Metodele de detectare moleculară au capacitatea de a produce un volum mare de acid nucleic prin amplificarea urmelor de probe. Deși acest lucru este benefic pentru permiterea unei detectări sensibile, introduce și posibilitatea contaminării prin răspândirea aerosolilor de amplificare în mediul de laborator. Atunci când se efectuează experimente, se pot lua măsuri pentru a evita contaminarea reactivilor, a echipamentelor de laborator și a spațiului de laborator, deoarece o astfel de contaminare poate genera rezultate fals pozitive (sau fals negative).
Pentru a reduce probabilitatea de contaminare, trebuie aplicate în permanență Bunele Practici de Laborator. Mai exact, trebuie luate măsuri de precauție cu privire la următoarele aspecte:
1. Manipularea reactivilor
2. Organizarea spațiului de lucru și a echipamentelor
3. Sfaturi de utilizare și curățare pentru spațiul molecular desemnat
4. Sfaturi generale de biologie moleculară
5. Controale interne
6. Bibliografie
1. Manipularea reactivilor
Centrifugați scurt tuburile cu reactivi înainte de deschidere pentru a evita generarea de aerosoli. Colectați reactivii pentru a evita congelarea-decongelarea multiplă și contaminarea stocurilor master. Etichetați și datați clar toate tuburile cu reactivi și reacții și păstrați jurnalele cu numerele de lot și lot de reactivi utilizați în toate experimentele. Pipetați toți reactivii și probele folosind vârfuri cu filtru. Înainte de cumpărare, este recomandabil să confirmați cu producătorul dacă vârfurile cu filtru se potrivesc cu marca pipetei care va fi utilizată.
2. Organizarea spațiului de lucru și a echipamentelor
Spațiul de lucru trebuie organizat astfel încât să se asigure că fluxul de lucru se desfășoară într-o singură direcție, de la zonele curate (pre-PCR) la zonele murdare (post-PCR). Următoarele precauții generale vor ajuta la reducerea riscului de contaminare. Aveți camere separate, desemnate, sau cel puțin zone separate fizic, pentru: prepararea mastermix-ului, extracția acidului nucleic și adăugarea șablonului ADN, amplificarea și manipularea produsului amplificat și analiza produsului, de exemplu electroforeza pe gel.
În unele situații, este dificil să existe 4 camere separate. O opțiune posibilă, dar mai puțin dezirabilă, este prepararea mastermixului într-o zonă de izolare, de exemplu, o hotă cu flux laminar. În cazul amplificării PCR imbricate, prepararea mastermixului pentru a doua rundă de reacție trebuie făcută în zona „curată” pentru prepararea mastermixului, dar inocularea cu produsul PCR primar trebuie făcută în camera de amplificare și, dacă este posibil, într-o zonă de izolare dedicată (de exemplu, o hotă cu flux laminar).
Fiecare cameră/zonă necesită un set separat de pipete, vârfuri cu filtru, suporturi pentru tuburi, vortexuri, centrifuge (dacă este cazul), pixuri, reactivi de laborator generici, halate de laborator și cutii cu mănuși, etichetate clar, care vor rămâne la stațiile de lucru respective. Mâinile trebuie spălate, iar mănușile și halatele de laborator trebuie schimbate la deplasarea între zonele desemnate. Reactivii și echipamentul nu trebuie mutate dintr-o zonă murdară într-o zonă curată. În cazul în care apare un caz extrem în care un reactiv sau un echipament trebuie mutat înapoi, acesta trebuie mai întâi decontaminat cu hipoclorit de sodiu 10%, urmat de o ștergere cu apă sterilă.
Nota
Soluția de hipoclorit de sodiu 10% trebuie preparată zilnic. Când este utilizată pentru decontaminare, trebuie respectat un timp de contact minim de 10 minute.
Alternativ, se pot utiliza produse disponibile comercial, validate ca decontaminanți de suprafață care distrug ADN-ul, dacă recomandările locale de siguranță nu permit utilizarea hipocloritului de sodiu sau dacă hipocloritul de sodiu nu este adecvat pentru decontaminarea părților metalice ale echipamentelor.
În mod ideal, personalul ar trebui să respecte principiul fluxului de lucru unidirecțional și să nu se deplaseze din zonele murdare (post-PCR) înapoi în zonele curate (pre-PCR) în aceeași zi. Cu toate acestea, pot exista situații în care acest lucru este inevitabil. În astfel de situații, personalul trebuie să aibă grijă să se spele temeinic pe mâini, să își schimbe mănușile, să folosească halatul de laborator corespunzător și să nu introducă din nou echipamente pe care ar dori să le scoată din încăpere, cum ar fi cărțile de laborator. Astfel de măsuri de control ar trebui subliniate în instruirea personalului privind metodele moleculare.
După utilizare, spațiile de laborator trebuie curățate cu hipoclorit de sodiu 10% (urmat de apă sterilă pentru a îndepărta înălbitorul rezidual), etanol 70% sau un decontaminant validat, disponibil comercial, care distruge ADN-ul. În mod ideal, ar trebui montate lămpi ultraviolete (UV) pentru a permite decontaminarea prin iradiere. Cu toate acestea, utilizarea lămpilor UV trebuie limitată la zone de lucru închise, de exemplu, dulapuri de siguranță, pentru a limita expunerea personalului de laborator la UV. Vă rugăm să respectați instrucțiunile producătorului privind îngrijirea, ventilația și curățarea lămpilor UV pentru a vă asigura că lămpile rămân eficiente.
Dacă se utilizează etanol 70% în loc de hipoclorit de sodiu, va fi necesară iradierea cu lumină UV pentru a finaliza decontaminarea.
Nu curățați vortexul și centrifuga cu hipoclorit de sodiu; în schimb, ștergeți cu etanol 70% și expuneți la lumină UV sau utilizați un decontaminant comercial care distruge ADN-ul. În cazul scurgerilor, consultați producătorul pentru sfaturi suplimentare de curățare. Dacă instrucțiunile producătorului permit acest lucru, pipetele trebuie sterilizate în mod curent în autoclavă. Dacă pipetele nu pot fi autoclavizate, ar trebui să fie suficientă curățarea lor cu hipoclorit de sodiu 10% (urmată de o ștergere temeinică cu apă sterilă) sau cu un decontaminant comercial care distruge ADN-ul, urmată de expunere la UV.
Curățarea cu hipoclorit de sodiu cu un procent ridicat poate deteriora în cele din urmă materialele plastice și metalele pipetelor dacă este efectuată în mod regulat; verificați mai întâi recomandările producătorului. Toate echipamentele trebuie calibrate periodic, conform programului recomandat de producător. O persoană desemnată ar trebui să fie responsabilă de asigurarea respectării programului de calibrare, a menținerii unor jurnale detaliate și a afișajelor clare pe echipamente.
3. Sfaturi de utilizare și curățare pentru spațiul molecular desemnat
Pre-PCR: Alicotarea reactivilor / prepararea mastermix-ului: Acesta ar trebui să fie cel mai curat dintre toate spațiile utilizate pentru pregătirea experimentelor moleculare și, în mod ideal, ar trebui să fie o hotă cu flux laminar desemnată, echipată cu lumină UV. Probele, acidul nucleic extras și produsele PCR amplificate nu trebuie manipulate în această zonă. Reactivii de amplificare trebuie păstrați într-un congelator (sau frigider, conform recomandărilor producătorului) în același spațiu desemnat, în mod ideal lângă hota cu flux laminar sau zona pre-PCR. Mănușile trebuie schimbate de fiecare dată la intrarea în zona pre-PCR sau în hota cu flux laminar.
Zona pre-PCR sau hota cu flux laminar trebuie curățată înainte și după utilizare, după cum urmează: Ștergeți toate obiectele din hotă, de exemplu, pipete, cutii pentru vârfuri, vortex, centrifugă, suporturi pentru tuburi, stilouri etc., cu etanol 70% sau un decontaminant comercial care distruge ADN-ul și lăsați să se usuce. În cazul unei zone de lucru închise, de exemplu, o hotă cu flux laminar, expuneți hota la lumină UV timp de 30 de minute.
Nota
Nu expuneți reactivii la lumină UV; mutați-i în hotă doar după ce este curată. Dacă efectuați PCR cu transcripție inversă, poate fi utilă și ștergerea suprafețelor și a echipamentului cu o soluție care descompune RNazele la contact. Acest lucru poate ajuta la evitarea rezultatelor fals negative cauzate de degradarea enzimatică a ARN-ului. După decontaminare și înainte de prepararea mastermix-ului, mănușile trebuie schimbate încă o dată, iar apoi hota este gata de utilizare.
Pre-PCR: Extracția acidului nucleic/adăugarea șablonului:
Acidul nucleic trebuie extras și manipulat într-o a doua zonă desemnată, utilizând un set separat de pipete, vârfuri de filtru, suporturi pentru tuburi, mănuși noi, halate de laborator și alte echipamente. Această zonă este, de asemenea, destinată adăugării de șablon, controale și linii de trend în tuburile sau plăcile mastermix. Pentru a evita contaminarea probelor de acid nucleic extrase care sunt analizate, se recomandă schimbarea mănușilor înainte de manipularea controalelor pozitive sau a standardelor și utilizarea unui set separat de pipete. Reactivii PCR și produsele amplificate nu trebuie pipetate în această zonă. Probele trebuie depozitate în frigidere sau congelatoare desemnate, în aceeași zonă. Spațiul de lucru pentru probe trebuie curățat în același mod ca și spațiul mastermix.
Post-PCR: Amplificarea și manipularea produsului amplificat
Acest spațiu desemnat este destinat proceselor de post-amplificare și ar trebui să fie separat fizic de zonele pre-PCR. De obicei, acesta conține termocicloare și platforme în timp real și, în mod ideal, ar trebui să aibă o hotă cu flux laminar pentru adăugarea produsului PCR din runda 1 la reacția din runda 2, dacă se efectuează PCR imbricat. Reactivii PCR și acidul nucleic extras nu trebuie manipulați în această zonă, deoarece riscul de contaminare este ridicat. Această zonă ar trebui să aibă un set separat de mănuși, halate de laborator, suporturi pentru plăci și tuburi, pipete, vârfuri de filtru, recipiente și alte echipamente. Tuburile trebuie centrifugate înainte de deschidere. Spațiul de lucru pentru probe trebuie curățat în același mod ca și spațiul pentru mastermix.
Post-PCR: Analiza produsului
Această cameră este destinată echipamentelor de detectare a produselor, de exemplu, rezervoare de electroforeză în gel, blocuri de alimentare, transiluminator UV și sistemul de documentare a gelului. Această zonă trebuie să aibă seturi separate de mănuși, halate de laborator, suporturi pentru plăci și tuburi, pipete, vârfuri de filtru, recipiente și alte echipamente. Nu se pot aduce alți reactivi în această zonă, cu excepția colorantului de încărcare, a markerului molecular și a gelului de agaroză, precum și a componentelor tampon. Spațiul de lucru pentru probe trebuie curățat în același mod ca și spațiul pentru mastermix.
Notă importantă
În mod ideal, nu se va intra în sălile pre-PCR în aceeași zi dacă s-au efectuat deja lucrări în sălile post-PCR. Dacă acest lucru este complet inevitabil, asigurați-vă că mâinile sunt spălate bine mai întâi și că se poartă halate de laborator specifice în săli. Cărțile și documentele de laborator nu trebuie introduse în sălile pre-PCR dacă au fost utilizate în sălile post-PCR; dacă este necesar, se vor face copii ale protocoalelor/ID-urilor probelor etc.
4. Sfaturi generale de biologie moleculară
Folosiți mănuși fără pudră pentru a evita inhibarea testului. Tehnica corectă de pipetare este esențială pentru reducerea contaminării. Pipetarea incorectă poate duce la stropire la distribuirea lichidelor și la crearea de aerosoli. Bune practici pentru pipetarea corectă pot fi găsite la următoarele linkuri: Ghidul Gilson pentru pipetare, Videoclipuri despre tehnica de pipetare Anachem, Tuburile de centrifugare înainte de deschidere și deschideți-le cu grijă pentru a evita stropirea. Închideți tuburile imediat după utilizare pentru a evita introducerea de contaminanți.
Când efectuați reacții multiple, preparați un mastermix care conține reactivi comuni (de exemplu, apă, dNTP-uri, tampon, primeri și enzimă) pentru a minimiza numărul de transferuri de reactivi și a reduce riscul de contaminare. Se recomandă prepararea mastermix-ului pe gheață sau pe un bloc rece. Utilizarea unei enzime Hot Start poate ajuta la reducerea producției de produse nespecifice. Protejați reactivii care conțin sonde fluorescente de lumină pentru a evita degradarea.
5. Controale interne
Includeți controale pozitive și negative bine caracterizate și confirmate, împreună cu un control fără șablon în toate reacțiile și o linie de trend titrată în mai multe puncte pentru reacțiile cantitative. Controlul pozitiv nu trebuie să fie atât de puternic încât să prezinte un risc de contaminare. Includeți controale de extracție pozitive și negative atunci când efectuați extracția acidului nucleic.
Se recomandă afișarea unor instrucțiuni clare în fiecare zonă, astfel încât utilizatorii să fie conștienți de regulile de conduită. Laboratoarele de diagnostic care detectează niveluri foarte scăzute de ADN sau ARN în probele clinice pot adopta măsura suplimentară de securitate de a avea sisteme separate de tratare a aerului cu presiune ușor pozitivă în încăperile pre-PCR și presiune ușor negativă în încăperile post-PCR.
În cele din urmă, este utilă dezvoltarea unui plan de asigurare a calității (AC). Un astfel de plan ar trebui să includă liste de stocuri principale de reactivi și stocuri de lucru, reguli pentru depozitarea kiturilor și a reactivilor, raportarea rezultatelor controalelor, programe de instruire a personalului, algoritmi de depanare și acțiuni corective, atunci când este necesar.
6. Bibliografie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capitolul 3: Configurarea unui laborator qPCR. Un document de îndrumare pentru testarea apelor recreaționale folosind metoda USEPA qPCR 1611. Universitatea de Stat Lansing-Michigan.
Public Health England, NHS. Standarde din Regatul Unit pentru investigații microbiologice: Bune practici de laborator la efectuarea testelor de amplificare moleculară. Ghid de calitate. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Înființarea unui laborator PCR. Cold Spring Harb Protocol. 2007;7.
Schroeder S 2013. Întreținerea de rutină a centrifugelor: curățarea, întreținerea și dezinfectarea centrifugelor, rotoarelor și adaptoarelor (Carte albă nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bune practici de laborator clinic (GCLP) pentru testele moleculare utilizate în laboratoarele de diagnostic, În: Akyar I, editor. Spectre largi de control al calității. Rijeka, Croația: Intech; 2011: 29–52.
Data publicării: 16 iulie 2020
