, l'àcid nucleic extret i els productes de PCR amplificats no s'han de manipular en aquesta zona. Els reactius d'amplificació s'han de guardar en un congelador (o nevera, segons les recomanacions del fabricant) al mateix espai designat, idealment al costat de la cabina de flux laminar o de la zona de pre-PCR. Els guants s'han de canviar cada vegada que s'entra a la zona de pre-PCR o a la cabina de flux laminar.
La zona de pre-PCR o la cabina de flux laminar s'ha de netejar abans i després de l'ús de la manera següent: Netegeu tots els elements de la cabina, p. ex. pipetes, caixes de puntes, vòrtex, centrífuga, graelles de tubs, bolígrafs, etc. amb etanol al 70% o un descontaminant comercial que destrueixi l'ADN, i deixeu-los assecar. En el cas d'una zona de treball tancada, p. ex. una cabina de flux laminar, exposeu la campana a la llum UV durant 30 minuts.
Nota
No exposeu els reactius a la llum UV; només traslladeu-los a l'armari un cop estigui net. Si realitzeu una PCR amb transcripció inversa, també pot ser útil netejar les superfícies i l'equip amb una solució que descompongui les RNases en contacte. Això pot ajudar a evitar resultats falsos negatius per degradació enzimàtica de l'ARN. Després de la descontaminació i abans de preparar la barreja mestre, cal canviar els guants una vegada més i l'armari estarà llest per al seu ús.
Pre-PCR: Extracció d'àcids nucleics/addició de plantilla:
L'àcid nucleic s'ha d'extreure i manipular en una segona zona designada, utilitzant un conjunt separat de pipetes, filtres, graelles per a tubs, guants nous, bates de laboratori i altres equips. Aquesta zona també serveix per afegir plantilla, controls i línies de tendència als tubs o plaques de mescla magistral. Per evitar la contaminació de les mostres d'àcid nucleic extretes que s'analitzen, es recomana canviar els guants abans de manipular controls o estàndards positius i utilitzar un conjunt separat de pipetes. Els reactius de PCR i els productes amplificats no s'han de pipetejar en aquesta zona. Les mostres s'han de guardar en neveres o congeladors designats a la mateixa zona. L'espai de treball de la mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai de la mescla magistral.
Post-PCR: Amplificació i manipulació del producte amplificat
Aquest espai designat és per a processos de postamplificació i ha d'estar físicament separat de les zones de pre-PCR. Normalment conté termocicladors i plataformes en temps real, i idealment hauria de tenir una cabina de flux laminar per afegir el producte de PCR de la ronda 1 a la reacció de la ronda 2, si es realitza una PCR imbricada. Els reactius de PCR i l'àcid nucleic extret no s'han de manipular en aquesta zona, ja que el risc de contaminació és alt. Aquesta zona ha de tenir un joc separat de guants, bates de laboratori, graelles per a plaques i tubs, pipetes, filtres, contenidors i altres equips. Els tubs s'han de centrifugar abans d'obrir-los. L'espai de treball de la mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai de la mescla magistral.
Post-PCR: Anàlisi del producte
Aquesta sala és per a equips de detecció de productes, com ara tancs d'electroforesi en gel, bateries energètiques, transil·luminador UV i el sistema de documentació del gel. Aquesta zona ha de tenir conjunts separats de guants, bates de laboratori, graelles de plaques i tubs, pipetes, filtres, contenidors i altres equips. No es poden introduir altres reactius en aquesta zona, excepte el colorant de càrrega, el marcador molecular i el gel d'agarosa, i els components del tampó. L'espai de treball de la mostra s'ha de netejar de la mateixa manera que l'espai de la mescla magistral.
Nota important
Idealment, no s'hauria d'entrar a les sales de pre-PCR el mateix dia si ja s'ha treballat a les sales de post-PCR. Si això és completament inevitable, assegureu-vos de rentar-vos bé les mans primer i de portar bates de laboratori específiques a les sales. No s'han d'introduir llibres de laboratori ni documents a les sales de pre-PCR si s'han utilitzat a les sales de post-PCR; si cal, feu impressions duplicades de protocols/identificadors de mostres, etc.
4. Consells generals de biologia molecular
Feu servir guants sense pols per evitar la inhibició de l'assaig. La tècnica correcta de pipeteig és fonamental per reduir la contaminació. Un pipeteig incorrecte pot provocar esquitxades en dispensar líquids i la creació d'aerosols. Podeu trobar bones pràctiques per a un pipeteig correcte als enllaços següents: Guia de pipeteig de Gilson, vídeos de la tècnica de pipeteig d'Anachem, tubs de centrifugació abans d'obrir-los i obriu-los amb cura per evitar esquitxades. Tanqueu els tubs immediatament després d'usar-los per evitar la introducció de contaminants.
Quan realitzeu múltiples reaccions, prepareu una barreja mestre que contingui reactius comuns (per exemple, aigua, dNTP, tampó, encebadors i enzim) per minimitzar el nombre de transferències de reactius i reduir l'amenaça de contaminació. Es recomana preparar la barreja mestre sobre gel o un bloc fred. L'ús d'un enzim Hot Start pot ajudar a reduir la producció de productes no específics. Protegiu els reactius que continguin sondes fluorescents de la llum per evitar la degradació.
5. Controls interns
Incloeu controls positius i negatius ben caracteritzats i confirmats, juntament amb un control sense plantilla en totes les reaccions i una línia de tendència titulada en diversos punts per a les reaccions quantitatives. El control positiu no ha de ser tan fort que suposi un risc de contaminació. Incloeu controls d'extracció positius i negatius quan realitzeu l'extracció d'àcids nucleics.
Es recomana publicar instruccions clares a cadascuna de les zones perquè els usuaris coneguin les normes de conducta. Els laboratoris de diagnòstic que detecten nivells molt baixos d'ADN o ARN en mostres clíniques poden adoptar la mesura de seguretat addicional de tenir sistemes de tractament d'aire separats amb una pressió d'aire lleugerament positiva a les sales prèvies a la PCR i una pressió d'aire lleugerament negativa a les sales posteriors a la PCR.
Finalment, és útil desenvolupar un pla de garantia de qualitat (QA). Aquest pla hauria d'incloure llistes de les reserves mestres de reactius i les reserves de treball, normes per emmagatzemar kits i reactius, informes dels resultats de control, programes de formació del personal, algoritmes de resolució de problemes i accions correctives quan sigui necessari.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capítol 3: Configuració d'un laboratori de qPCR. Un document d'orientació per a les anàlisis d'aigües recreatives mitjançant el mètode 1611 de qPCR de la USEPA. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Estàndards del Regne Unit per a investigacions microbiològiques: bones pràctiques de laboratori en realitzar assaigs d'amplificació molecular). Guia de qualitat. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Configuració d'un laboratori de PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Manteniment rutinari de centrífugues: neteja, manteniment i desinfecció de centrífugues, rotors i adaptadors (Llibre blanc núm. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bones pràctiques de laboratori clínic (GCLP) per a proves moleculars utilitzades en laboratoris de diagnòstic, A: Akyar I, editor. Amplis espectres de control de qualitat. Rijeka, Croàcia: Intech; 2011: 29–52.
Data de publicació: 16 de juliol de 2020
