Molekulārās noteikšanas metodes spēj radīt lielu nukleīnskābju daudzumu, amplifikējot paraugos atrodamos mikrodaļiņas. Lai gan tas ir noderīgi jutīgas noteikšanas nodrošināšanai, tas rada arī piesārņojuma iespēju, izplatoties amplifikācijas aerosoliem laboratorijas vidē. Veicot eksperimentus, var veikt pasākumus, lai izvairītos no reaģentu, laboratorijas aprīkojuma un darba virsmas piesārņojuma, jo šāds piesārņojums var radīt kļūdaini pozitīvus (vai kļūdaini negatīvus) rezultātus.
Lai samazinātu piesārņojuma iespējamību, vienmēr jāievēro laba laboratorijas prakse. Jo īpaši jāievēro piesardzības pasākumi attiecībā uz šādiem punktiem:
1. Reaģentu apstrāde
2. Darba vietas un aprīkojuma organizēšana
3. Lietošanas un tīrīšanas ieteikumi paredzētajai molekulārajai telpai
4. Vispārīgi molekulārās bioloģijas padomi
5. Iekšējās kontroles mehānismi
6. Bibliogrāfija
1. Reaģentu apstrāde
Pirms atvēršanas reaģentu mēģenes īsi centrifugējiet, lai izvairītos no aerosolu veidošanās. Sadaliet reaģentus alikvotās daļās, lai izvairītos no vairākkārtējas sasaldēšanas un atkausēšanas, kā arī pamatmateriālu piesārņošanas. Skaidri marķējiet un datējiet visas reaģentu un reakcijas mēģenes, kā arī uzturiet žurnālus par reaģentu partijas un sērijas numuriem, kas izmantoti visos eksperimentos. Pipetējiet visus reaģentus un paraugus, izmantojot filtra uzgaļus. Pirms iegādes ieteicams apstiprināt ar ražotāju, ka filtra uzgaļi atbilst izmantojamās pipetes zīmolam.
2. Darba vietas un aprīkojuma organizēšana
Darba vieta jāorganizē tā, lai nodrošinātu darba plūsmu vienā virzienā — no tīrām zonām (pirms PCR) uz netīrām zonām (pēc PCR). Turpmāk norādītie vispārīgie piesardzības pasākumi palīdzēs samazināt piesārņojuma iespējamību. Jānodrošina atsevišķas telpas vai vismaz fiziski atdalītas zonas: galvenā maisījuma sagatavošanai, nukleīnskābju ekstrakcijai un DNS matricas pievienošanai, amplifikācijai un amplificētā produkta apstrādei, kā arī produkta analīzei, piemēram, gēla elektroforēzei.
Dažos apstākļos ir grūti atrasties 4 atsevišķās telpās. Iespējama, bet mazāk vēlama iespēja ir veikt galvenā maisījuma sagatavošanu izolācijas zonā, piemēram, laminārās plūsmas skapī. Ligzdotas PCR amplifikācijas gadījumā galvenā maisījuma sagatavošana otrās kārtas reakcijai jāveic galvenā maisījuma sagatavošanas "tīrā" zonā, bet inokulācija ar primāro PCR produktu jāveic amplifikācijas telpā un, ja iespējams, speciāli tam paredzētā izolācijas zonā (piemēram, laminārās plūsmas skapī).
Katrai telpai/zonai ir nepieciešams atsevišķs skaidri marķētu pipešu, filtru uzgaļu, mēģenu statīvu, virpuļmaisītāju, centrifūgu (ja piemērojams), pildspalvu, vispārīgu laboratorijas reaģentu, laboratorijas halātu un cimdu kastu komplekts, kas jāatstāj attiecīgajās darba vietās. Pārvietojoties starp norādītajām zonām, rokas ir jāmazgā, bet cimdi un laboratorijas halāti ir jāmaina. Reaģentus un aprīkojumu nedrīkst pārvietot no netīras zonas uz tīru zonu. Ārkārtējā gadījumā, ja reaģents vai aprīkojums ir jāpārvieto atpakaļ, tas vispirms ir jādezinficē ar 10% nātrija hipohlorītu un pēc tam jānoslauka ar sterilu ūdeni.
Piezīme
10% nātrija hipohlorīta šķīdums ir jāpagatavo katru dienu svaigs. Lietojot dekontaminācijai, jāievēro minimālais saskares laiks 10 minūtes.
Alternatīvi, ja vietējie drošības ieteikumi neļauj lietot nātrija hipohlorītu vai ja nātrija hipohlorīts nav piemērots iekārtu metāla daļu dekontaminācijai, var izmantot komerciāli pieejamus produktus, kas ir apstiprināti kā DNS iznīcinoši virsmu dekontaminācijas līdzekļi.
Ideālā gadījumā darbiniekiem jāievēro vienvirziena darba plūsmas ētika un nevajadzētu atgriezties no netīrām zonām (pēc PCR) uz tīrām zonām (pirms PCR) tajā pašā dienā. Tomēr var būt gadījumi, kad tas nav iespējams. Šādā gadījumā personālam rūpīgi jānomazgā rokas, jānomaina cimdi, jāizmanto paredzētais laboratorijas halāts un neienest aprīkojumu, ko viņi vēlēsies atkal iznest no telpas, piemēram, laboratorijas grāmatas. Šādi kontroles pasākumi būtu jāuzsver personāla apmācībā par molekulārajām metodēm.
Pēc lietošanas darba virsmas jātīra ar 10 % nātrija hipohlorītu (pēc tam noskalojot ar sterilu ūdeni, lai noņemtu atlikušo balinātāju), 70 % etanolu vai validētu, komerciāli pieejamu DNS iznīcinošu dekontaminantu. Ideālā gadījumā jāuzstāda ultravioletās (UV) lampas, lai nodrošinātu dekontamināciju ar apstarošanu. Tomēr UV lampu lietošana jāierobežo slēgtās darba zonās, piemēram, drošības skapjos, lai ierobežotu laboratorijas personāla pakļaušanu UV starojumam. Lūdzu, ievērojiet ražotāja norādījumus par UV lampu kopšanu, ventilāciju un tīrīšanu, lai nodrošinātu lampu efektivitāti.
Ja nātrija hipohlorīta vietā tiek izmantots 70 % etanols, dekontaminācijas pabeigšanai būs nepieciešama apstarošana ar UV gaismu.
Netīriet virpuli un centrifūgu ar nātrija hipohlorītu; tā vietā noslaukiet ar 70% etanolu un pakļaujiet UV gaismai vai izmantojiet komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminantu. Ja izlijis šķidrums, sazinieties ar ražotāju, lai saņemtu papildu tīrīšanas padomus. Ja ražotāja norādījumi to atļauj, pipetes regulāri jāsterilizē autoklāvā. Ja pipetes nevar autoklāvēt, pietiek ar to tīrīšanu ar 10% nātrija hipohlorītu (pēc tam rūpīgi noslaukot ar sterilu ūdeni) vai ar komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminantu un pēc tam pakļaujot UV gaismai.
Regulāra tīrīšana ar augsta nātrija hipohlorīta procentuālo daudzumu var sabojāt pipešu plastmasu un metālu; vispirms pārbaudiet ražotāja ieteikumus. Viss aprīkojums ir regulāri jākalibrē saskaņā ar ražotāja ieteikto grafiku. Norīkotai personai jābūt atbildīgai par kalibrēšanas grafika ievērošanu, detalizētu žurnālu uzturēšanu un servisa uzlīmju skaidru novietošanu uz aprīkojuma.
3. Lietošanas un tīrīšanas ieteikumi paredzētajai molekulārajai telpai
Pirms PCR: Reaģentu alikvotēšana/mastermiksa sagatavošana: Šai jābūt tīrākajai no visām telpām, ko izmanto molekulāro eksperimentu sagatavošanai, un ideālā gadījumā tai jābūt speciāli paredzētai laminārās plūsmas skapim, kas aprīkots ar UV gaismu. Šajā zonā nedrīkst rīkoties ar paraugiem, ekstrahētām nukleīnskābēm un amplificētiem PCR produktiem. Amplifikācijas reaģenti jāuzglabā saldētavā (vai ledusskapī, saskaņā ar ražotāja ieteikumiem) tajā pašā paredzētajā telpā, ideālā gadījumā blakus laminārās plūsmas skapim vai pirms-PCR zonai. Cimdi jāmaina katru reizi, ieejot pirms-PCR zonā vai laminārās plūsmas skapī.
Pirms-PCR zona vai laminārās plūsmas skapis pirms un pēc lietošanas jātīra šādi: noslaukiet visus skapī esošos priekšmetus, piemēram, pipetes, uzgaļu kastītes, vorteksu, centrifūgu, mēģenu statīvus, pildspalvas utt. ar 70% etanolu vai komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminantu un ļaujiet nožūt. Slēgtas darba zonas, piemēram, laminārās plūsmas skapja, gadījumā pakļaujiet pārsegu UV gaismai 30 minūtes.
Piezīme
Nepakļaujiet reaģentus UV gaismai; pārvietojiet tos skapī tikai tad, kad tas ir tīrs. Veicot reversās transkripcijas PCR, var būt noderīgi arī noslaucīt virsmas un aprīkojumu ar šķīdumu, kas saskarē noārda RNāzes. Tas var palīdzēt izvairīties no viltus negatīviem rezultātiem, ko izraisa RNS enzīmu degradācija. Pēc dekontaminācijas un pirms galvenā maisījuma sagatavošanas cimdi vēlreiz jānomaina, un tad skapis ir gatavs lietošanai.
Pirms PCR: Nukleīnskābju ekstrakcija/matricas pievienošana:
Nukleīnskābe ir jāekstrahē un jāapstrādā citā, tam paredzētā vietā, izmantojot atsevišķu pipešu, filtru uzgaļu, mēģenu statīvu, tīrus cimdus, laboratorijas halātus un citu aprīkojumu. Šī vieta ir paredzēta arī veidnes, kontroļu un tendenču līniju pievienošanai galvenā maisījuma mēģenēm vai plāksnēm. Lai izvairītos no analizējamo ekstrahēto nukleīnskābju paraugu piesārņošanas, pirms pozitīvo kontroļu vai standartu apstrādes ieteicams nomainīt cimdus un izmantot atsevišķu pipešu komplektu. PCR reaģentus un amplificētos produktus nedrīkst pipetēt šajā vietā. Paraugi jāuzglabā tam paredzētos ledusskapjos vai saldētavās tajā pašā vietā. Parauga darba vieta jātīra tāpat kā galvenā maisījuma telpa.
Pēc PCR: amplifikācija un amplificētā produkta apstrāde
Šī paredzētā telpa ir paredzēta procesiem pēc amplifikācijas, un tai jābūt fiziski atdalītai no zonām, kas paredzētas procesiem pirms PCR. Tajā parasti atrodas termocikleri un reāllaika platformas, un ideālā gadījumā tajā jābūt laminārās plūsmas skapim 1. kārtas PCR produkta pievienošanai 2. kārtas reakcijai, ja tiek veikta ligzdota PCR. Šajā zonā nedrīkst rīkoties ar PCR reaģentiem un ekstrahēto nukleīnskābi, jo pastāv augsts piesārņojuma risks. Šajā zonā jābūt atsevišķam cimdu, laboratorijas halātu, plākšņu un mēģenīšu plauktu, pipešu, filtru uzgaļu, tvertņu un cita aprīkojuma komplektam. Mēģenes pirms atvēršanas ir jācentrifugē. Parauga darba vieta jātīra tāpat kā mastermiksa telpa.
Pēc PCR: produkta analīze
Šī telpa ir paredzēta produktu noteikšanas aprīkojumam, piemēram, gēla elektroforēzes tvertnēm, barošanas blokiem, UV transilluminatoram un gēla dokumentācijas sistēmai. Šajā zonā jābūt atsevišķiem cimdu komplektiem, laboratorijas halātiem, plākšņu un mēģenīšu statīviem, pipetēm, filtru uzgaļiem, tvertnēm un citam aprīkojumam. Šajā zonā nedrīkst ienest citus reaģentus, izņemot iekraušanas krāsvielu, molekulāro marķieri un agarozes gēlu, kā arī bufera komponentus. Parauga darba vieta jātīra tāpat kā mastermiksa telpa.
Svarīga piezīme
Ideālā gadījumā pirms-PCR telpās nevajadzētu ieiet tajā pašā dienā, ja darbs jau ir veikts pēc-PCR telpās. Ja tas ir pilnībā neizbēgami, vispirms rūpīgi jānomazgā rokas un telpās jāvalkā speciāli laboratorijas halāti. Laboratorijas grāmatas un dokumentus nedrīkst ienest pirms-PCR telpās, ja tie ir izmantoti pēc-PCR telpās; ja nepieciešams, jāizveido protokolu/paraugu ID u. c. izdruku kopijas.
4. Vispārīgi molekulārās bioloģijas padomi
Lai izvairītos no testa inhibīcijas, izmantojiet cimdus bez pūdera. Pareiza pipetēšanas tehnika ir ārkārtīgi svarīga piesārņojuma samazināšanai. Nepareiza pipetēšana var izraisīt šļakatas, izsniedzot šķidrumus, un aerosolu veidošanos. Labu pareizas pipetēšanas praksi var atrast šajās saitēs: Gilsona pipetēšanas rokasgrāmata, Anachem pipetēšanas tehnikas video, Centrifūgas mēģenes pirms atvēršanas un atveriet tās uzmanīgi, lai izvairītos no šļakatām. Pēc lietošanas mēģenes nekavējoties aizveriet, lai izvairītos no piesārņotāju iekļūšanas.
Veicot vairākas reakcijas, sagatavojiet vienu galveno maisījumu, kas satur bieži sastopamus reaģentus (piemēram, ūdeni, dNTP, buferšķīdumu, praimerus un enzīmu), lai samazinātu reaģentu pārneses skaitu un samazinātu piesārņojuma risku. Galvenais maisījums ieteicams sagatavot uz ledus vai aukstā bloka. Karstās palaišanas enzīma izmantošana var palīdzēt samazināt nespecifisku produktu ražošanu. Lai izvairītos no degradācijas, aizsargājiet reaģentus, kas satur fluorescējošas zondes, no gaismas.
5. Iekšējās kontroles mehānismi
Visās reakcijās iekļaujiet labi raksturotas, apstiprinātas pozitīvas un negatīvas kontroles, kā arī kontroli bez matricas un kvantitatīvām reakcijām — daudzpunktu titrētu tendences līkni. Pozitīvajai kontrolei nevajadzētu būt tik spēcīgai, lai radītu piesārņojuma risku. Veicot nukleīnskābju ekstrakciju, iekļaujiet pozitīvas un negatīvas ekstrakcijas kontroles.
Ieteicams katrā zonā izvietot skaidrus norādījumus, lai lietotāji būtu informēti par rīcības noteikumiem. Diagnostikas laboratorijām, kas klīniskajos paraugos atklāj ļoti zemu DNS vai RNS līmeni, ieteicams ieviest papildu drošības pasākumu, proti, atsevišķas gaisa apstrādes sistēmas ar nedaudz pozitīvu gaisa spiedienu telpās pirms PCR un nedaudz negatīvu gaisa spiedienu telpās pēc PCR.
Visbeidzot, ir noderīgi izstrādāt kvalitātes nodrošināšanas (QA) plānu. Šādā plānā jāiekļauj reaģentu pamatkrājumu un darba krājumu saraksti, komplektu un reaģentu uzglabāšanas noteikumi, kontroles rezultātu ziņošana, personāla apmācības programmas, problēmu novēršanas algoritmi un nepieciešamības gadījumā veicamās korektīvas darbības.
6. Bibliogrāfija
Aslans A., Kinzelmans Dž., Drīlins E., Ananeva T., Lavanders Dž. 3. nodaļa: qPCR laboratorijas izveide. Vadlīnijas atpūtas ūdeņu testēšanai, izmantojot USEPA qPCR metodi 1611. Lansingas-Mičiganas štata universitāte.
Anglijas Sabiedrības veselības dienests, Nacionālais veselības dienests (NHS). Apvienotās Karalistes standarti mikrobioloģijas izmeklējumiem: Laba laboratorijas prakse, veicot molekulārās amplifikācijas testus. Kvalitātes vadlīnijas. 2013;4(4):1–15.
Miflins T. PCR laboratorijas izveide. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Centrifūgu regulāra apkope: centrifūgu, rotoru un adapteru tīrīšana, apkope un dezinfekcija (Baltā grāmata Nr. 14). Hamburga: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Laba klīniskā laboratorijas prakse (GCLP) molekulāriem testiem, ko izmanto diagnostikas laboratorijās. In: Akyar I, red. Plašs kvalitātes kontroles spektrs. Rijeka, Horvātija: Intech; 2011: 29–52.
Publicēšanas laiks: 2020. gada 16. jūlijs
