Методи молекулярної детекції здатні виробляти великий об'єм нуклеїнової кислоти шляхом ампліфікації слідових кількостей, знайдених у зразках. Хоча це корисно для забезпечення чутливого виявлення, це також створює можливість забруднення через поширення аерозолів ампліфікації в лабораторному середовищі. Під час проведення експериментів можна вжити заходів, щоб уникнути забруднення реагентів, лабораторного обладнання та робочого простору, оскільки таке забруднення може призвести до хибнопозитивних (або хибнонегативних) результатів.
Щоб зменшити ймовірність забруднення, слід завжди дотримуватися належної лабораторної практики. Зокрема, слід вживати запобіжних заходів щодо наступних пунктів:
1. Поводження з реагентами
2. Організація робочого простору та обладнання
3. Поради щодо використання та очищення для визначеного молекулярного простору
4. Загальні поради з молекулярної біології
5. Внутрішній контроль
6. Бібліографія
1. Поводження з реагентами
Перед відкриттям коротко центрифугуйте пробірки з реагентами, щоб уникнути утворення аерозолів. Розділіть реагенти на аліквоти, щоб уникнути багаторазового заморожування-розморожування та забруднення основних розчинів. Чітко маркуйте та датуйте всі пробірки з реагентами та реакціями, а також ведіть журнали номерів партій та партій реагентів, що використовувалися у всіх експериментах. Піпетуйте всі реагенти та зразки, використовуючи фільтруючі наконечники. Перед покупкою бажано уточнити у виробника, чи підходять фільтруючі наконечники до марки піпетки, яка буде використовуватися.
2. Організація робочого простору та обладнання
Робочий простір слід організувати таким чином, щоб забезпечити потік робіт в одному напрямку, від чистих зон (до ПЛР) до брудних зон (після ПЛР). Наступні загальні запобіжні заходи допоможуть зменшити ймовірність забруднення. Мати окремі спеціально відведені кімнати або, принаймні, фізично окремі зони для: приготування мастерміксу, екстракції нуклеїнових кислот та додавання ДНК-матриці, ампліфікації та обробки ампліфікованого продукту, а також аналізу продукту, наприклад, гель-електрофорезу.
У деяких умовах наявність 4 окремих кімнат є складною. Можливим, але менш бажаним варіантом є приготування мастерміксу в зоні ізоляції, наприклад, у ламінарній шафі. У випадку гніздової ПЛР-ампліфікації, приготування мастерміксу для другого раунду реакції слід проводити в «чистій» зоні для приготування мастерміксу, але інокуляцію первинним продуктом ПЛР слід проводити в кімнаті для ампліфікації, і, якщо можливо, у спеціально відведеній зоні ізоляції (наприклад, у ламінарній шафі).
Для кожної кімнати/зони потрібен окремий набір чітко маркованих піпеток, наконечників з фільтрами, стійок для пробірок, вортексів, центрифуг (за потреби), ручок, універсальних лабораторних реактивів, лабораторних халатів та коробок з рукавичками, які залишатимуться на відповідних робочих місцях. Руки необхідно мити, а рукавички та лабораторні халати міняти під час переміщення між відведеними зонами. Реактиви та обладнання не слід переміщувати з брудної зони до чистої. У разі виникнення крайнього випадку, коли реактив або обладнання необхідно перемістити назад, його спочатку необхідно деконтамінувати 10% розчином гіпохлориту натрію, а потім протерти стерильною водою.
Примітка
10% розчин гіпохлориту натрію необхідно готувати свіжим щодня. При використанні для дезактивації слід дотримуватися мінімального часу контакту 10 хвилин.
Як альтернатива, можна використовувати комерційно доступні продукти, валідовані як засоби для дезактивації поверхонь, що руйнують ДНК, якщо місцеві рекомендації щодо безпеки не дозволяють використання гіпохлориту натрію або якщо гіпохлорит натрію не підходить для дезактивації металевих частин обладнання.
В ідеалі, персонал повинен дотримуватися принципу односпрямованого робочого процесу та не повертатися з брудних зон (після ПЛР) назад до чистих зон (до ПЛР) того ж дня. Однак можуть бути випадки, коли цього не уникнути. Коли виникає така ситуація, персонал повинен ретельно мити руки, міняти рукавички, використовувати призначений лабораторний халат і не приносити з собою жодного обладнання, яке він захоче винести з кімнати знову, наприклад, лабораторні книги. Такі заходи контролю слід підкреслювати під час навчання персоналу молекулярним методам.
Після використання робочі поверхні слід очистити 10% розчином гіпохлориту натрію (а потім стерильною водою для видалення залишків відбілювача), 70% етанолом або валідованим комерційно доступним дезактивуючим засобом, що руйнує ДНК. В ідеалі слід встановити ультрафіолетові (УФ) лампи для забезпечення дезактивації шляхом опромінення. Однак використання УФ-ламп слід обмежувати закритими робочими зонами, наприклад, захисними шафами, щоб обмежити вплив УФ-випромінювання на персонал лабораторії. Будь ласка, дотримуйтесь інструкцій виробника щодо догляду за УФ-лампами, вентиляції та очищення, щоб забезпечити їхню ефективність.
Якщо замість гіпохлориту натрію використовується 70% етанол, для завершення деконтамінації знадобиться опромінення ультрафіолетовим світлом.
Не очищуйте вортекс та центрифугу гіпохлоритом натрію; натомість протріть 70% етанолом та піддайте впливу ультрафіолетового випромінювання або використовуйте комерційний деконтамінант, що руйнує ДНК. У разі розливу зверніться до виробника за подальшими порадами щодо очищення. Якщо інструкції виробника дозволяють, піпетки слід регулярно стерилізувати в автоклаві. Якщо піпетки не можна автоклавувати, достатньо очистити їх 10% гіпохлоритом натрію (з подальшим ретельним протиранням стерильною водою) або комерційним деконтамінантом, що руйнує ДНК, з подальшим впливом ультрафіолетового випромінювання.
Очищення високовідсотковим гіпохлоритом натрію може зрештою пошкодити пластик та метал піпеток, якщо його проводити регулярно; спочатку перевірте рекомендації виробника. Усе обладнання необхідно регулярно калібрувати відповідно до графіка, рекомендованого виробником. Призначена особа повинна відповідати за дотримання графіка калібрування, ведення детальних журналів та чітке розміщення сервісних етикеток на обладнанні.
3. Поради щодо використання та очищення для визначеного молекулярного простору
Перед ПЛР: Аліквотування реагентів / підготовка мастерміксу: Це має бути найчистіше місце з усіх, що використовуються для підготовки молекулярних експериментів, і в ідеалі це має бути спеціально відведена ламінарна шафа, обладнана УФ-лампою. Зразки, екстрагована нуклеїнова кислота та ампліфіковані продукти ПЛР не повинні оброблятися в цій зоні. Ампліфікаційні реагенти слід зберігати в морозильній камері (або холодильнику, згідно з рекомендаціями виробника) в тому ж відведеному місці, в ідеалі поруч із ламінарною шафою або зоною перед ПЛР. Рукавички слід міняти щоразу після входу в зону перед ПЛР або ламінарну шафу.
Зону перед ПЛР або ламінарний кабінет слід очистити до та після використання наступним чином: протріть усі предмети в кабінеті, наприклад, піпетки, коробки для наконечників, вортекс, центрифугу, штативи для пробірок, ручки тощо 70% етанолом або комерційним деконтамінантом, що руйнує ДНК, та дайте висохнути. У випадку закритої робочої зони, наприклад, ламінарного кабінету, піддайте витяжку впливу ультрафіолетового світла протягом 30 хвилин.
Примітка
Не піддавайте реагенти впливу ультрафіолетового випромінювання; переміщуйте їх у шафу лише після того, як вона очиститься. Якщо ви проводите ПЛР зі зворотною транскрипцією, також може бути корисним протерти поверхні та обладнання розчином, який розщеплює РНКази при контакті. Це може допомогти уникнути хибнонегативних результатів від ферментативної деградації РНК. Після деконтамінації та перед приготуванням мастерміксу рукавички слід ще раз змінити, і тоді шафа готова до використання.
Попередня ПЛР: Екстракція нуклеїнових кислот/додавання шаблону:
Нуклеїнову кислоту необхідно екстрагувати та обробляти в другій відведеній зоні, використовуючи окремий набір піпеток, наконечників з фільтрами, стійок для пробірок, свіжих рукавичок, лабораторних халатів та іншого обладнання. Ця зона також призначена для додавання шаблону, контролів та ліній тренду до пробірок або планшетів з мастерміксом. Щоб уникнути забруднення екстрагованих зразків нуклеїнових кислот, що аналізуються, рекомендується міняти рукавички перед роботою з позитивними контролями або стандартами та використовувати окремий набір піпеток. ПЛР-реагенти та ампліфіковані продукти не можна піпетувати в цій зоні. Зразки слід зберігати у відведених холодильниках або морозильних камерах у тій самій зоні. Робочий простір для зразків слід очищати так само, як і простір для мастерміксу.
Після ПЛР: Ампліфікація та обробка ампліфікованого продукту
Цей спеціально відведений простір призначений для процесів після ампліфікації та має бути фізично відокремленим від зон перед ПЛР. Зазвичай він містить термоциклери та платформи реального часу, а в ідеалі має мати ламінарну шафу для додавання продукту ПЛР першого раунду до реакції другого раунду, якщо виконується вкладена ПЛР. ПЛР-реагенти та екстрагована нуклеїнова кислота не повинні використовуватися в цій зоні, оскільки ризик зараження високий. Ця зона повинна мати окремий комплект рукавичок, лабораторних халатів, стійок для планшетів та пробірок, піпеток, наконечників з фільтрами, контейнерів та іншого обладнання. Пробірки необхідно центрифугувати перед відкриттям. Робочий простір для зразків слід очищати так само, як і простір для мастерміксу.
Після ПЛР: аналіз продукту
Ця кімната призначена для обладнання для виявлення продукту, наприклад, резервуарів для гель-електрофорезу, блоків живлення, УФ-трансілюмінатора та системи документування гелю. У цій зоні повинні бути окремі комплекти рукавичок, лабораторних халатів, стійок для планшетів та пробірок, піпеток, наконечників з фільтрами, контейнерів та іншого обладнання. У цю зону не можна приносити жодних інших реагентів, окрім завантажувального барвника, молекулярного маркера та агарозного гелю, а також компонентів буфера. Робочий простір для зразків слід очищати так само, як і простір для мастерміксу.
Важливе зауваження
В ідеалі, не слід заходити до кімнат перед ПЛР того ж дня, якщо робота вже була виконана в кімнатах після ПЛР. Якщо цього абсолютно неможливо уникнути, переконайтеся, що спочатку ретельно вимиті руки та одягнені спеціальні лабораторні халати в кімнатах. Лабораторні журнали та документи не можна проносити до кімнат перед ПЛР, якщо вони використовувалися в кімнатах після ПЛР; за необхідності зробіть дублікати роздруківок протоколів/ідентифікаційних номерів зразків тощо.
4. Загальні поради з молекулярної біології
Використовуйте рукавички без пудри, щоб уникнути пригнічення аналізу. Правильна техніка піпетування має вирішальне значення для зменшення забруднення. Неправильне піпетування може призвести до розбризкування під час дозування рідин та утворення аерозолів. Рекомендації щодо правильного піпетування можна знайти за такими посиланнями: посібник Gilson з піпетування, відео з техніки піпетування Anachem, центрифугуйте пробірки перед відкриттям та обережно відкривайте їх, щоб уникнути розбризкування. Закривайте пробірки одразу після використання, щоб уникнути потрапляння забруднюючих речовин.
Під час проведення кількох реакцій готуйте одну головну суміш, що містить поширені реагенти (наприклад, воду, dNTP, буфер, праймери та фермент), щоб мінімізувати кількість перенесення реагентів та зменшити ризик забруднення. Рекомендується розмішувати головну суміш на льоду або холодному блоці. Використання ферменту Hot Start може допомогти зменшити утворення неспецифічних продуктів. Захищайте реагенти, що містять флуоресцентні зонди, від світла, щоб уникнути деградації.
5. Внутрішній контроль
Включіть добре охарактеризовані, підтверджені позитивні та негативні контролі, а також контроль без шаблону у всіх реакціях та багатоточкову титровану лінію тренду для кількісних реакцій. Позитивний контроль не повинен бути настільки сильним, щоб створювати ризик контамінації. Включіть позитивні та негативні контролі екстракції під час екстракції нуклеїнових кислот.
Рекомендується розмістити чіткі інструкції в кожній із зон, щоб користувачі були обізнані з правилами поведінки. Діагностичні лабораторії, які виявляють дуже низькі рівні ДНК або РНК у клінічних зразках, можуть вжити додаткових заходів безпеки, встановивши окремі системи обробки повітря зі злегка позитивним тиском повітря в кімнатах до ПЛР та злегка негативним тиском повітря в кімнатах після ПЛР.
Зрештою, корисною є розробка плану забезпечення якості (ЗЯ). Такий план повинен включати переліки основних та робочих запасів реагентів, правила зберігання наборів та реагентів, звітність про результати контролю, програми навчання персоналу, алгоритми усунення несправностей та коригувальні дії за потреби.
6. Бібліографія
Аслан А., Кінзельман Дж., Дрілін Е., Ананьєва Т., Лавандер Дж. Розділ 3: Створення лабораторії qPCR. Керівництво з тестування рекреаційних вод за допомогою методу qPCR USEPA 1611. Лансінг – Університет штату Мічиган.
Громадське здоров'я Англії, Національна служба охорони здоров'я. Стандарти Великої Британії для мікробіологічних досліджень: Належна лабораторна практика при проведенні аналізів молекулярної ампліфікації. Керівництво з якості. 2013;4(4):1–15.
Міффлін Т. Створення ПЛР-лабораторії. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шредер С. 2013. Планове обслуговування центрифуг: очищення, обслуговування та дезінфекція центрифуг, роторів та адаптерів (Біла книга № 14). Гамбург: Еппендорф; 2013.
Віана Р.В., Уолліс К.Л. Належна клінічна лабораторна практика (GCLP) для молекулярних тестів, що використовуються в діагностичних лабораторіях, У кн.: Акяр І., редактор. Широкий спектр контролю якості. Рієка, Хорватія: Intech; 2011: 29–52.
Час публікації: 16 липня 2020 р.
