分子检测的注意事项

分子检测方法能够通过扩增样本中的微量核酸来产生大量核酸。这虽然有利于实现灵敏的检测，但也存在通过实验室环境中扩增气溶胶扩散造成污染的可能性。在进行实验时，可以采取措施避免试剂、实验室设备和工作台空间的污染，因为此类污染可能会产生假阳性（或假阴性）结果。

为了降低污染的可能性，应始终遵循良好实验室规范。具体而言，应采取以下预防措施：

1. 处理试剂
2. 工作空间和设备的组织
3. 指定分子空间的使用和清洁建议
4. 一般分子生物学建议
5. 内部控制
6. 参考书目

1. 处理试剂

打开试剂管前，请短暂离心，以避免产生气溶胶。分装试剂以避免多次冻融和母液污染。所有试剂和反应管均应清晰标记并注明日期，并妥善保存所有实验中使用的试剂批号和批号记录。所有试剂和样品均应使用滤芯吸头移液。购买前，建议与制造商确认滤芯吸头是否与所用移液器的品牌匹配。

2. 工作空间和设备的组织

工作空间应合理组织，确保工作流程单向进行，从洁净区（PCR前）到脏污区（PCR后）。以下一般预防措施有助于降低污染风险。应为以下操作设置单独的指定房间，或至少在物理上隔离的区域：主混合物制备、核酸提取和DNA模板添加、扩增和扩增产物处理以及产物分析（例如凝胶电泳）。

在某些情况下，拥有 4 个独立的房间比较困难。一个可行的但不太理想的方案是在密闭区域（例如层流柜）进行 Mastermix 的制备。对于嵌套 PCR 扩增，第二轮反应的 Mastermix 制备应在 Mastermix 制备的“清洁”区域进行，但 PCR 产物的接种应在扩增室进行，如果可能的话，最好在专用密闭区域（例如层流柜）进行。

每个房间/区域均需配备一套单独且清晰标记的移液器、滤芯吸头、试管架、涡旋振荡器、离心机（如适用）、笔、通用试剂、实验服和手套盒，并放置在各自的工作台上。在指定区域之间移动时，必须洗手并更换手套和实验服。试剂和设备不得从脏污区域移至清洁区域。如果出现极端情况，需要将试剂或设备向后移动，则必须先用10%次氯酸钠消毒，然后用无菌水擦拭。

笔记

10%次氯酸钠溶液必须每日新鲜配制。用于消毒时，接触时间至少应为10分钟。
或者，如果当地安全建议不允许使用次氯酸钠，或者次氯酸钠不适合用于净化设备的金属部件，则可以使用经过验证的可作为 DNA 破坏表面净化剂的市售产品。

理想情况下，工作人员应遵守单向工作流程，当天不要从污染区（PCR后）返回清洁区（PCR前）。然而，有时这种情况不可避免。在这种情况下，工作人员必须彻底洗手、更换手套、穿着指定的实验服，并且不要带入任何他们想再次带出房间的设备，例如实验手册。在分子方法人员培训中，应强调此类控制措施。

使用后，应使用 10% 次氯酸钠（然后用无菌水去除残留漂白剂）、70% 乙醇或市售的经过验证的 DNA 破坏消毒剂清洁实验台。理想情况下，应安装紫外线 (UV) 灯，以便通过辐射进行消毒。然而，紫外线灯应仅限于封闭的工作区域，例如安全柜，以限制实验室工作人员的紫外线照射。请遵循制造商关于紫外线灯保养、通风和清洁的说明，以确保灯保持有效。

如果使用 70% 乙醇代替次氯酸钠，则需要用紫外线照射才能完成净化。
请勿使用次氯酸钠清洁涡旋和离心机；相反，请使用 70% 乙醇擦拭并暴露于紫外线下，或使用市售的 DNA 破坏性消毒剂。如果发生溢出，请咨询制造商以获取进一步的清洁建议。如果制造商的说明允许，应定期使用高压灭菌器对移液器进行消毒。如果移液器无法进行高压灭菌，则可以使用 10% 次氯酸钠（然后用无菌水彻底擦拭）或市售的 DNA 破坏性消毒剂进行清洁，然后进行紫外线照射即可。

如果定期使用高浓度次氯酸钠清洁，最终可能会损坏移液器的塑料和金属材质；请先查看制造商的建议。所有设备均需按照制造商建议的时间表定期校准。应指定专人负责确保严格遵守校准计划，维护详细的日志，并在设备上清晰地展示服务标签。

3. 指定分子空间的使用和清洁建议

PCR 前：试剂分装/预混液制备：该区域应是所有分子实验准备区域中最洁净的区域，最好是配备紫外线灯的专用层流柜。样本、提取的核酸和扩增的 PCR 产物不得在此区域处理。扩增试剂应存放在同一指定区域的冷冻柜（或根据制造商建议的冷藏柜）中，最好位于层流柜或 PCR 前区域旁边。每次进入 PCR 前区域或层流柜时都应更换手套。

PCR 预处理区域或层流柜在使用前后应按如下方式清洁：用 70% 乙醇或市售 DNA 破坏消毒剂擦拭柜内所有物品，例如移液器、吸头盒、涡旋振荡器、离心机、试管架、笔等，并使其干燥。如果是封闭的工作区域，例如层流柜，则将罩子置于紫外线下照射 30 分钟。

笔记

请勿将试剂暴露在紫外线下；只有在清洁后才能将其放入试剂柜中。如果进行逆转录PCR，用能够分解接触RNA酶的溶液擦拭表面和设备也可能有帮助。这有助于避免因RNA酶降解而导致的假阴性结果。净化后，在制备预混液之前，应再次更换手套，然后试剂柜即可使用。

PCR 前：核酸提取/模板添加：

核酸提取和处理必须在第二个指定区域进行，并使用单独的移液器、滤芯吸头、试管架、干净手套、实验服和其他设备。该区域还用于将模板、对照和趋势线添加到Mastermix管或板中。为避免正在分析的提取核酸样本受到污染，建议在处理阳性对照或标准品前更换手套，并使用单独的移液器。PCR试剂和扩增产物不得在此区域移液。样品应存放在同一区域的指定冰箱或冰柜中。样品工作区应与Mastermix区域一样进行清洁。

PCR 后：扩增和扩增产物的处理

该指定区域用于扩增后处理，应与 PCR 前区域物理隔离。该区域通常包含热循环仪和实时荧光定量PCR平台，理想情况下应配备层流柜，用于将第一轮 PCR 产物添加到第二轮反应中（如果进行嵌套 PCR）。由于污染风险高，不得在此区域处理 PCR 试剂和提取的核酸。该区域应配备单独的手套、实验服、板架和试管架、移液器、滤芯吸头、试剂盒和其他设备。试管在打开前必须离心。样品工作区应采用与母液混合液区域相同的清洁方式。

PCR 后：产物分析

此房间用于放置产品检测设备，例如凝胶电泳槽、电源组、紫外透射仪和凝胶成像系统。该区域应配备单独的手套、实验服、板架和试管架、移液器、滤芯吸头、试剂盒和其他设备。除上样染料、分子标记物、琼脂糖凝胶和缓冲液外，其他试剂不得带入此区域。样品工作区应采用与母液混合区相同的清洁方式。

重要提示

理想情况下，如果已在 PCR 后操作室进行过工作，则不应在同一天进入 PCR 前操作室。如果无法避免，请确保先彻底洗手，并在操作室穿着专用实验服。实验室记录簿和文件如果在 PCR 后操作室使用过，则不得带入 PCR 前操作室；如有必要，请复印打印实验方案/样本 ID 等文件。

4. 一般分子生物学建议

使用无粉手套以避免抑制实验。正确的移液技术对于减少污染至关重要。错误的移液操作会导致液体喷溅和气溶胶的产生。以下链接提供了正确的移液方法：Gilson 移液指南、Anachem 移液技术视频、打开前请先离心试管，并小心打开试管以避免喷溅。使用后请立即盖紧试管，以避免引入污染物。

进行多个反应时，请准备一份包含常用试剂（例如水、dNTP、缓冲液、引物和酶）的预混液，以最大程度地减少试剂转移次数并降低污染风险。建议将预混液置于冰上或冷块上。使用热启动酶可能有助于减少非特异性产物的产生。含有荧光探针的试剂应避光保存，以免降解。

5. 内部控制

在所有反应中，应设置已充分表征并确认的阳性和阴性对照，以及无模板对照，并针对定量反应设置多点滴定趋势线。阳性对照的强度不应过高，以免造成污染风险。进行核酸提取时，应设置阳性和阴性提取对照。

建议在每个区域张贴清晰的指示，以便用户了解行为规则。在临床样本中检测出极低浓度DNA或RNA的诊断实验室，可能需要采取额外的安全措施，在PCR前室设置略微正压的空气处理系统，在PCR后室设置略微负压的空气处理系统。

最后，制定质量保证 (QA) 计划将大有裨益。该计划应包括试剂主库存和工作库存清单、试剂盒和试剂的储存规则、质控结果报告、员工培训计划、故障排除算法以及必要时的补救措施。

6. 参考书目

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 第三章：建立qPCR实验室。一份使用美国环保署qPCR方法1611检测娱乐用水的指导文件。兰辛-密歇根州立大学。

英国公共卫生部，NHS。英国微生物学调查标准：进行分子扩增分析时的良好实验室规范。质量指南。2013；4(4)：1-15。

Mifflin T.建立PCR实验室。Cold Spring Harb Protoc.2007；7。

Schroeder S 2013. 离心机的日常维护：离心机、转子和适配器的清洁、维护和消毒（白皮书第14号）。汉堡：Eppendorf；2013年。

Viana RV，Wallis CL。《诊断实验室分子检测的良好临床实验室规范》（GCLP），载于：Akyar I 主编。《广泛的质量控制范围》。克罗地亚里耶卡：Intech；2011：29–52。