Молекулярные методы обнаружения позволяют получать большой объем нуклеиновой кислоты путем амплификации следовых количеств, содержащихся в образцах. Хотя это и полезно для обеспечения чувствительного обнаружения, это также создает возможность загрязнения из-за распространения аэрозолей, образующихся в результате амплификации, в лабораторной среде. При проведении экспериментов можно принять меры для предотвращения загрязнения реагентов, лабораторного оборудования и рабочего пространства, поскольку такое загрязнение может привести к ложноположительным (или ложноотрицательным) результатам.
Для снижения вероятности загрязнения необходимо всегда соблюдать надлежащую лабораторную практику. В частности, следует принимать меры предосторожности в отношении следующих моментов:
1. Работа с реагентами
2. Организация рабочего пространства и оборудования.
3. Рекомендации по использованию и очистке отведенного для молекулярных работ пространства.
4. Общие рекомендации по молекулярной биологии
5. Внутренний контроль
6. Библиография
1. Работа с реагентами
Перед открытием пробирок с реагентами кратковременно центрифугируйте их, чтобы избежать образования аэрозолей. Разделите реагенты на аликвоты, чтобы избежать многократного замораживания-оттаивания и загрязнения исходных растворов. Четко маркируйте и датируйте все пробирки с реагентами и реакционные пробирки, а также ведите журналы номеров партий и серий реагентов, использованных во всех экспериментах. Доставляйте все реагенты и образцы с помощью фильтрующих наконечников. Перед покупкой рекомендуется уточнить у производителя, подходят ли фильтрующие наконечники к используемой марке пипетки.
2. Организация рабочего пространства и оборудования.
Рабочее пространство должно быть организовано таким образом, чтобы поток работы происходил в одном направлении, от чистых зон (до ПЦР) к загрязненным зонам (после ПЦР). Следующие общие меры предосторожности помогут снизить вероятность загрязнения. Необходимо иметь отдельные специально отведенные помещения или, как минимум, физически разделенные зоны для: приготовления мастер-смеси, экстракции нуклеиновых кислот и добавления ДНК-матрицы, амплификации и обработки амплифицированного продукта, а также анализа продукта, например, гель-электрофореза.
В некоторых случаях наличие 4 отдельных помещений затруднительно. Возможный, но менее предпочтительный вариант — приготовление мастер-микса в изолированной зоне, например, в ламинарном боксе. В случае вложенной ПЦР-амплификации приготовление мастер-микса для второго раунда реакции следует проводить в «чистой» зоне для приготовления мастер-микса, но инокуляцию первичным ПЦР-продуктом следует проводить в помещении для амплификации, и, по возможности, в специально отведенной изолированной зоне (например, в ламинарном боксе).
В каждой комнате/зоне должен быть отдельный набор четко обозначенных пипеток, наконечников для фильтров, штативов для пробирок, вихревых смесителей, центрифуг (при необходимости), ручек, стандартных лабораторных реактивов, лабораторных халатов и коробок с перчатками, которые должны оставаться на соответствующих рабочих местах. Руки необходимо мыть, а перчатки и лабораторные халаты менять при перемещении между обозначенными зонами. Реактивы и оборудование нельзя перемещать из грязной зоны в чистую. В крайнем случае, если реактив или оборудование необходимо переместить в обратном направлении, его необходимо сначала дезинфицировать 10% раствором гипохлорита натрия, а затем протереть стерильной водой.
Примечание
10%-ный раствор гипохлорита натрия необходимо готовить ежедневно. При использовании для дезинфекции следует соблюдать минимальное время контакта — 10 минут.
В качестве альтернативы, если местные рекомендации по безопасности не допускают использования гипохлорита натрия или если гипохлорит натрия не подходит для дезинфекции металлических частей оборудования, можно использовать имеющиеся в продаже продукты, прошедшие проверку на способность уничтожать ДНК на поверхностях.
В идеале персонал должен придерживаться принципа однонаправленного рабочего потока и не переходить из грязных зон (после ПЦР) обратно в чистые зоны (до ПЦР) в течение одного дня. Однако могут быть случаи, когда этого избежать невозможно. В таких случаях персонал должен тщательно мыть руки, менять перчатки, использовать специальный лабораторный халат и не приносить в помещение оборудование, которое они захотят вынести обратно, например, лабораторные журналы. Такие меры контроля следует подчеркивать при обучении персонала методам молекулярной биологии.
После использования рабочие поверхности следует очищать 10% раствором гипохлорита натрия (с последующей промывкой стерильной водой для удаления остатков отбеливателя), 70% этанолом или проверенным коммерчески доступным дезинфицирующим средством, разрушающим ДНК. В идеале следует устанавливать ультрафиолетовые (УФ) лампы для дезинфекции путем облучения. Однако использование УФ-ламп следует ограничивать закрытыми рабочими зонами, например, защитными боксами, чтобы ограничить воздействие УФ-излучения на персонал лаборатории. Пожалуйста, соблюдайте инструкции производителя по уходу, вентиляции и очистке УФ-ламп, чтобы обеспечить их эффективную работу.
При использовании 70% этанола вместо гипохлорита натрия для завершения дезинфекции потребуется облучение ультрафиолетовым светом.
Не очищайте вихревой смеситель и центрифугу гипохлоритом натрия; вместо этого протрите их 70%-ным этанолом и подвергните воздействию УФ-излучения, или используйте коммерческое дезинфицирующее средство, разрушающее ДНК. В случае разлива обратитесь к производителю за дополнительными рекомендациями по очистке. Если это разрешено инструкциями производителя, пипетки следует регулярно стерилизовать в автоклаве. Если автоклавирование невозможно, достаточно очистить пипетки 10%-ным гипохлоритом натрия (с последующей тщательной протиркой стерильной водой) или коммерческим дезинфицирующим средством, разрушающим ДНК, с последующим воздействием УФ-излучения.
Регулярная очистка пипеток раствором гипохлорита натрия высокой концентрации может со временем повредить пластик и металл; перед началом работы необходимо ознакомиться с рекомендациями производителя. Все оборудование необходимо регулярно калибровать в соответствии с графиком, рекомендованным производителем. Должно быть назначено ответственное лицо, которое будет следить за соблюдением графика калибровки, вести подробные журналы и четко отображать сервисные этикетки на оборудовании.
3. Рекомендации по использованию и очистке отведенного для молекулярных работ пространства.
Подготовка к ПЦР: Разделение реагентов на аликвоты / приготовление мастер-смеси: Это должно быть самое чистое из всех помещений, используемых для подготовки молекулярных экспериментов, и в идеале это должен быть специально оборудованный ламинарный бокс с УФ-лампой. В этой зоне нельзя работать с образцами, экстрагированными нуклеиновыми кислотами и амплифицированными продуктами ПЦР. Реагенты для амплификации следует хранить в морозильной камере (или холодильнике, согласно рекомендациям производителя) в том же специально оборудованном помещении, в идеале рядом с ламинарным боксом или зоной подготовки к ПЦР. Перчатки следует менять каждый раз при входе в зону подготовки к ПЦР или ламинарный бокс.
Рабочее место перед ПЦР-тестированием или ламинарный бокс следует очищать до и после использования следующим образом: протрите все предметы в боксе, например, пипетки, контейнеры для наконечников, вихревой смеситель, центрифугу, штативы для пробирок, ручки и т. д., 70% этанолом или коммерческим дезинфицирующим средством, разрушающим ДНК, и дайте им высохнуть. В случае закрытого рабочего пространства, например, ламинарного бокса, подвергните бокс воздействию УФ-излучения в течение 30 минут.
Примечание
Не подвергайте реагенты воздействию ультрафиолетового излучения; перемещайте их в бокс только после его очистки. При проведении ПЦР с обратной транскрипцией также может быть полезно протереть поверхности и оборудование раствором, который разрушает РНКазы при контакте. Это может помочь избежать ложноотрицательных результатов, вызванных ферментативным разрушением РНК. После дезинфекции и перед приготовлением мастер-смеси следует снова сменить перчатки, после чего бокс готов к использованию.
Подготовка к ПЦР: выделение нуклеиновых кислот/добавление матрицы:
Извлечение и обработка нуклеиновых кислот должны производиться во второй специально отведенной зоне с использованием отдельного набора пипеток, фильтрующих наконечников, штативов для пробирок, чистых перчаток, лабораторных халатов и другого оборудования. Эта зона также предназначена для добавления матрицы, контрольных образцов и линий тренда в пробирки или планшеты с мастер-смесью. Во избежание загрязнения анализируемых образцов извлеченных нуклеиновых кислот рекомендуется менять перчатки перед работой с положительными контролями или стандартами и использовать отдельный набор пипеток. В этой зоне нельзя пипетировать реагенты для ПЦР и амплифицированные продукты. Образцы следует хранить в специально отведенных холодильниках или морозильных камерах в той же зоне. Рабочее место для образцов следует очищать так же, как и рабочее место для мастер-смеси.
После ПЦР: амплификация и обработка амплифицированного продукта.
Это специально отведенное пространство предназначено для процессов после амплификации и должно быть физически отделено от зон подготовки к ПЦР. Обычно здесь находятся термоциклеры и платформы для проведения ПЦР в реальном времени, а в идеале должен быть ламинарный бокс для добавления продукта ПЦР первого раунда ко второму раунду, если проводится вложенная ПЦР. В этой зоне нельзя работать с реагентами для ПЦР и выделенной нуклеиновой кислотой, поскольку риск загрязнения высок. В этой зоне должны быть отдельные перчатки, лабораторные халаты, штативы для планшетов и пробирок, пипетки, фильтрующие наконечники, контейнеры и другое оборудование. Пробирки необходимо центрифугировать перед вскрытием. Рабочее пространство для образцов следует очищать так же, как и пространство для мастер-смеси.
Пост-ПЦР-анализ: анализ продукта
Это помещение предназначено для оборудования для обнаружения продуктов, например, камер для гель-электрофореза, блоков питания, УФ-трансиллюминатора и системы документирования гелей. В этой зоне должны быть отдельные комплекты перчаток, лабораторных халатов, штативы для планшетов и пробирок, пипетки, наконечники для фильтров, контейнеры и другое оборудование. Вносить в эту зону любые другие реагенты, за исключением красителя для загрузки образцов, молекулярного маркера, агарозного геля и компонентов буфера, запрещено. Рабочее место для образцов должно быть очищено так же, как и рабочее место для мастер-смесей.
Важное примечание
В идеале, посещение помещений для подготовки к ПЦР-тестированию в тот же день недопустимо, если работа уже была выполнена в помещениях для последующего анализа. Если это совершенно неизбежно, необходимо предварительно тщательно вымыть руки и надеть специальные лабораторные халаты. Лабораторные журналы и документы нельзя проносить в помещения для подготовки к ПЦР-тестированию, если они использовались в помещениях для последующего анализа; при необходимости сделайте дубликаты распечаток протоколов/идентификаторов образцов и т. д.
4. Общие рекомендации по молекулярной биологии
Используйте перчатки без талька, чтобы избежать ингибирования анализа. Правильная техника пипетирования имеет первостепенное значение для снижения уровня загрязнения. Неправильное пипетирование может привести к разбрызгиванию жидкостей и образованию аэрозолей. Рекомендации по правильному пипетированию можно найти по следующим ссылкам: руководство Gilson по пипетированию, видеоролики Anachem по технике пипетирования, центрифугируйте пробирки перед открытием и открывайте их осторожно, чтобы избежать разбрызгивания. Закрывайте пробирки сразу после использования, чтобы избежать попадания загрязнений.
При проведении нескольких реакций подготовьте одну мастер-смесь, содержащую общие реагенты (например, воду, дНТФ, буфер, праймеры и фермент), чтобы минимизировать количество переливаний реагентов и снизить риск загрязнения. Рекомендуется готовить мастер-смесь на льду или охлаждающем блоке. Использование фермента с «горячим стартом» может помочь уменьшить образование неспецифических продуктов. Защищайте реагенты, содержащие флуоресцентные зонды, от света, чтобы избежать их деградации.
5. Внутренний контроль
Включите в каждую реакцию хорошо охарактеризованные, подтвержденные положительные и отрицательные контроли, а также контроль без матрицы и многоточечную титрованную линию тренда для количественных реакций. Положительный контроль не должен быть настолько сильным, чтобы представлять риск загрязнения. При проведении экстракции нуклеиновых кислот включите положительные и отрицательные контроли экстракции.
Рекомендуется разместить четкие инструкции в каждой из зон, чтобы пользователи были осведомлены о правилах поведения. Диагностическим лабораториям, обнаруживающим очень низкие уровни ДНК или РНК в клинических образцах, может быть целесообразно принять дополнительную меру безопасности, установив отдельные системы вентиляции с небольшим избыточным давлением воздуха в помещениях для подготовки к ПЦР и небольшим отрицательным давлением воздуха в помещениях для проведения ПЦР.
Наконец, полезно разработать план обеспечения качества (QA). Такой план должен включать списки основных и рабочих запасов реагентов, правила хранения наборов и реагентов, отчетность по результатам контроля, программы обучения персонала, алгоритмы устранения неполадок и корректирующие действия при необходимости.
6. Библиография
Аслан А., Кинзельман Дж., Дрилин Э., Ананьева Т., Лавандер Дж. Глава 3: Создание лаборатории для проведения ПЦР в реальном времени. Руководство по тестированию рекреационных водоемов с использованием метода 1611 ПЦР в реальном времени Агентства по охране окружающей среды США. Лансинг – Мичиганский государственный университет.
Общественное здравоохранение Англии, Национальная служба здравоохранения. Британские стандарты микробиологических исследований: Надлежащая лабораторная практика при проведении анализов молекулярной амплификации). Руководство по качеству. 2013;4(4):1–15.
Миффлин Т. Создание ПЦР-лаборатории. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шредер С. 2013. Плановое техническое обслуживание центрифуг: очистка, обслуживание и дезинфекция центрифуг, роторов и адаптеров (Белая книга № 14). Гамбург: Эппендорф; 2013.
Виана Р.В., Уоллис К.Л. Надлежащая клиническая лабораторная практика (GCLP) для молекулярных тестов, используемых в диагностических лабораториях. В: Акяр И., редактор. Широкий спектр контроля качества. Риека, Хорватия: Intech; 2011: 29–52.
Дата публикации: 16 июля 2020 г.
