Metody detekcji molekularnej pozwalają na uzyskanie dużej objętości kwasu nukleinowego poprzez amplifikację śladowych ilości obecnych w próbkach. Chociaż jest to korzystne dla zapewnienia czułej detekcji, stwarza również ryzyko skażenia poprzez rozprzestrzenianie się aerozoli amplifikacyjnych w środowisku laboratoryjnym. Podczas przeprowadzania eksperymentów można podjąć działania mające na celu uniknięcie skażenia odczynników, sprzętu laboratoryjnego i powierzchni stołu laboratoryjnego, ponieważ takie zanieczyszczenie może generować wyniki fałszywie dodatnie (lub fałszywie ujemne).
Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo skażenia, należy zawsze stosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. W szczególności należy podjąć środki ostrożności w następujących kwestiach:
1. Postępowanie z odczynnikami
2. Organizacja miejsca pracy i sprzętu
3. Wskazówki dotyczące użytkowania i czyszczenia wyznaczonej przestrzeni molekularnej
4. Ogólne porady dotyczące biologii molekularnej
5. Kontrola wewnętrzna
6. Bibliografia
1. Postępowanie z odczynnikami
Przed otwarciem krótko odwiruj probówki z odczynnikami, aby uniknąć tworzenia się aerozoli. Odczynniki należy podzielić na alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania oraz zanieczyszczenia roztworów wzorcowych. Wyraźnie opisz i opatrz datą wszystkie probówki z odczynnikami i reakcjami oraz prowadź dziennik numerów partii i serii odczynników użytych we wszystkich eksperymentach. Pipetuj wszystkie odczynniki i próbki za pomocą końcówek z filtrem. Przed zakupem zaleca się sprawdzenie u producenta, czy końcówki z filtrem pasują do używanej pipety.
2. Organizacja miejsca pracy i sprzętu
Przestrzeń robocza powinna być zorganizowana w taki sposób, aby zapewnić jednokierunkowy przepływ pracy – od stref czystych (przed PCR) do stref brudnych (po PCR). Poniższe ogólne środki ostrożności pomogą zmniejszyć ryzyko skażenia. Należy wyznaczyć oddzielne pomieszczenia, a co najmniej fizycznie oddzielić obszary, do: przygotowywania mastermiksu, ekstrakcji kwasów nukleinowych i dodawania matryc DNA, amplifikacji i postępowania z amplifikowanym produktem oraz analizy produktu, np. elektroforezy żelowej.
W niektórych przypadkach posiadanie czterech oddzielnych pomieszczeń jest trudne. Możliwą, ale mniej pożądaną opcją jest przygotowanie mastermiksu w pomieszczeniu zamkniętym, np. w komorze laminarnej. W przypadku amplifikacji PCR z zagnieżdżonym przepływem, przygotowanie mastermiksu do drugiej rundy reakcji powinno odbywać się w „czystej” strefie przeznaczonej do przygotowania mastermiksu, natomiast inokulację pierwotnym produktem PCR należy przeprowadzić w pomieszczeniu amplifikacji, a jeśli to możliwe, w wydzielonym pomieszczeniu zamkniętym (np. w komorze laminarnej).
Każde pomieszczenie/obszar wymaga osobnego zestawu wyraźnie oznakowanych pipet, końcówek filtracyjnych, stojaków na probówki, wirówek, wirówek (jeśli dotyczy), długopisów, uniwersalnych odczynników laboratoryjnych, fartuchów laboratoryjnych i pudełek rękawiczek, które pozostaną na stanowiskach pracy. Przechodząc między wyznaczonymi obszarami, należy umyć ręce oraz zmienić rękawiczki i fartuchy laboratoryjne. Odczynników i sprzętu nie należy przenosić z obszaru brudnego do czystego. W skrajnym przypadku, gdy odczynnik lub sprzęt trzeba cofnąć, należy go najpierw zdezynfekować 10% roztworem podchlorynu sodu, a następnie przetrzeć sterylną wodą.
Notatka
10% roztwór podchlorynu sodu należy codziennie uzupełniać. Podczas dekontaminacji należy przestrzegać minimalnego czasu kontaktu wynoszącego 10 minut.
Alternatywnie, jeśli lokalne zalecenia bezpieczeństwa nie zezwalają na stosowanie podchlorynu sodu lub jeśli podchloryn sodu nie nadaje się do dekontaminacji metalowych części urządzeń, można zastosować komercyjnie dostępne produkty o potwierdzonej zdolności do niszczenia DNA.
W idealnym przypadku personel powinien przestrzegać zasady jednokierunkowego przepływu pracy i nie przechodzić z obszarów brudnych (po PCR) z powrotem do obszarów czystych (przed PCR) tego samego dnia. Mogą jednak zdarzyć się sytuacje, gdy jest to nieuniknione. W takiej sytuacji personel musi zadbać o dokładne umycie rąk, zmianę rękawiczek, użycie wyznaczonego fartucha laboratoryjnego i niewnoszenie ze sobą sprzętu, który będzie chciał ponownie zabrać z pomieszczenia, takiego jak zeszyty laboratoryjne. Takie środki kontroli powinny być podkreślane podczas szkoleń personelu z zakresu metod molekularnych.
Po użyciu, stanowiska laboratoryjne należy oczyścić 10% roztworem podchlorynu sodu (a następnie wodą sterylną w celu usunięcia resztek wybielacza), 70% roztworem etanolu lub zatwierdzonym, dostępnym w handlu środkiem odkażającym niszczącym DNA. Najlepiej zainstalować lampy ultrafioletowe (UV), aby umożliwić dekontaminację poprzez napromieniowanie. Należy jednak ograniczyć stosowanie lamp UV do zamkniętych pomieszczeń roboczych, np. szaf bezpieczeństwa, aby ograniczyć narażenie personelu laboratoryjnego na promieniowanie UV. Należy przestrzegać instrukcji producenta dotyczących konserwacji, wentylacji i czyszczenia lamp UV, aby zapewnić ich skuteczność.
Jeżeli zamiast podchlorynu sodu stosuje się etanol 70%, w celu dokończenia dekontaminacji konieczne będzie naświetlanie światłem UV.
Nie czyścić wirówki ani wirówki podchlorynem sodu; zamiast tego należy przetrzeć ją 70% roztworem etanolu i wystawić na działanie promieniowania UV lub użyć komercyjnego środka odkażającego niszczącego DNA. W przypadku rozlania, należy skonsultować się z producentem w celu uzyskania dalszych wskazówek dotyczących czyszczenia. Jeśli instrukcja producenta na to zezwala, pipety należy rutynowo sterylizować w autoklawie. Jeśli pipety nie nadają się do autoklawowania, wystarczy je oczyścić 10% roztworem podchlorynu sodu (a następnie dokładnie przetrzeć sterylną wodą) lub komercyjnym środkiem odkażającym niszczącym DNA, a następnie wystawić na działanie promieniowania UV.
Regularne czyszczenie podchlorynem sodu o wysokim stężeniu może ostatecznie uszkodzić plastikowe i metalowe elementy pipety; należy najpierw sprawdzić zalecenia producenta. Wszystkie urządzenia należy regularnie kalibrować zgodnie z harmonogramem zalecanym przez producenta. Wyznaczona osoba powinna być odpowiedzialna za przestrzeganie harmonogramu kalibracji, prowadzenie szczegółowych rejestrów oraz wyraźne umieszczenie etykiet serwisowych na sprzęcie.
3. Wskazówki dotyczące użytkowania i czyszczenia wyznaczonej przestrzeni molekularnej
Pre-PCR: Podział odczynników na alikwoty/przygotowanie mastermiksu: Powinno to być najczystsze ze wszystkich pomieszczeń wykorzystywanych do przygotowywania eksperymentów molekularnych, a najlepiej, aby była to przeznaczona do tego komora laminarna wyposażona w lampę UV. Próbki, wyekstrahowany kwas nukleinowy i amplifikowane produkty PCR nie mogą być przechowywane w tym miejscu. Odczynniki do amplifikacji należy przechowywać w zamrażarce (lub lodówce, zgodnie z zaleceniami producenta) w tym samym wyznaczonym pomieszczeniu, najlepiej obok komory laminarnej lub strefy pre-PCR. Rękawiczki należy zmieniać po każdym wejściu do strefy pre-PCR lub komory laminarnej.
Strefę przed PCR lub komorę laminarną należy czyścić przed i po użyciu w następujący sposób: Przetrzeć wszystkie przedmioty w komorze, np. pipety, pojemniki na końcówki, wirówkę, wirówkę, stojaki na probówki, peny itp. 70% etanolem lub komercyjnym środkiem dezynfekującym niszczącym DNA i pozostawić do wyschnięcia. W przypadku zamkniętej przestrzeni roboczej, np. komory laminarnej, wystawić okap na działanie światła UV przez 30 minut.
Notatka
Nie wystawiaj odczynników na działanie światła UV; przenieś je do szafki dopiero po jej wyczyszczeniu. Podczas przeprowadzania reakcji PCR z odwrotną transkrypcją pomocne może być również przetarcie powierzchni i sprzętu roztworem, który rozkłada RNazy w kontakcie. Może to pomóc uniknąć wyników fałszywie ujemnych spowodowanych degradacją RNA przez enzymy. Po dekontaminacji i przed przygotowaniem mastermiksu należy ponownie zmienić rękawiczki, a szafka jest gotowa do użycia.
Pre-PCR: Ekstrakcja kwasu nukleinowego/dodanie matrycy:
Ekstrakcję i przetwarzanie kwasu nukleinowego należy wykonywać w drugim, wyznaczonym obszarze, używając oddzielnego zestawu pipet, końcówek filtracyjnych, stojaków na probówki, świeżych rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i innego sprzętu. Obszar ten jest również przeznaczony do dodawania matryc, kontroli i linii trendu do probówek lub płytek z mieszaniną główną. Aby uniknąć zanieczyszczenia analizowanych próbek wyekstrahowanych kwasów nukleinowych, zaleca się zmianę rękawiczek przed kontaktem z kontrolami dodatnimi lub standardami oraz użycie oddzielnego zestawu pipet. Odczynników PCR i produktów amplifikacji nie wolno pipetować w tym obszarze. Próbki należy przechowywać w wyznaczonych lodówkach lub zamrażarkach w tym samym obszarze. Przestrzeń robocza z próbkami powinna być czyszczona w taki sam sposób, jak przestrzeń z mieszaniną główną.
Post-PCR: amplifikacja i postępowanie z amplifikowanym produktem
Ta wyznaczona przestrzeń jest przeznaczona do procesów poamplifikacyjnych i powinna być fizycznie oddzielona od obszarów przed PCR. Zazwyczaj znajdują się w niej termocyklery i platformy do PCR w czasie rzeczywistym, a idealnie powinna być wyposażona w komorę z przepływem laminarnym do dodawania produktu PCR rundy 1 do reakcji rundy 2, jeśli wykonywana jest zagnieżdżona reakcja PCR. Odczynniki PCR i wyekstrahowany kwas nukleinowy nie mogą być używane w tej przestrzeni ze względu na wysokie ryzyko zanieczyszczenia. W tej przestrzeni powinny znajdować się oddzielne rękawiczki, fartuchy laboratoryjne, stojaki na płytki i probówki, pipety, końcówki filtracyjne, pojemniki i inny sprzęt. Probówki należy odwirować przed otwarciem. Przestrzeń robocza z próbkami powinna być czyszczona w taki sam sposób, jak przestrzeń z mieszaniną główną.
Post-PCR: Analiza produktu
To pomieszczenie przeznaczone jest na sprzęt do detekcji produktów, np. zbiorniki do elektroforezy żelowej, zasilacze, transiluminator UV i system dokumentacji żelu. W tym pomieszczeniu powinny znajdować się oddzielne komplety rękawiczek, fartuchy laboratoryjne, stojaki na płytki i probówki, pipety, końcówki filtracyjne, pojemniki i inny sprzęt. Do tego pomieszczenia nie wolno wnosić żadnych innych odczynników, z wyjątkiem barwnika do załadunku, markera molekularnego i żelu agarozowego oraz składników buforu. Przestrzeń robocza z próbkami powinna być czyszczona w taki sam sposób, jak przestrzeń mastermixu.
Ważna uwaga
W idealnym przypadku nie należy wchodzić do pomieszczeń przed PCR tego samego dnia, jeśli w pomieszczeniach po PCR wykonano już wcześniej jakieś prace. Jeśli jest to całkowicie nieuniknione, należy najpierw dokładnie umyć ręce i nosić specjalne fartuchy laboratoryjne. Do pomieszczeń przed PCR nie wolno wnosić dzienników laboratoryjnych ani dokumentacji, jeśli były używane w pomieszczeniach po PCR; w razie potrzeby należy zabrać ze sobą duplikaty protokołów/identyfikatorów próbek itp.
4. Ogólne porady dotyczące biologii molekularnej
Używaj rękawiczek bezpudrowych, aby uniknąć zahamowania testu. Prawidłowa technika pipetowania ma kluczowe znaczenie dla ograniczenia zanieczyszczeń. Nieprawidłowe pipetowanie może prowadzić do rozpryskiwania podczas dozowania cieczy i tworzenia aerozoli. Dobre praktyki dotyczące prawidłowego pipetowania można znaleźć pod następującymi linkami: poradnik Gilson dotyczący pipetowania, filmy instruktażowe dotyczące techniki pipetowania firmy Anachem, probówki wirówkowe przed otwarciem i otwieraj je ostrożnie, aby uniknąć rozpryskiwania. Zamknij probówki natychmiast po użyciu, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń.
Podczas przeprowadzania wielu reakcji, należy przygotować jedną mieszaninę główną zawierającą wspólne odczynniki (np. wodę, dNTP, bufor, startery i enzym), aby zminimalizować liczbę transferów odczynników i zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Zaleca się przechowywanie mieszaniny głównej na lodzie lub bloku chłodzącym. Użycie enzymu Hot Start może pomóc w zmniejszeniu wytwarzania produktów niespecyficznych. Należy chronić odczynniki zawierające sondy fluorescencyjne przed światłem, aby uniknąć degradacji.
5. Kontrola wewnętrzna
Należy uwzględnić dobrze scharakteryzowane, potwierdzone kontrole pozytywne i negatywne, a także kontrolę bez matrycy we wszystkich reakcjach oraz wielopunktową miareczkowaną linię trendu dla reakcji ilościowych. Kontrola pozytywna nie powinna być na tyle silna, aby stwarzać ryzyko zanieczyszczenia. Należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne ekstrakcji podczas przeprowadzania ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Zaleca się umieszczenie w każdym z tych obszarów czytelnych instrukcji, aby użytkownicy byli świadomi zasad postępowania. Laboratoria diagnostyczne wykrywające bardzo niskie poziomy DNA lub RNA w próbkach klinicznych mogą rozważyć zastosowanie dodatkowych środków bezpieczeństwa w postaci oddzielnych systemów wentylacji z lekko dodatnim ciśnieniem powietrza w pomieszczeniach przed PCR i lekko ujemnym ciśnieniem powietrza w pomieszczeniach po PCR.
Wreszcie, pomocne jest opracowanie planu zapewnienia jakości (QA). Taki plan powinien zawierać listy zapasów głównych i roboczych odczynników, zasady przechowywania zestawów i odczynników, raportowanie wyników kontroli, programy szkoleń personelu, algorytmy rozwiązywania problemów oraz działania naprawcze w razie potrzeby.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Rozdział 3: Organizacja laboratorium qPCR. Dokument z wytycznymi dotyczącymi badania wód rekreacyjnych metodą qPCR USEPA 1611. Lansing – Michigan State University.
Public Health England, NHS. Brytyjskie standardy badań mikrobiologicznych: Dobra Praktyka Laboratoryjna przy wykonywaniu badań amplifikacji molekularnej. Wskazówki dotyczące jakości. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Utworzenie laboratorium PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutynowa konserwacja wirówek: czyszczenie, konserwacja i dezynfekcja wirówek, wirników i adapterów (Biała księga nr 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dobra Praktyka Laboratoryjna Kliniczna (GCLP) dla badań molekularnych stosowanych w laboratoriach diagnostycznych, W: Akyar I, red. Szerokie spektrum kontroli jakości. Rijeka, Chorwacja: Intech; 2011: 29–52.
Czas publikacji: 16 lipca 2020 r.
