Tha comas aig dòighean lorg moileciuil meud mòr de dh’aigéad niùclasach a thoirt gu buil tro bhith a’ leudachadh meudan beaga a lorgar ann an sampallan. Ged a tha seo buannachdail airson lorg mothachail a chomasachadh, tha e cuideachd a’ toirt a-steach a’ chomas airson truailleadh tro bhith a’ sgaoileadh aerosolan leudachaidh ann an àrainneachd an obair-lann. Nuair a thathar a’ dèanamh dheuchainnean, faodar ceumannan a ghabhail gus casg a chuir air truailleadh ath-bheachdan, uidheamachd obair-lann agus àite beinne, oir dh’ fhaodadh truailleadh mar sin toraidhean meallta-dheimhinneach (no meallta-àicheil) a thoirt gu buil.
Gus cuideachadh le bhith a’ lughdachadh coltachd truailleadh, bu chòir Deagh Chleachdadh Obair-lann a chleachdadh an-còmhnaidh. Gu sònraichte, bu chòir ceumannan dìon a ghabhail a thaobh nan puingean a leanas:
1. A’ làimhseachadh ath-bheachdan
2. Eagrachadh àite-obrach agus uidheamachd
3. Comhairle mu chleachdadh is glanadh airson an àite mhóileciuil ainmichte
4. Comhairle choitcheann mu bhitheòlas moileciuil
5. Smachdan a-staigh
6. Leabhar-chlàr
1. A’ làimhseachadh ath-bheachdan
Cuir na tiùban ath-bhualaidh ann an centrifuge goirid mus fosgail thu iad gus casg a chur air cruthachadh aerosolan. Roinn na h-ath-bhualaidhean ann an cuibhreannan gus casg a chur air iomadh reothadh is leaghadh agus truailleadh nan stocan maighstir. Cuir bileagan is ceann-latha soilleir air na tiùban ath-bhualaidh is freagairt agus cùm clàran de na h-àireamhan baidse is lotaichean ath-bhualaidh a chaidh a chleachdadh anns a h-uile deuchainn. Pìobaich na h-ath-bhualaidhean is na sampallan uile le bhith a’ cleachdadh cinn-sìoltachain. Mus ceannaich thu iad, thathar a’ moladh dearbhadh leis an neach-dèanamh gu bheil na cinn-sìoltachain a’ freagairt air a’ bhrand phìobaid a thèid a chleachdadh.
2. Eagrachadh àite-obrach agus uidheamachd
Bu chòir àite-obrach a bhith air a chur air dòigh gus dèanamh cinnteach gu bheil sruth na h-obrach a’ tachairt ann an aon taobh, bho raointean glan (ro-PCR) gu raointean salach (às dèidh PCR). Cuidichidh na ceumannan-dìon coitcheann a leanas le bhith a’ lughdachadh cothrom truailleadh. Biodh seòmraichean ainmichte fa leth agad, no co-dhiù raointean air leth gu corporra, airson: ullachadh measgachadh maighstir, toirt a-mach searbhag niuclasach agus cur-ris teamplaid DNA, leudachadh agus làimhseachadh toraidh leasaichte, agus mion-sgrùdadh toraidh, me electrophoresis gel.
Ann an cuid de shuidheachaidhean, tha e duilich 4 seòmraichean fa leth a bhith agad. Is e roghainn a dh’ fhaodadh a bhith ann ach nach eil cho ion-mhiannaichte ullachadh a’ phrìomh-mheasgachaidh ann an àite cuibhreachaidh, me caibineat sruthadh laminar. Ma tha am measgachadh PCR neadaichte ann, bu chòir ullachadh a’ phrìomh-mheasgachaidh airson an dàrna cuairt de ath-bhualadh ullachadh san àite ‘glan’ airson ullachadh a’ phrìomh-mheasgachaidh, ach bu chòir an in-stealladh leis a’ phrìomh thoradh PCR a dhèanamh anns an t-seòmar amplification, agus mas urrainnear ann an àite cuibhreachaidh sònraichte (me caibineat sruthadh laminar).
Feumaidh gach seòmar/àite seata air leth de phìoban, cinn-sìoltachain, racaichean tiùba, vortexes, centrifuges (ma tha sin iomchaidh), pinn, ath-bheachdan obair-lann coitcheann, còtaichean obair-lann agus bogsaichean miotagan a dh’fhanas aig na stèiseanan-obrach fa leth aca. Feumar làmhan a nighe agus miotagan agus còtaichean obair-lann atharrachadh nuair a ghluaiseas tu eadar na h-àiteachan ainmichte. Cha bu chòir ath-bheachdan agus uidheam a ghluasad bho àite salach gu àite glan. Ma dh’èireas cùis anabarrach far am feum ath-bheachdan no pìos uidheam a ghluasad air ais, feumar a dhì-thruailleadh an toiseach le 10% sodium hypochlorite, agus an uairsin a sguabadh sìos le uisge sterile.
Nota
Feumar am fuasgladh 10% sodium hypochlorite a dhèanamh ùr gach latha. Nuair a thèid a chleachdadh airson dì-thruailleadh, bu chòir cumail ri ùine conaltraidh co-dhiù 10 mionaidean.
Air neo, faodar toraidhean a tha rim faighinn gu malairteach a tha air an dearbhadh mar dhì-thruailleadh uachdar a sgriosas DNA a chleachdadh mura leig molaidhean sàbhailteachd ionadail le bhith a’ cleachdadh sodium hypochlorite no mura h-eil sodium hypochlorite freagarrach airson pàirtean meatailteach uidheamachd a dhì-thruailleadh.
Gu h-iomchaidh, bu chòir do luchd-obrach cumail ri ethos sruth-obrach aon-shligheach agus gun a dhol bho raointean salach (às dèidh PCR) air ais gu raointean glan (ro-PCR) air an aon latha. Ach, is dòcha gum bi amannan ann nuair nach gabh seo a sheachnadh. Nuair a thig an leithid de shuidheachadh am bàrr, feumaidh luchd-obrach dèanamh cinnteach gun nigh iad an làmhan gu mionaideach, gun atharraich iad miotagan, gun cleachd iad an còta obair-lann ainmichte agus gun a bhith a’ toirt a-steach uidheamachd sam bith a bhios iad airson a thoirt a-mach às an t-seòmar a-rithist, leithid leabhraichean obair-lann. Bu chòir cuideam a chur air ceumannan smachd mar seo ann an trèanadh luchd-obrach air dòighean moileciuil.
Às dèidh an cleachdadh, bu chòir àiteachan beingidh a ghlanadh le 10% sodium hypochlorite (agus an uair sin uisge sterile gus bleach a tha air fhàgail a thoirt air falbh), 70% ethanol, no dì-thruailleadh dearbhte a tha ri fhaighinn gu malairteach a tha a’ sgrios DNA. Gu h-iomchaidh, bu chòir lampaichean ultraviolet (UV) a chuir a-steach gus leigeil le dì-thruailleadh le rèididheachd. Ach, bu chòir cleachdadh lampaichean UV a chuingealachadh ri àiteachan obrach dùinte, me caibineatan sàbhailteachd, gus nochdadh luchd-obrach an obair-lann do UV a chuingealachadh. Feuch an lean thu stiùiridhean an neach-dèanamh airson cùram, fionnarachadh agus glanadh lampaichean UV gus dèanamh cinnteach gu bheil na lampaichean fhathast èifeachdach.
Ma chleachdas tu 70% ethanol an àite sodium hypochlorite, bidh feum air rèididheachd le solas UV gus an dì-thruailleadh a chrìochnachadh.
Na glan an vortex agus an centrifuge le sodium hypochlorite; an àite sin, sguab sìos le 70% ethanol agus nochd do sholas UV, no cleachd dì-thruailleadh malairteach a sgriosas DNA. Ma tha dòrtadh ann, thoir sùil air an neach-dèanamh airson comhairle glanaidh a bharrachd. Ma cheadaicheas stiùiridhean an neach-dèanamh e, bu chòir pìobaidean a sterilachadh gu cunbhalach le autoclave. Mura h-urrainnear pìobaidean a autoclave, bu chòir dha a bhith gu leòr an glanadh le 10% sodium hypochlorite (agus an uairsin an sguabadh sìos gu mionaideach le uisge sterile) no le dì-thruailleadh malairteach a sgriosas DNA agus an uairsin nochdadh do UV.
Dh’fhaodadh glanadh le hypochlorite sodium àrd-cheudad cron a dhèanamh air plastaig is meatailtean pipette mu dheireadh ma thèid a dhèanamh gu cunbhalach; thoir sùil air molaidhean an neach-dèanamh an toiseach. Feumar a h-uile uidheamachd a chalabrachadh gu cunbhalach a rèir a’ chlàr-ama a tha air a mholadh leis an neach-dèanamh. Bu chòir neach ainmichte a bhith os cionn dèanamh cinnteach gu bheilear a’ cumail ris a’ chlàr-ama chalabrachaidh, gu bheilear a’ cumail logaichean mionaideach, agus gu bheil bileagan seirbheis air an taisbeanadh gu soilleir air an uidheamachd.
3. Comhairle mu chleachdadh is glanadh airson an àite mhóileciuil ainmichte
Ro-PCR: A’ roinneadh ath-bheachdan / ullachadh measgachadh maighstir: Bu chòir seo a bhith mar an t-àite as glaine de na h-àiteachan uile a thathas a’ cleachdadh airson deuchainnean moileciuil ullachadh agus bu chòir dha a bhith na chaibineat sruthadh laminar ainmichte le solas UV. Chan fhaodar sampallan, searbhag niuclasach air a thoirt a-mach agus toraidhean PCR leasaichte a làimhseachadh san àite seo. Bu chòir ath-bheachdan leudachaidh a chumail ann an reothadair (no frids, a rèir molaidhean an neach-dèanamh) san aon àite ainmichte, gu h-àraidh ri taobh a’ chaibineit sruthadh laminar no an àite ro-PCR. Bu chòir miotagan atharrachadh gach uair a thèid thu a-steach don àite ro-PCR no don chaibineat sruthadh laminar.
Bu chòir an raon ro-PCR no caibineat an t-sruthadh laminar a ghlanadh ro agus às dèidh a chleachdadh mar a leanas: Sguab sìos a h-uile nì sa chaibineat, me pìoban, bogsaichean bàrr, vortex, centrifuge, racaichean tiùb, pinn, msaa. le 70% ethanol no dì-thruailleadh malairteach a sgriosas DNA, agus leig leis tiormachadh. Ma tha raon obrach dùinte ann, me caibineat an t-sruthadh laminar, cuir a’ chochall fo sholas UV airson 30 mionaid.
Nota
Na cuir ath-bheachdan fo sholas UV; na gluais iad a-steach don chaibineat ach nuair a bhios e glan. Ma bhios tu a’ dèanamh PCR tar-sgrìobhaidh cùil, is dòcha gum bi e feumail cuideachd uachdaran agus uidheamachd a ghlanadh le fuasgladh a bhriseas sìos RNases nuair a thèid an conaltradh riutha. Dh’fhaodadh seo cuideachadh le bhith a’ seachnadh thoraidhean àicheil meallta bho bhith a’ lobhadh RNA le einsímean. Às dèidh dì-thruailleadh agus mus tèid am measgachadh maighstir ullachadh, bu chòir miotagan atharrachadh a-rithist, agus an uairsin bidh an caibineat deiseil airson a chleachdadh.
Ro-PCR: Tarraing searbhag niùclasach/cur teamplaid ris:
Feumar searbhag niùclasach a thoirt a-mach agus a làimhseachadh ann an dàrna àite ainmichte, a’ cleachdadh seata air leth de phìoban, cinn-sìoltachain, racaichean tiùb, miotagan ùra, còtaichean obair-lann agus uidheam eile. Tha an t-àite seo cuideachd airson teamplaid, smachdan agus loidhnichean-gluasaid a chur ris na tiùban no na truinnsearan measgachadh-mhaighstir. Gus casg a chuir air truailleadh nan sampallan searbhag niùclasach a chaidh a thoirt a-mach a thathas a’ sgrùdadh, thathas a’ moladh miotagan atharrachadh mus tèid smachdan no inbhean adhartach a làimhseachadh agus seata air leth de phìoban a chleachdadh. Chan fhaodar ath-bheachdan PCR agus toraidhean leasaichte a phìobaireachd san àite seo. Bu chòir sampallan a stòradh ann am fridsichean no reothadairean ainmichte san aon àite. Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite measgachadh-mhaighstir.
Iar-PCR: Leudachadh agus làimhseachadh an toraidh leudaichte
’S ann airson pròiseasan às dèidh iomadachadh a tha an t-àite ainmichte seo agus bu chòir dha a bhith air leth gu corporra bho na raointean ro-PCR. Mar as trice bidh teirm-chuairtearan agus àrd-ùrlaran fìor-ùine ann, agus gu h-iomchaidh bu chòir caibineat sruthadh laminar a bhith ann airson toradh PCR cuairt 1 a chur ris an ath-bhualadh cuairt 2, ma tha PCR neadaichte ga dhèanamh. Chan fhaodar ath-bheachdan PCR agus searbhag niuclasach a chaidh a thoirt a-mach a làimhseachadh san àite seo leis gu bheil cunnart mòr ann bho thruailleadh. Bu chòir seata air leth de mhiotagan, còtaichean obair-lann, racaichean truinnsear is tiùb, pipettes, cinn sìoltachain, bionaichean agus uidheamachd eile a bhith san àite seo. Feumar tiùban a chuir ann an ceudna mus fosgail iad. Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite measgachadh maighstir.
Iar-PCR: Mion-sgrùdadh toraidh
’S ann airson uidheam lorg thoraidhean a tha an seòmar seo, me tancaichean electrophoresis gel, pacaidean cumhachd, transilluminator UV agus an siostam sgrìobhainnean gel. Bu chòir seataichean fa leth de mhiotagan, còtaichean obair-lann, racaichean pleitean is tiùban, pipettes, cinn sìoltachain, bionaichean agus uidheam eile a bhith san àite seo. Chan fhaodar ath-bheachdan sam bith eile a thoirt a-steach don àite seo, ach a-mhàin dath luchdachadh, comharra moileciuil agus gel agarose, agus co-phàirtean bufair. Bu chòir an àite-obrach sampall a ghlanadh san aon dòigh ris an àite measgachadh maighstir.
Nota cudromach
Gu h-iomchaidh, cha bu chòir a dhol a-steach do na seòmraichean ro-PCR air an aon latha ma tha obair air a dhèanamh mu thràth anns na seòmraichean às dèidh PCR. Mura h-eil seo ri sheachnadh idir, dèan cinnteach gu bheil làmhan air an nighe gu mionaideach an toiseach agus gu bheil còtaichean obair-lann sònraichte air an caitheamh anns na seòmraichean. Chan fhaodar leabhraichean obair-lann agus pàipearan a thoirt a-steach do na seòmraichean ro-PCR ma chaidh an cleachdadh anns na seòmraichean às dèidh PCR; ma tha sin riatanach, gabh clò-bhualaidhean dùblaichte de phròtacalan/IDn sampallan, msaa.
4. Comhairle choitcheann mu bhitheòlas moileciuil
Cleachd miotagan gun phùdar gus casg a chuir air an deuchainn. Tha an dòigh cheart air pìobaireachd a chur an sàs deatamach airson truailleadh a lùghdachadh. Faodaidh pìobaireachd cheàrr leantainn gu frasadh nuair a bhios tu a’ toirt seachad lionntan agus cruthachadh aerosolan. Gheibhear deagh chleachdadh airson pìobaireachd cheart aig na ceanglaichean a leanas: stiùireadh Gilson airson pìobaireachd, bhideothan dòigh-obrach pìobaireachd Anachem, tiùban meadhan-chleachdaidh mus fosgail thu iad, agus fosgail iad gu faiceallach gus casg a chuir air frasadh. Dùin na tiùban dìreach an dèidh an cleachdadh gus casg a chuir air truailleadh a-steach.
Nuair a bhios tu a’ dèanamh iomadh ath-bhualadh, ullaich aon mheasgachadh maighstir anns a bheil riochdairean cumanta (me uisge, dNTPan, bufair, prìmearan agus einnsein) gus an àireamh de ghluasadan riochdairean a lughdachadh agus cunnart truailleadh a lughdachadh. Thathar a’ moladh am measgachadh maighstir a stèidheachadh air deigh no bloc fuar. Dh’ fhaodadh cleachdadh einnsein Tòiseachaidh Teth cuideachadh le bhith a’ lughdachadh cinneasachadh thoraidhean neo-shònraichte. Dìon riochdairean anns a bheil proban fluorescent bhon t-solas gus casg a chuir air crìonadh.
5. Smachdan a-staigh
Cuir a-steach smachdan dearbhte is dearbhte, dearbhte le deagh chomharran, còmhla ri smachd gun teamplaid anns a h-uile ath-bhualadh, agus loidhne-gluasaid ioma-phuingichte le titration airson ath-bhualaidhean cainneachdail. Cha bu chòir don smachd dearbhach a bhith cho làidir is gun cuir e cunnart truailleadh ann. Cuir a-steach smachdan às-tharraing dearbhach is àicheil nuair a bhios tu a’ dèanamh às-tharraing searbhag niuclasach.
Thathar a’ moladh gun tèid stiùiridhean soilleir a phostadh anns gach aon de na raointean gus am bi fios aig luchd-cleachdaidh air riaghailtean giùlain. Is dòcha gum bi deuchainn-lannan breithneachaidh a lorgas ìrean glè ìosal de DNA no RNA ann an sampallan clionaigeach airson ceum tèarainteachd a bharrachd a ghabhail os làimh le bhith a’ cur siostaman làimhseachaidh èadhair fa leth orra le cuideam èadhair beagan deimhinneach anns na seòmraichean ro-PCR agus cuideam èadhair beagan àicheil anns na seòmraichean às dèidh PCR.
Mu dheireadh, tha e feumail plana dearbhaidh càileachd (QA) a leasachadh. Bu chòir do phlana mar sin liostaichean de phrìomh stocan ath-bheachdan agus stocan obrach, riaghailtean airson pasganan agus ath-bheachdan a stòradh, aithris air toraidhean smachd, prògraman trèanaidh luchd-obrach, algairidhean fuasgladh dhuilgheadasan, agus gnìomhan leigheis nuair a bhios feum orra a ghabhail a-steach.
6. Leabhar-chlàr
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Caibideil 3: A’ stèidheachadh obair-lann qPCR. Sgrìobhainn stiùiridh airson uisgeachan cur-seachadan a dhearbhadh a’ cleachdadh modh qPCR USEPA 1611. Lansing- Oilthigh Stàite Michigan.
Slàinte Phoblach Shasainn, NHS. Inbhean RA airson sgrùdaidhean meanbh-bhitheòlas: Deagh Chleachdadh Obair-lann nuair a thathar a’ dèanamh deuchainnean iomadachaidh moileciuil). Stiùireadh Càileachd. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. A’ stèidheachadh obair-lann PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Cumail suas cunbhalach air centrifuges: glanadh, cumail suas agus dì-ghalarachadh centrifuges, rotors agus adapters (Pàipear geal Àir. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Deagh Chleachdadh Obair-lann Clionaigeach (GCLP) airson deuchainnean stèidhichte air moileciuil a thathas a’ cleachdadh ann an obair-lannan breithneachaidh, Ann an: Akyar I, neach-deasachaidh. Speactram farsaing de smachd càileachd. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Àm puist: 16 Iuchar 2020
