Molekulární detekční metody dokáží produkovat velké množství nukleových kyselin amplifikací stopových množství nalezených ve vzorcích. To je sice výhodné pro umožnění citlivé detekce, ale zároveň to představuje možnost kontaminace šířením amplifikačních aerosolů v laboratorním prostředí. Při provádění experimentů lze přijmout opatření, aby se zabránilo kontaminaci činidel, laboratorního vybavení a pracovního prostoru, protože taková kontaminace může vést k falešně pozitivním (nebo falešně negativním) výsledkům.
Aby se snížila pravděpodobnost kontaminace, je třeba vždy dodržovat zásady správné laboratorní praxe. Konkrétně je třeba přijmout opatření týkající se následujících bodů:
1. Manipulace s činidly
2. Organizace pracovního prostoru a vybavení
3. Pokyny k použití a čištění určeného molekulárního prostoru
4. Obecné rady z molekulární biologie
5. Vnitřní kontroly
6. Bibliografie
1. Manipulace s činidly
Před otevřením zkumavky s činidly krátce centrifugujte, abyste zabránili tvorbě aerosolů. Rozdělte činidla na alikvotní podíly, abyste zabránili opakovanému zmrazování a rozmrazování a kontaminaci základních roztoků. Jasně označte a datujte všechny zkumavky s činidly a reakcemi a veďte záznamy o číslech šarží a dávek činidel použitých ve všech experimentech. Všechny činidla a vzorky pipetujte pomocí filtračních špiček. Před nákupem je vhodné ověřit si u výrobce, zda filtrační špičky pasují na značku pipety, kterou budete používat.
2. Organizace pracovního prostoru a vybavení
Pracovní prostor by měl být organizován tak, aby tok práce probíhal jedním směrem, z čistých prostor (před PCR) do znečištěných prostor (po PCR). Následující obecná opatření pomohou snížit riziko kontaminace. Mějte k dispozici oddělené vyhrazené místnosti nebo alespoň fyzicky oddělené prostory pro: přípravu mastermixu, extrakci nukleových kyselin a přidání templátu DNA, amplifikaci a manipulaci s amplifikovaným produktem a analýzu produktu, např. gelovou elektroforézu.
V některých prostředích je obtížné mít 4 oddělené místnosti. Možnou, ale méně žádoucí možností je provádět přípravu mastermixu v uzavřeném prostoru, např. v laminární komoře. V případě nested PCR amplifikace by se příprava mastermixu pro druhé kolo reakce měla provádět v „čisté“ oblasti pro přípravu mastermixu, ale inokulace primárním PCR produktem by se měla provádět v amplifikační místnosti a pokud možno ve vyhrazeném uzavřeném prostoru (např. v laminární komoře).
Každá místnost/prostor potřebuje samostatnou sadu jasně označených pipet, filtračních špiček, stojanů na zkumavky, vortexů, centrifug (pokud jsou relevantní), per, univerzálních laboratorních činidel, laboratorních plášťů a krabic s rukavicemi, které zůstanou na příslušných pracovních stanicích. Při přesunu mezi určenými oblastmi je nutné si umýt ruce a vyměnit rukavice a laboratorní pláště. Činidla a vybavení by se neměly přemisťovat ze znečištěné oblasti do čisté. V extrémním případě, kdy je třeba činidlo nebo vybavení přesunout zpět, musí být nejprve dekontaminováno 10% roztokem chlornanu sodného a následně otřeno sterilní vodou.
Poznámka
10% roztok chlornanu sodného musí být denně čerstvý. Při použití k dekontaminaci je třeba dodržet minimální dobu kontaktu 10 minut.
Alternativně lze použít komerčně dostupné produkty, které jsou validovány jako povrchové dekontaminanty ničící DNA, pokud místní bezpečnostní doporučení neumožňují použití chlornanu sodného nebo pokud chlornan sodný není vhodný pro dekontaminaci kovových částí zařízení.
V ideálním případě by se personál měl řídit etickým principem jednosměrného pracovního postupu a v tentýž den se nevracet ze špinavých prostor (po PCR) zpět do čistých prostor (před PCR). Mohou však nastat situace, kdy je to nevyhnutelné. V takovém případě si musí personál důkladně umýt ruce, vyměnit rukavice, použít určený laboratorní plášť a nenosit s sebou žádné vybavení, které si bude chtít z místnosti znovu odnést, například laboratorní knihy. Taková kontrolní opatření by měla být zdůrazněna při školení personálu v oblasti molekulárních metod.
Po použití by měly být pracovní prostory vyčištěny 10% roztokem chlornanu sodného (a následně sterilní vodou k odstranění zbytků bělidla), 70% ethanolem nebo validovaným komerčně dostupným dekontaminačním prostředkem ničícím DNA. V ideálním případě by měly být nainstalovány ultrafialové (UV) lampy, které umožní dekontaminaci ozářením. Použití UV lamp by však mělo být omezeno na uzavřené pracovní prostory, např. bezpečnostní skříně, aby se omezilo vystavení laboratorního personálu UV záření. Dodržujte prosím pokyny výrobce pro péči o UV lampy, větrání a čištění, aby byla zajištěna jejich účinnost.
Pokud se místo chlornanu sodného používá 70% ethanol, bude k dokončení dekontaminace nutné ozáření UV světlem.
Nečistěte vortex a centrifugu chlornanem sodným; místo toho otřete 70% ethanolem a vystavte UV záření nebo použijte komerční dekontaminační prostředek ničící DNA. V případě rozlitých látek se obraťte na výrobce, kde vám poskytne další pokyny k čištění. Pokud to pokyny výrobce dovolují, měly by být pipety rutinně sterilizovány v autoklávu. Pokud pipety nelze autoklávovat, mělo by stačit jejich vyčištění 10% chlornanem sodným (s následným důkladným otřením sterilní vodou) nebo komerčním dekontaminačním prostředkem ničícím DNA a následné vystavení UV záření.
Čištění vysokoprocentním chlornanem sodným může při pravidelném čištění poškodit plasty a kovy pipet; nejprve si prostudujte doporučení výrobce. Veškeré zařízení je třeba pravidelně kalibrovat podle harmonogramu doporučeného výrobcem. Určená osoba by měla být zodpovědná za dodržování kalibračního harmonogramu, vedení podrobných protokolů a jasně umístěné servisní štítky na zařízení.
3. Pokyny k použití a čištění určeného molekulárního prostoru
PředPCR: Alikvotní rozdělení činidel / příprava mastermixu: Toto by měl být nejčistší ze všech prostor používaných pro přípravu molekulárních experimentů a ideálně by se mělo jednat o vyhrazený laminární box vybavený UV světlem. V tomto prostoru se nesmí manipulovat se vzorky, extrahovanými nukleovými kyselinami a amplifikovanými PCR produkty. Amplifikační činidla by měla být uchovávána v mrazáku (nebo chladničce dle doporučení výrobce) ve stejném vyhrazeném prostoru, ideálně vedle laminárního boxu nebo prostoru před PCR. Rukavice by se měly vyměňovat pokaždé při vstupu do prostoru před PCR nebo laminárního boxu.
Prostor před PCR nebo laminární skříň by měly být před a po použití vyčištěny následujícím způsobem: Všechny předměty ve skříni, např. pipety, krabičky na špičky, vortex, centrifugu, stojany na zkumavky, pera atd., otřete 70% ethanolem nebo komerčním dekontaminačním prostředkem ničícím DNA a nechte uschnout. V případě uzavřeného pracovního prostoru, např. laminární skříňky, vystavte kryt UV záření po dobu 30 minut.
Poznámka
Nevystavujte činidla UV záření; do skříňky je přemístěte až po jejím vyčištění. Pokud provádíte PCR s reverzní transkripcí, může být užitečné otřít povrchy a zařízení roztokem, který při kontaktu rozkládá RNázy. To může pomoci zabránit falešně negativním výsledkům z enzymatické degradace RNA. Po dekontaminaci a před přípravou mastermixu je třeba znovu vyměnit rukavice a poté je skříňka připravena k použití.
Pre-PCR: Extrakce nukleových kyselin/přidání templátu:
Nukleová kyselina musí být extrahována a manipulována v druhé určené oblasti s použitím samostatné sady pipet, filtračních špiček, stojanů na zkumavky, nových rukavic, laboratorních plášťů a dalšího vybavení. Tato oblast je také určena pro přidávání templátů, kontrol a trendových čar do zkumavek nebo destiček s mastermixem. Aby se zabránilo kontaminaci analyzovaných vzorků extrahovaných nukleových kyselin, doporučuje se před manipulací s pozitivními kontrolami nebo standardy vyměnit rukavice a použít samostatnou sadu pipet. PCR činidla a amplifikované produkty se v této oblasti nesmí pipetovat. Vzorky by měly být skladovány v určených chladničkách nebo mrazničkách ve stejné oblasti. Pracovní prostor pro vzorky by měl být čištěn stejným způsobem jako prostor pro mastermix.
Post-PCR: Amplifikace a manipulace s amplifikovaným produktem
Tento vyhrazený prostor je určen pro post-amplifikační procesy a měl by být fyzicky oddělený od prostor před PCR. Obvykle obsahuje termocyklery a platformy pro reálný čas a ideálně by měl mít laminární kabinet pro přidání produktu PCR z 1. kola do reakce z 2. kola, pokud se provádí vnořená PCR. S PCR činidly a extrahovanou nukleovou kyselinou se v této oblasti nesmí manipulovat, protože je zde vysoké riziko kontaminace. Tato oblast by měla mít samostatnou sadu rukavic, laboratorních plášťů, stojanů na destičky a zkumavky, pipet, filtračních špiček, nádob a dalšího vybavení. Zkumavky musí být před otevřením centrifugovány. Pracovní prostor pro vzorky by měl být čištěn stejným způsobem jako prostor pro mastermix.
Post-PCR: Analýza produktu
Tato místnost je určena pro zařízení pro detekci produktů, např. nádrže pro gelovou elektroforézu, napájecí zdroje, UV transiluminátor a systém pro dokumentaci gelů. V této oblasti by měly být samostatné sady rukavic, laboratorní pláště, stojany na destičky a zkumavky, pipety, filtrační špičky, nádoby a další vybavení. Do této oblasti nelze vnášet žádné další činidla, s výjimkou barviva pro nanášení, molekulárního markeru, agarózového gelu a složek pufrů. Pracovní prostor pro vzorky by měl být čištěn stejným způsobem jako prostor pro mastermix.
Důležitá poznámka
V ideálním případě by se do místností před PCR nemělo vstupovat ve stejný den, pokud již byla provedena práce v místnostech po PCR. Pokud je to zcela nevyhnutelné, zajistěte, aby si byly nejprve důkladně umyty ruce a aby se v místnostech nosily speciální laboratorní pláště. Laboratorní knihy a dokumenty se nesmí nosit do místností před PCR, pokud byly použity v místnostech po PCR; v případě potřeby si pořiďte duplikáty protokolů/identifikačních čísel vzorků atd.
4. Obecné rady z molekulární biologie
Používejte rukavice bez pudru, abyste zabránili inhibici testu. Správná technika pipetování je zásadní pro snížení kontaminace. Nesprávné pipetování může při dávkování tekutin vést k rozstřikování a tvorbě aerosolů. Osvědčené postupy pro správné pipetování naleznete na následujících odkazech: Gilsonův průvodce pipetováním, videa s technikou pipetování Anachem, Zkumavky před otevřením centrifugujte a otevírejte je opatrně, abyste zabránili rozstřikování. Zkumavky po použití ihned uzavřete, abyste zabránili vniknutí kontaminantů.
Při provádění více reakcí připravte jeden mastermix obsahující běžné činidla (např. vodu, dNTP, pufr, primery a enzym), abyste minimalizovali počet přenosů činidel a snížili riziko kontaminace. Doporučuje se umístit mastermix na led nebo do studeného bloku. Použití enzymu Hot Start může pomoci snížit produkci nespecifických produktů. Chraňte činidla obsahující fluorescenční sondy před světlem, aby nedošlo k jejich degradaci.
5. Vnitřní kontroly
Zahrňte dobře charakterizované, potvrzené pozitivní a negativní kontroly spolu s kontrolou bez použití templátu ve všech reakcích a vícebodovou titrační trendovou linii pro kvantitativní reakce. Pozitivní kontrola by neměla být tak silná, aby představovala riziko kontaminace. Při provádění extrakce nukleových kyselin zahrňte pozitivní a negativní extrakční kontroly.
Doporučuje se, aby v každé z těchto oblastí byly umístěny jasné pokyny, aby si uživatelé byli vědomi pravidel chování. Diagnostické laboratoře, které detekují velmi nízké hladiny DNA nebo RNA v klinických vzorcích, mohou chtít zavést dodatečné bezpečnostní opatření v podobě oddělených systémů pro úpravu vzduchu s mírně pozitivním tlakem vzduchu v místnostech před PCR a mírně negativním tlakem vzduchu v místnostech po PCR.
V neposlední řadě je užitečné vytvořit plán zajištění kvality (QA). Takový plán by měl zahrnovat seznamy základních a pracovních zásob činidel, pravidla pro skladování sad a činidel, hlášení výsledků kontrol, programy školení personálu, algoritmy pro řešení problémů a v případě potřeby nápravná opatření.
6. Bibliografie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitola 3: Zřízení laboratoře qPCR. Pokyny pro testování rekreačních vod pomocí metody USEPA qPCR 1611. Lansing-Michiganská státní univerzita.
Public Health England, NHS. Standardy Spojeného království pro mikrobiologická vyšetření: Správná laboratorní praxe při provádění molekulárních amplifikačních testů. Pokyny pro kvalitu. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Zřízení PCR laboratoře. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Běžná údržba centrifug: čištění, údržba a dezinfekce centrifug, rotorů a adaptérů (Bílá kniha č. 14). Hamburk: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Správná klinická laboratorní praxe (GCLP) pro molekulárně založené testy používané v diagnostických laboratořích, In: Akyar I, editor. Široké spektrum kontroly kvality. Rijeka, Chorvatsko: Intech; 2011: 29–52.
Čas zveřejnění: 16. července 2020
