Metode deteksi molekuler memiliki kemampuan untuk menghasilkan asam nukleat dalam jumlah besar melalui amplifikasi sejumlah kecil yang ditemukan dalam sampel. Meskipun hal ini bermanfaat untuk memungkinkan deteksi yang sensitif, metode ini juga menimbulkan kemungkinan kontaminasi melalui penyebaran aerosol amplifikasi di lingkungan laboratorium. Saat melakukan eksperimen, langkah-langkah dapat diambil untuk menghindari kontaminasi reagen, peralatan laboratorium, dan ruang praktikum, karena kontaminasi tersebut dapat menghasilkan hasil positif palsu (atau negatif palsu).
Untuk membantu mengurangi kemungkinan kontaminasi, Praktik Laboratorium yang Baik harus selalu diterapkan. Secara khusus, tindakan pencegahan harus dilakukan terkait hal-hal berikut:
1. Penanganan reagen
2. Organisasi ruang kerja dan peralatan
3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekuler yang ditunjuk
4. Saran umum biologi molekuler
5. Pengendalian internal
6. Daftar Pustaka
1. Penanganan reagen
Sentrifugasi tabung reagen sebentar sebelum dibuka untuk menghindari pembentukan aerosol. Aliquot reagen untuk menghindari pembekuan-pencairan berulang dan kontaminasi stok induk. Beri label dan tanggal yang jelas pada semua tabung reagen dan reaksi, serta simpan catatan nomor lot dan batch reagen yang digunakan dalam semua percobaan. Pipet semua reagen dan sampel menggunakan ujung filter. Sebelum membeli, disarankan untuk mengonfirmasi dengan produsen apakah ujung filter sesuai dengan merek pipet yang akan digunakan.
2. Organisasi ruang kerja dan peralatan
Ruang kerja harus diatur sedemikian rupa untuk memastikan alur kerja berlangsung satu arah, dari area bersih (pra-PCR) ke area kotor (pasca-PCR). Tindakan pencegahan umum berikut akan membantu mengurangi risiko kontaminasi. Sediakan ruangan terpisah, atau setidaknya area terpisah secara fisik, untuk: persiapan mastermix, ekstraksi asam nukleat dan penambahan templat DNA, amplifikasi dan penanganan produk yang telah diamplifikasi, serta analisis produk, misalnya elektroforesis gel.
Dalam beberapa situasi, memiliki 4 ruangan terpisah sulit dilakukan. Pilihan yang memungkinkan, tetapi kurang diinginkan, adalah menyiapkan mastermix di area khusus, misalnya lemari alir laminar. Dalam kasus amplifikasi PCR bersarang, persiapan mastermix untuk reaksi putaran kedua harus dilakukan di area "bersih" untuk persiapan mastermix, tetapi inokulasi dengan produk PCR primer harus dilakukan di ruang amplifikasi, dan jika memungkinkan di area khusus (misalnya lemari alir laminar).
Setiap ruangan/area memerlukan seperangkat pipet, ujung filter, rak tabung reaksi, vortex, centrifuge (jika diperlukan), pena, reagen laboratorium generik, jas lab, dan kotak sarung tangan terpisah yang diberi label jelas. Peralatan ini akan disimpan di tempat kerja masing-masing. Tangan harus dicuci dan sarung tangan serta jas lab diganti saat berpindah antar area yang ditentukan. Reagen dan peralatan tidak boleh dipindahkan dari area kotor ke area bersih. Jika terjadi situasi ekstrem di mana reagen atau peralatan perlu dipindahkan ke area bersih, peralatan tersebut harus didekontaminasi terlebih dahulu dengan natrium hipoklorit 10%, kemudian dilap dengan air steril.
Catatan
Larutan natrium hipoklorit 10% harus dibuat segar setiap hari. Saat digunakan untuk dekontaminasi, waktu kontak minimal 10 menit harus dipatuhi.
Sebagai alternatif, produk yang tersedia secara komersial yang divalidasi sebagai dekontaminan permukaan penghancur DNA dapat digunakan jika rekomendasi keselamatan setempat tidak mengizinkan penggunaan natrium hipoklorit atau jika natrium hipoklorit tidak cocok untuk mendekontaminasi bagian logam peralatan.
Idealnya, staf harus mematuhi etos kerja searah dan tidak berpindah dari area kotor (pasca-PCR) kembali ke area bersih (pra-PCR) pada hari yang sama. Namun, terkadang hal ini tidak dapat dihindari. Jika terjadi hal seperti itu, staf harus memastikan untuk mencuci tangan secara menyeluruh, mengganti sarung tangan, menggunakan jas lab yang telah ditentukan, dan tidak membawa peralatan apa pun yang ingin mereka bawa keluar ruangan lagi, seperti buku laboratorium. Langkah-langkah pengendalian tersebut harus ditekankan dalam pelatihan staf tentang metode molekuler.
Setelah digunakan, area kerja harus dibersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (diikuti dengan air steril untuk menghilangkan sisa pemutih), etanol 70%, atau dekontaminan penghancur DNA komersial yang tervalidasi. Idealnya, lampu ultraviolet (UV) harus dipasang untuk memungkinkan dekontaminasi dengan iradiasi. Namun, penggunaan lampu UV harus dibatasi pada area kerja tertutup, misalnya lemari pengaman, untuk membatasi paparan sinar UV pada staf laboratorium. Harap patuhi petunjuk produsen untuk perawatan, ventilasi, dan pembersihan lampu UV guna memastikan lampu tetap efektif.
Jika menggunakan etanol 70% dan bukan natrium hipoklorit, penyinaran dengan sinar UV akan diperlukan untuk menyelesaikan dekontaminasi.
Jangan bersihkan vortex dan sentrifus dengan natrium hipoklorit; sebagai gantinya, lap dengan etanol 70% dan paparkan ke sinar UV, atau gunakan dekontaminan penghancur DNA komersial. Untuk tumpahan, hubungi produsen untuk saran pembersihan lebih lanjut. Jika petunjuk produsen mengizinkannya, pipet harus disterilkan secara rutin dengan autoklaf. Jika pipet tidak dapat diautoklaf, cukup bersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (dilanjutkan dengan lap bersih menggunakan air steril) atau dengan dekontaminan penghancur DNA komersial yang dilanjutkan dengan paparan sinar UV.
Pembersihan dengan natrium hipoklorit berkadar tinggi pada akhirnya dapat merusak plastik dan logam pipet jika dilakukan secara teratur; periksa rekomendasi produsen terlebih dahulu. Semua peralatan perlu dikalibrasi secara berkala sesuai jadwal yang direkomendasikan produsen. Penanggung jawab yang ditunjuk harus memastikan bahwa jadwal kalibrasi dipatuhi, catatan terperinci dipelihara, dan label servis dipajang dengan jelas pada peralatan.
3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekuler yang ditunjuk
Pra-PCR: Pengalihan reagen/persiapan mastermix: Ini harus menjadi ruang terbersih yang digunakan untuk persiapan eksperimen molekuler dan idealnya berupa lemari alir laminar khusus yang dilengkapi dengan lampu UV. Sampel, asam nukleat yang diekstraksi, dan produk PCR yang telah diamplifikasi tidak boleh ditangani di area ini. Reagen amplifikasi harus disimpan dalam freezer (atau lemari pendingin, sesuai rekomendasi produsen) di ruang yang sama, idealnya di sebelah lemari alir laminar atau area pra-PCR. Sarung tangan harus diganti setiap kali memasuki area pra-PCR atau lemari alir laminar.
Area pra-PCR atau lemari laminar flow harus dibersihkan sebelum dan sesudah digunakan sebagai berikut: Lap semua peralatan di dalam lemari, misalnya pipet, kotak tip, vortex, centrifuge, rak tabung, pena, dll. dengan etanol 70% atau dekontaminan penghancur DNA komersial, dan biarkan kering. Untuk area kerja tertutup, misalnya lemari laminar flow, paparkan penutupnya ke sinar UV selama 30 menit.
Catatan
Jangan biarkan reagen terkena sinar UV; pindahkan reagen hanya ke dalam lemari setelah bersih. Jika melakukan PCR transkripsi balik, sebaiknya bersihkan permukaan dan peralatan dengan larutan yang memecah RNase saat kontak. Hal ini dapat membantu menghindari hasil negatif palsu akibat degradasi enzim RNA. Setelah dekontaminasi dan sebelum menyiapkan mastermix, sarung tangan harus diganti sekali lagi, dan lemari siap digunakan.
Pra-PCR: Ekstraksi asam nukleat/penambahan templat:
Asam nukleat harus diekstraksi dan ditangani di area khusus kedua, menggunakan pipet, ujung filter, rak tabung, sarung tangan baru, jas lab, dan peralatan lain yang terpisah. Area ini juga digunakan untuk menambahkan templat, kontrol, dan garis tren ke dalam tabung atau pelat mastermix. Untuk menghindari kontaminasi pada sampel asam nukleat hasil ekstraksi yang sedang dianalisis, disarankan untuk mengganti sarung tangan sebelum menangani kontrol positif atau standar dan menggunakan pipet terpisah. Reagen PCR dan produk amplifikasi tidak boleh dipipet di area ini. Sampel harus disimpan di lemari pendingin atau freezer khusus di area yang sama. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Amplifikasi dan penanganan produk yang diperkuat
Ruang khusus ini diperuntukkan bagi proses pasca-amplifikasi dan harus terpisah secara fisik dari area pra-PCR. Biasanya terdapat thermocycler dan platform real-time, dan idealnya dilengkapi dengan lemari aliran laminar untuk menambahkan produk PCR putaran 1 ke reaksi putaran 2, jika PCR bersarang dilakukan. Reagen PCR dan asam nukleat yang diekstraksi tidak boleh ditangani di area ini karena risiko kontaminasi yang tinggi. Area ini harus dilengkapi dengan seperangkat sarung tangan, jas lab, rak tabung dan pelat, pipet, ujung filter, wadah, dan peralatan lainnya yang terpisah. Tabung harus disentrifugasi sebelum dibuka. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Pasca-PCR: Analisis produk
Ruangan ini diperuntukkan bagi peralatan deteksi produk, misalnya tangki elektroforesis gel, power pack, transiluminator UV, dan sistem dokumentasi gel. Area ini harus memiliki seperangkat sarung tangan, jas lab, rak pelat dan tabung, pipet, ujung filter, wadah, dan peralatan lainnya yang terpisah. Reagen lain tidak boleh dibawa ke area ini, kecuali pewarna pemuatan, penanda molekuler, gel agarosa, dan komponen penyangga. Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.
Catatan penting
Idealnya, ruang pra-PCR tidak boleh dimasuki pada hari yang sama jika pekerjaan telah dilakukan di ruang pasca-PCR. Jika hal ini benar-benar tidak dapat dihindari, pastikan tangan telah dicuci bersih terlebih dahulu dan jas lab khusus dikenakan di dalam ruangan. Buku dan dokumen laboratorium tidak boleh dibawa ke ruang pra-PCR jika telah digunakan di ruang pasca-PCR; jika perlu, bawa salinan cetak protokol/ID sampel, dll.
4. Saran umum biologi molekuler
Gunakan sarung tangan bebas serbuk untuk menghindari hambatan pengujian. Teknik pemipetan yang benar sangat penting untuk mengurangi kontaminasi. Pemipetan yang salah dapat mengakibatkan cipratan saat menuangkan cairan dan pembentukan aerosol. Praktik yang baik untuk pemipetan yang benar dapat ditemukan di tautan berikut: Panduan pemipetan Gilson, Video teknik pemipetan Anachem, Tabung sentrifus sebelum dibuka, dan buka dengan hati-hati untuk menghindari cipratan. Tutup tabung segera setelah digunakan untuk menghindari masuknya kontaminan.
Saat melakukan beberapa reaksi, siapkan satu mastermix yang berisi reagen umum (misalnya air, dNTP, buffer, primer, dan enzim) untuk meminimalkan jumlah perpindahan reagen dan mengurangi risiko kontaminasi. Disarankan untuk menyiapkan mastermix di atas es atau balok dingin. Penggunaan enzim Hot Start dapat membantu mengurangi produksi produk non-spesifik. Lindungi reagen yang berisi probe fluoresen dari cahaya untuk mencegah degradasi.
5. Pengendalian internal
Sertakan kontrol positif dan negatif yang terkarakterisasi dengan baik dan terkonfirmasi, beserta kontrol tanpa templat di semua reaksi, dan garis tren titrasi multi-titik untuk reaksi kuantitatif. Kontrol positif tidak boleh terlalu kuat sehingga menimbulkan risiko kontaminasi. Sertakan kontrol ekstraksi positif dan negatif saat melakukan ekstraksi asam nukleat.
Disarankan untuk memasang instruksi yang jelas di setiap area agar pengguna mengetahui aturan perilaku. Laboratorium diagnostik yang mendeteksi kadar DNA atau RNA yang sangat rendah dalam sampel klinis sebaiknya menerapkan langkah keamanan tambahan berupa sistem penanganan udara terpisah dengan tekanan udara sedikit positif di ruang pra-PCR dan tekanan udara sedikit negatif di ruang pasca-PCR.
Terakhir, pengembangan rencana jaminan mutu (QA) sangatlah bermanfaat. Rencana tersebut harus mencakup daftar stok induk reagen dan stok kerja, aturan penyimpanan kit dan reagen, pelaporan hasil pengendalian, program pelatihan staf, algoritma pemecahan masalah, dan tindakan perbaikan bila diperlukan.
6. Daftar Pustaka
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Menyiapkan laboratorium qPCR. Dokumen panduan untuk pengujian perairan rekreasi menggunakan metode qPCR USEPA 1611. Lansing-Michigan State University.
Kesehatan Masyarakat Inggris, NHS. Standar Inggris untuk investigasi mikrobiologi: Praktik Laboratorium yang Baik saat melakukan uji amplifikasi molekuler). Panduan Mutu. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Mendirikan laboratorium PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Pemeliharaan rutin sentrifus: pembersihan, pemeliharaan, dan disinfeksi sentrifus, rotor, dan adaptor (Buku Putih No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Praktik Laboratorium Klinik yang Baik (CPKB) untuk uji berbasis molekuler yang digunakan di laboratorium diagnostik, Dalam: Akyar I, editor. Spektrum luas kendali mutu. Rijeka, Kroasia: Intech; 2011: 29–52.
Waktu posting: 16-Jul-2020
